ניתוח תגובות תאי T HBV ספציפיות ל- CD4 וזיהוי של Epitopes תאי T מוגבלים HLA-DR-CD4 המבוססים על מטריצת פפטיד
Summary
בהתבסס על מטריצת פפטיד שמקורה בוירוס הפטיטיס B (HBV), ניתן להעריך תגובות תאי T ספציפיים ל- CD4 HBV במקביל לזיהוי אפיטופים ספציפיים ל- CD4 T.
Abstract
תאי CD4 T ממלאים תפקידים חשובים בפתוגנזה של הפטיטיס B כרונית. כאוכלוסיית תאים רב-תכליתית, תאי CD4 T סווגו כתת-קבוצות תפקודיות מובחנות בהתבסס על הציטוקינים שהם מפרישים: לדוגמה, IFN-γ עבור תאי עוזר CD4 T 1, IL-4 ו- IL-13 עבור תאי עוזר CD4 T 2, IL-21 עבור תאי עוזר זקיקי CD4 T, ו- IL-17 עבור תאי עוזר CD4 T 17. ניתוח של נגיף הפטיטיס B (HBV)-ספציפי CD4 T תאים המבוססים על הפרשת ציטוקינים לאחר גירוי פפטידים נגזר HBV יכול לספק מידע לא רק על הגודל של HBV ספציפי CD4 T-cell תגובה, אלא גם על תת קבוצות פונקציונליות של תאי CD4 T ספציפיים ל- HBV. גישות חדשניות, כגון ניתוח תמלול ומטבולומיה, יכולות לספק מידע פונקציונלי מפורט יותר על תאי CD4 T ספציפיים ל- HBV. גישות אלה דורשות בדרך כלל בידוד של תאי CD4 T ספציפיים ל- HBV המבוססים על ריבוי ריבוי היסטופלים של היסטו-II, בעוד שכרגע המידע על אפיטופים ספציפיים ל- CD4 T-cell מוגבל. בהתבסס על מטריצת פפטיד שמקורה ב- HBV, פותחה שיטה להערכת תגובות תאי T CD4 ספציפיות ל- HBV ולזיהוי אפיטופים ספציפיים ל- CD4 T-cell בו זמנית באמצעות דגימות תאים חד-גרעיניים בדם היקפיים מחולי זיהום HBV כרוניים.
Introduction
נכון לעכשיו, ישנן 3 גישות עיקריות לנתח תאי T ספציפיים אנטיגן. הגישה הראשונה מבוססת על האינטראקציה בין קולטן תא ה- T לפפטיד (אפיטופ). תאי T ספציפיים לאנטיגן יכולים להיות מוכתמים ישירות עם ריבוי קומפלקס היסטו-תאימות (MHC) גדול פפטיד. היתרון של שיטה זו הוא שהיא יכולה להשיג תאי T ספציפיים אנטיגן קיימא, מתאים לניתוח תמלול במורד הזרם / מטבולומיה. מגבלה של שיטה זו היא כי זה לא יכול לספק מידע על התגובה כולה של תא T אנטיגן מסוים, כפי שהוא דורש פפטידים epitope מאומת בעוד מספר אפיטופים מזוהים עבור אנטיגן מסוים מוגבל לעת עתה. בהשוואה לנגיף הפטיטיס B (HBV)-ספציפי CD8 T-cell epitopes, פחות אפיטופים ספציפיים HBV CD4 T-cell זוהו1,2, מה שהפך שיטה זו פחות ישימה לניתוח של תאי CD4 T ספציפיים ל- HBV כיום.
הגישה השנייה מבוססת על upregulation של סדרה של סמנים המושרה הפעלה לאחר גירוי פפטיד אנטיגן3. הסמנים הנפוצים כוללים CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. שיטה זו שימשה כעת לניתוח תגובות תאי T ספציפיים אנטיגן אצל אנשים מחוסנים5,6, זיהום וירוס חיסוני אנושיחולים 7, ותסמונת נשימה חריפה חמורה קורונה 2 חולי זיהום8,9. שלא כמו הבדיקה המבוססת על ריבוי פפטיד-MHC, שיטה זו אינה מוגבלת על ידי אפיטופים מאומתים ויכולה להשיג תאים ברי קיימא לניתוח במורד הזרם. מגבלה של שיטה זו היא כי זה לא יכול לספק מידע על פרופיל ציטוקינים של תאי T ספציפי אנטיגן. כמו כן, הביטוי של סמנים אלה המושרה הפעלה על ידי כמה תאים אנטיגן-ספציפיים מופעלים עשוי לתרום אותות הרקע בניתוח, אשר יכול להיות בעיה במיוחד כאשר תאי T אנטיגן ספציפיים היעד הם נדירים. נכון לעכשיו, קיים יישום מוגבל של שיטה זו בתאי CD4 T ספציפיים ל- HBV4. השאלה אם ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לנתח תאי CD4 T ספציפיים ל- HBV באופן אמין זקוקה לחקירה נוספת.
הגישה השלישית מבוססת על הפרשת הציטוקינים לאחר גירוי פפטיד אנטיגן. בדומה לניתוח מבוסס סמן המושרה על-ידי הפעלה, שיטה זו אינה מוגבלת על-ידי אפיטופים מאומתים. שיטה זו יכולה לחשוף ישירות את פרופיל הציטוקינים של תאי T ספציפיים לאנטיגן. הרגישות של שיטה זו נמוכה יותר מאשר השיטה מבוססת סמן המושרה הפעלה כפי שהוא מסתמך על הפרשת ציטוקינים של תאי T ספציפיים אנטיגן ומספר ציטוקינים נבדק מוגבל בדרך כלל. נכון לעכשיו, שיטה זו נמצאת בשימוש נרחב בניתוח של תאי T ספציפיים ל- HBV. כמו ציטוקינים הפרשת תאי T ספציפיים HBV בקושי ניתן לזהות על ידי גירוי פפטיד ex vivo ישיר10,11, פרופיל ציטוקינים של תאי T ספציפיים HBV מנותח בדרך כלל לאחר 10 ימים במבחנה פפטיד מגורההרחבה 12,13,14,15,16. סידור של בריכות פפטיד בצורת מטריצה נוצל כדי להקל על זיהוי של אפיטופים ספציפיים אנטיגן17,18. עם השילוב של מטריצת פפטיד וניתוח הפרשת ציטוקינים, פותחה שיטה להערכת תגובות תאי T ספציפיים ל- CD4 HBV ולזיהוי אפיטופים ספציפיים ל- CD4 T-cell בו זמנית16. בפרוטוקול זה, הפרטים של שיטה זו מתוארים. אנטיגן הליבה HBV נבחר כדוגמה של הדגמה בפרוטוקול זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה מפורטים באופן הבא: 1) מספיק מחשבי PBMCs בעלי כדאיות גבוהה כדי להתחיל הרחבת מחשבים אישיים; 2) סביבה מתאימה להרחבת מחשבים אישיים; ו -3) הסרה מלאה של שאריות בריכות פפטיד בתרבות PBMCs לפני זיהוי אפיטופ.
כל הניתוח בפרוטוקול זה תלוי בשגשוג החזק של תאי CD4 T…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81930061), הקרן למדעי הטבע צ’ונגצ’ינג (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) ומפתח סיני
פרויקט מתמחה במחלות זיהומיות (2018ZX10723203).
Materials
| Albumin Bovine V (BSA) | Beyotime | ST023 | |
| APC-conjugated Anti-human TNF-α | eBioscience | 17-7349-82 | Keep protected from light |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Limit cell clumping |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09126 | HLA-DRB1*0803 homozygote |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09121 | HLA-DRB1*1202 homozygote |
| Cell Culture Flask (T75) | Corning | 430641 | |
| Cell Culture Plate (96-well, flat bottom) | Corning | 3599 | Flat bottom |
| Cell Culture Plate (96-well, round bottom) | Corning | 3799 | Round bottom |
| Cell Strainer | Corning | CLS431751 | Pore size 70 μm, white, sterile |
| Centrifuge Tube (15 mL) | KIRGEN | KG2611 | Sterile |
| Centrifuge Tube (50 mL) | Corning | 430829 | Sterile |
| Centrifuge, Refrigerated | Eppendorf | 5804R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | ST16R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | Legend Micro 21R | |
| Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) | BD Biosciences | 562574 | Prepare solution before use |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Keep at room temperature to prevent crystallization |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Prepare ddH2O (1000 ml) containing NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), and Na2HPO4.7H2O (2160 mg). Adjust PH to 7.4. Sterilize through autoclave. | ||
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Filter Tips (0.5-10) | Kirgen | KG5131 | Sterile |
| Filter Tips (100-1000) | Kirgen | KG5333 | Sterile |
| Filter Tips (1-200) | Kirgen | KG5233 | Sterile |
| FITC-conjugated Anti-human CD4 | BioLegend | 300506 | Keep protected from light |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | eBioscience | 65-0865-14 | Keep protected from light |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | Protein Transport Inhibitor |
| Haemocytometer | Brand | 718620 | |
| HBV Core Antigen Derived Peptides | ChinaPeptides | ||
| HEPES | Gibco | 15630080 | 100 ml |
| Human Serum AB | Gemini Bio-Products | 100-51 | 100 ml |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| KCl | Sangon Biotech | A100395-0500 | |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A100781-0500 | |
