Analyse des réponses des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB et identification des épitopes des lymphocytes T CD4 restreints par HLA-DR sur la base d’une matrice peptidique
Summary
Sur la base d’une matrice peptidique dérivée du virus de l’hépatite B (VHB), les réponses des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB ont pu être évaluées parallèlement à l’identification des épitopes des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB.
Abstract
Les lymphocytes T CD4 jouent un rôle important dans la pathogenèse de l’hépatite B chronique. En tant que population cellulaire polyvalente, les lymphocytes T CD4 ont été classés comme des sous-ensembles fonctionnels distincts en fonction des cytokines qu’ils ont sécrétées : par exemple, IFN-γ pour les lymphocytes T helper 1 CD4, IL-4 et IL-13 pour les cellules CD4 T helper 2, IL-21 pour les cellules folliculaires CD4 T helper et IL-17 pour les cellules CD4 T helper 17. L’analyse des lymphocytes T CD4 spécifiques du virus de l’hépatite B (VHB) basée sur la sécrétion de cytokines après la stimulation des peptides dérivés du VHB pourrait fournir des informations non seulement sur l’ampleur de la réponse des lymphocytes T CD4 spécifiques au VHB, mais également sur les sous-ensembles fonctionnels des lymphocytes T CD4 spécifiques au VHB. De nouvelles approches, telles que la transcriptomique et l’analyse métabolomique, pourraient fournir des informations fonctionnelles plus détaillées sur les lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB. Ces approches nécessitent généralement l’isolement de lymphocytes T CD4 viables spécifiques du VHB à partir de multimères du complexe d’histocompatibilité majeur du peptide II, alors qu’actuellement les informations sur les épitopes des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB sont limitées. Sur la base d’une matrice peptidique dérivée du VHB, une méthode a été mise au point pour évaluer les réponses des lymphocytes T CD4 spécifiques au VHB et identifier simultanément les épitopes des lymphocytes T CD4 spécifiques au VHB à l’aide d’échantillons de cellules mononucléaires du sang périphérique provenant de patients atteints d’une infection chronique par le VHB.
Introduction
Actuellement, il existe 3 approches principales pour analyser les lymphocytes T spécifiques de l’antigène. La première approche est basée sur l’interaction entre le récepteur des lymphocytes T et le peptide (épitope). Les lymphocytes T spécifiques de l’antigène pourraient être directement colorés avec des multimères du complexe d’histocompatibilité peptide-majeur (CMH). L’avantage de cette méthode est qu’elle pourrait obtenir des lymphocytes T viables spécifiques à l’antigène, adaptés à l’analyse transcriptomique/métabolomique en aval. Une limitation de cette méthode est qu’elle ne pourrait pas fournir d’informations sur l’ensemble de la réponse des lymphocytes T à un antigène spécifique, car elle nécessite des peptides d’épitope validés alors que le nombre d’épitopes identifiés pour un antigène spécifique est limité pour l’instant. Par rapport aux épitopes des lymphocytes T CD8 spécifiques du virus de l’hépatite B (VHB), moins d’épitopes des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB ont été identifiés1,2, ce qui rend cette méthode moins applicable à l’analyse des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB actuellement.
La seconde approche est basée sur la régulation à la hausse d’une série de marqueurs induits par l’activation après stimulation peptidique antigénique3. Les marqueurs couramment utilisés comprennent CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. Cette méthode a maintenant été utilisée pour analyser les réponses des lymphocytes T spécifiques à l’antigène chez les personnes vaccinées5,6,les patients infectés par le virus de l’immunodéficience humaine7et les patients infectés par le coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère2 8,9. Contrairement au test basé sur les multimères peptide-CMH, cette méthode n’est pas limitée par des épitopes validés et pourrait obtenir des cellules viables pour l’analyse en aval. Une limitation de cette méthode est qu’elle ne pouvait pas fournir d’informations sur le profil des cytokines des lymphocytes T spécifiques de l’antigène. En outre, l’expression de ces marqueurs induits par l’activation par certaines cellules non spécifiques de l’antigène activé pourrait contribuer aux signaux de fond dans l’analyse, ce qui pourrait être un problème, en particulier lorsque les cellules T spécifiques de l’antigène cible sont rares. Actuellement, l’application de cette méthode sur les lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB 4 estlimité. La question de savoir si cette méthode pourrait être utilisée pour analyser de manière fiable les lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB doit faire l’objet d’une étude plus approfondie.
La troisième approche est basée sur la sécrétion de cytokines après stimulation peptidique de l’antigène. Comme l’analyse basée sur des marqueurs induits par l’activation, cette méthode n’est pas limitée par des épitopes validés. Cette méthode pourrait révéler directement le profil cytokine des lymphocytes T spécifiques de l’antigène. La sensibilité de cette méthode est inférieure à la méthode basée sur des marqueurs induits par l’activation car elle repose sur la sécrétion de cytokines de lymphocytes T spécifiques de l’antigène et le nombre de cytokines testées est généralement limité. Actuellement, cette méthode est largement utilisée dans l’analyse des lymphocytes T spécifiques du VHB. Comme les lymphocytes T spécifiques du VHB sécrétant des cytokines, il était difficile de détecter par stimulation peptidique ex vivo directe10,11, le profil cytokine des lymphocytes T spécifiques du VHB est généralement analysé après une expansion stimulée par peptide in vitro de 10 jours12,13,14,15,16. La disposition des pools de peptides sous forme de matrice a été utilisée pour faciliter l’identification des épitopes spécifiques de l’antigène17,18. Avec la combinaison de l’analyse de la matrice peptidique et de la sécrétion de cytokines, une méthode a été développée pour évaluer simultanément les réponses des lymphocytes T CD4 spécifiques du VHB et identifier simultanément les épitopes des lymphocytes T CD4 spécifiques au VHB16. Dans ce protocole, les détails de cette méthode sont décrits. L’antigène central du VHB est choisi comme exemple de démonstration dans ce protocole.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes les plus critiques de ce protocole sont énumérées comme suit : 1) suffisamment de PBCC de haute viabilité pour démarrer l’expansion des PBMC ; 2) un environnement approprié pour l’expansion des PBMC; et 3) l’élimination complète des pools de peptides résiduels dans la culture de PBMC avant l’identification de l’épitope.
Toutes les analyses de ce protocole dépendent de la prolifération robuste des lymphocytes T CD4. En général, le nombre de PBCC après une ex…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (81930061), la Chongqing Natural Science Foundation (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) et Chinese Key
Projet spécialisé dans les maladies infectieuses (2018ZX10723203).
Materials
| Albumin Bovine V (BSA) | Beyotime | ST023 | |
| APC-conjugated Anti-human TNF-α | eBioscience | 17-7349-82 | Keep protected from light |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Limit cell clumping |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09126 | HLA-DRB1*0803 homozygote |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09121 | HLA-DRB1*1202 homozygote |
| Cell Culture Flask (T75) | Corning | 430641 | |
| Cell Culture Plate (96-well, flat bottom) | Corning | 3599 | Flat bottom |
| Cell Culture Plate (96-well, round bottom) | Corning | 3799 | Round bottom |
| Cell Strainer | Corning | CLS431751 | Pore size 70 μm, white, sterile |
| Centrifuge Tube (15 mL) | KIRGEN | KG2611 | Sterile |
| Centrifuge Tube (50 mL) | Corning | 430829 | Sterile |
| Centrifuge, Refrigerated | Eppendorf | 5804R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | ST16R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | Legend Micro 21R | |
| Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) | BD Biosciences | 562574 | