Analisi delle risposte delle cellule T CD4 specifiche dell'HBV e identificazione degli epitopi delle cellule T CD4 con restrizioni HLA-DR basati su una matrice peptidica
Summary
Sulla base di una matrice peptidica derivata dal virus dell’epatite B (HBV), le risposte delle cellule T CD4 specifiche dell’HBV potrebbero essere valutate in parallelo con l’identificazione di epitopi di cellule T CD4 specifiche per HBV.
Abstract
Le cellule T CD4 svolgono un ruolo importante nella patogenesi dell’epatite B cronica. Come popolazione cellulare versatile, le cellule T CD4 sono state classificate come sottoinsiemi funzionali distinti in base alle citochine che hanno secreto: ad esempio, IFN-γ per le cellule CD4 T helper 1, IL-4 e IL-13 per le cellule CD4 T helper 2, IL-21 per le cellule helper follicolari CD4 T e IL-17 per le cellule CD4 T helper 17. L’analisi delle cellule T CD4 specifiche del virus dell’epatite B (HBV) sulla base della secrezione di citochine dopo la stimolazione dei peptidi derivati dall’HBV potrebbe fornire informazioni non solo sull’entità della risposta delle cellule T CD4 specifiche dell’HBV, ma anche sui sottoinsiemi funzionali delle cellule T CD4 specifiche dell’HBV. Nuovi approcci, come la trascrittomica e l’analisi metabolomica, potrebbero fornire informazioni funzionali più dettagliate sulle cellule T CD4 specifiche dell’HBV. Questi approcci di solito richiedono l’isolamento di cellule T CD4 vitali specifiche per HBV basate su multimeri del complesso II di istocompatibilità peptidico-maggiore, mentre attualmente le informazioni sugli epitopi delle cellule T CD4 specifiche per HBV sono limitate. Sulla base di una matrice peptidica derivata dall’HBV, è stato sviluppato un metodo per valutare le risposte delle cellule T CD4 specifiche per l’HBV e identificare gli epitopi delle cellule T CD4 specifici dell’HBV utilizzando contemporaneamente campioni di cellule mononucleate del sangue periferico da pazienti con infezione cronica da HBV.
Introduction
Attualmente, ci sono 3 approcci principali per analizzare le cellule T antigene-specifiche. Il primo approccio si basa sull’interazione tra il recettore delle cellule T e il peptide (epitopo). Le cellule T antigene-specifiche potrebbero essere direttamente colorate con multimeri del complesso di istocompatibilità peptidico maggiore (MHC). Il vantaggio di questo metodo è che potrebbe ottenere cellule T antigene-specifiche vitali, adatte per l’analisi trascrittomica/metabolomica a valle. Una limitazione di questo metodo è che non potrebbe fornire informazioni sull’intera risposta delle cellule T a un antigene specifico, in quanto richiede peptidi epitopi convalidati mentre il numero di epitopi identificati per un antigene specifico è limitato per ora. Rispetto agli epitopi delle cellule T CD8 specifici del virus dell’epatite B (HBV), sono stati identificati meno epitopi delle cellule T CD4 specifici dell’HBV1,2,il che ha reso questo metodo meno applicabile per l’analisi delle cellule T CD4 specifiche dell’HBV attualmente.
Il secondo approccio si basa sulla sovraregolazione di una serie di marcatori indotti dall’attivazione dopo stimolazione peptidica antigenica3. I marcatori comunemente usati includono CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. Questo metodo è stato ora utilizzato per analizzare le risposte antigene-specifiche delle cellule T in individui vaccinati5,6, pazienticon infezione da virus dell’immunodeficienza umana 7 epazienticon infezione da sindrome respiratoria acuta grave da Coronavirus2 8,9. A differenza del test basato su multimeri peptidi-MHC, questo metodo non è limitato da epitopi convalidati e potrebbe ottenere cellule vitali per l’analisi a valle. Una limitazione di questo metodo è che non è stato in grado di fornire informazioni sul profilo delle citochine delle cellule T antigene-specifiche. Inoltre, l’espressione di questi marcatori indotti dall’attivazione da parte di alcune cellule non specifiche dell’antigene attivato potrebbe contribuire ai segnali di fondo in analisi, il che potrebbe essere un problema soprattutto quando le cellule T antigene-specifiche target sono rare. Attualmente, c’è un’applicazione limitata di questo metodo sulle cellule T CD4 specifiche per HBV4. Se questo metodo possa essere utilizzato per analizzare le cellule T CD4 specifiche dell’HBV in modo affidabile richiede ulteriori indagini.
Il terzo approccio si basa sulla secrezione di citochine dopo la stimolazione del peptide antigenico. Come l’analisi basata su marcatori indotta dall’attivazione, questo metodo non è limitato da epitopi convalidati. Questo metodo potrebbe rivelare direttamente il profilo delle citochine delle cellule T antigene-specifiche. La sensibilità di questo metodo è inferiore al metodo basato su marcatori indotti dall’attivazione in quanto si basa sulla secrezione di citochine di cellule T antigene-specifiche e il numero di citochine testate è solitamente limitato. Attualmente, questo metodo è ampiamente utilizzato nell’analisi delle cellule T HBV-specifiche. Poiché le cellule T hbV-specifiche secernenti citochine difficilmente potrebbero essere rilevate mediante stimolazione peptidica diretta ex vivo10,11,il profilo delle citochine delle cellule T HBV-specifiche viene solitamente analizzato dopo 10 giorni di espansione stimolata dal peptide in vitro12,13,14,15,16. La disposizione dei pool peptidici in forma di matrice è stata utilizzata per facilitare l’identificazione degli epitopi antigene-specifici17,18. Con la combinazione di matrice peptidica e analisi della secrezione di citochine, è stato sviluppato un metodo per valutare le risposte delle cellule T CD4 specifiche per HBV e identificare contemporaneamente gli epitopi delle cellule T CD4 specifici dell’HBV16. In questo protocollo, vengono descritti i dettagli di questo metodo. L’antigene centrale HBV viene scelto come esempio di dimostrazione in questo protocollo.
Protocol
Representative Results
Discussion
I passaggi più critici in questo protocollo sono elencati come segue: 1) abbastanza PBMC di alta redditività per avviare l’espansione dei PBMC; 2) ambiente appropriato per l’espansione dei PBMC; e 3) rimozione completa dei pool peptidici residui nella coltura di PBMC prima dell’identificazione dell’epitopo.
Tutte le analisi in questo protocollo dipendono dalla robusta proliferazione delle cellule T CD4. In generale, il numero di PBMC dopo l’espansione di 10 giorni sarà 2-3 volte superiore a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla National Natural Science Foundation of China (81930061), dalla Chongqing Natural Science Foundation (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) e dalla Chinese Key
Progetto Specializzato in Malattie Infettive (2018ZX10723203).
Materials
| Albumin Bovine V (BSA) | Beyotime | ST023 | |
| APC-conjugated Anti-human TNF-α | eBioscience | 17-7349-82 | Keep protected from light |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Limit cell clumping |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09126 | HLA-DRB1*0803 homozygote |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09121 | HLA-DRB1*1202 homozygote |
| Cell Culture Flask (T75) | Corning | 430641 | |
| Cell Culture Plate (96-well, flat bottom) | Corning | 3599 | Flat bottom |
| Cell Culture Plate (96-well, round bottom) | Corning | 3799 | Round bottom |
| Cell Strainer | Corning | CLS431751 | Pore size 70 μm, white, sterile |
| Centrifuge Tube (15 mL) | KIRGEN | KG2611 | Sterile |
| Centrifuge Tube (50 mL) | Corning | 430829 | Sterile |
| Centrifuge, Refrigerated | Eppendorf | 5804R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | ST16R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | Legend Micro 21R | |
| Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) | BD Biosciences | 562574 | Prepare solution before use |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Keep at room temperature to prevent crystallization |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Prepare ddH2O (1000 ml) containing NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), and Na2HPO4.7H2O (2160 mg). Adjust PH to 7.4. Sterilize through autoclave. | ||
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Filter Tips (0.5-10) | Kirgen | KG5131 | Sterile |
| Filter Tips (100-1000) | Kirgen | KG5333 | Sterile |
| Filter Tips (1-200) | Kirgen | KG5233 | Sterile |
| FITC-conjugated Anti-human CD4 | BioLegend | 300506 | Keep protected from light |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | eBioscience | 65-0865-14 | Keep protected from light |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | Protein Transport Inhibitor |
| Haemocytometer | Brand | 718620 | |
| HBV Core Antigen Derived Peptides | ChinaPeptides | ||
| HEPES | Gibco | 15630080 | 100 ml |
| Human Serum AB | Gemini Bio-Products | 100-51 | 100 ml |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| KCl | Sangon Biotech | A100395-0500 | |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A100781-0500 | |
| LSRFortessa Flow Cytometer | BD | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | 100 ml |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Corning | MCT-150-C | Autoclaved sterilization before using |
| Microplate Shakers | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sangon Biotech | A100348-0500 | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241-0500 | |
| PCR Tubes (0.2 mL) | Kirgen | KG2331 | |
| PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 | BioLegend | 300914 | Keep protected from light |
| PE-conjugated Anti-human IFN-γ | eBioscience | 12-7319-42 | Keep protected from light |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | 100 ml |
| PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 | eBioscience | 45-0037-42 | Keep protected from light |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Recombinant Human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | C11875500BT | 500 ml |
| Sodium pyruvate,100mM | Gibco | 15360070 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR | BioLegend | 307648 | |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 |
References
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