| LSRFortessa Flow Cytometer | BD | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | 100 ml |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Corning | MCT-150-C | Autoclaved sterilization before using |
| Microplate Shakers | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sangon Biotech | A100348-0500 | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241-0500 | |
| PCR Tubes (0.2 mL) | Kirgen | KG2331 | |
| PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 | BioLegend | 300914 | Keep protected from light |
| PE-conjugated Anti-human IFN-γ | eBioscience | 12-7319-42 | Keep protected from light |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | 100 ml |
| PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 | eBioscience | 45-0037-42 | Keep protected from light |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Recombinant Human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | C11875500BT | 500 ml |
| Sodium pyruvate,100mM | Gibco | 15360070 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR | BioLegend | 307648 | |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 |
References
- Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
- Mizukoshi, E., et al. Cellular immune responses to the hepatitis B virus polymerase. Journal of Immunology. 173, 5863-5871 (2004).
- Wölfl, M., Kuball, J., Eyrich, M., Schlegel, P. G., Greenberg, P. D. Use of CD137 to study the full repertoire of CD8+ T cells without the need to know epitope specificities. Cytometry Part A. 73, 1043-1049 (2008).
- Reiss, S., et al. Comparative analysis of activation induced marker (AIM) assays for sensitive identification of antigen-specific CD4 T cells. PLoS One. 12, 0186998 (2017).
- Herati, R. S., et al. Successive annual influenza vaccination induces a recurrent oligoclonotypic memory response in circulating T follicular helper cells. Science Immunology. 2, (2017).
- Bowyer, G., et al. Activation-induced Markers Detect Vaccine-Specific CD4+ T Cell Responses Not Measured by Assays Conventionally Used in Clinical Trials. Vaccines. 6, (2018).
- Morou, A., et al. Altered differentiation is central to HIV-specific CD4(+) T cell dysfunction in progressive disease. Nature Immunology. 20, 1059-1070 (2019).
- Grifoni, A., et al. Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals. Cell. 181, 1489-1501 (2020).
- Meckiff, B. J., et al. Imbalance of Regulatory and Cytotoxic SARS-CoV-2-Reactive CD4+ T Cells in COVID-19. Cell. , (2020).
- Boni, C., et al. Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection. Journal of Virology. 81, 4215-4225 (2007).
- Chang, J. J., et al. Reduced hepatitis B virus (HBV)-specific CD4+ T-cell responses in human immunodeficiency virus type 1-HBV-coinfected individuals receiving HBV-active antiretroviral therapy. Journal of Virology. 79, 3038-3051 (2005).
- Boni, C., et al. Restored Function of HBV-Specific T Cells After Long-term Effective Therapy With Nucleos(t)ide Analogues. Gastroenterology. 143, 963-973 (2012).
- Kennedy, P. T., et al. Preserved T-cell function in children and young adults with immune-tolerant chronic hepatitis B. Gastroenterology. 143, 637-645 (2012).
- de Niet, A., et al. Restoration of T cell function in chronic hepatitis B patients upon treatment with interferon based combination therapy. Journal of Hepatology. 64, 539-546 (2016).
- Rinker, F., et al. Hepatitis B virus-specific T cell responses after stopping nucleos(t)ide analogue therapy in HBeAg-negative chronic hepatitis B. Journal of Hepatology. 69, 584-593 (2018).
- Wang, H., et al. TNF-α/IFN-γ profile of HBV-specific CD4 T cells is associated with liver damage and viral clearance in chronic HBV infection. Journal of Hepatology. 72, 45-56 (2020).
- Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
- Anthony, D. D., Lehmann, P. V. T-cell epitope mapping using the ELISPOT approach. Methods. 29, 260-269 (2003).
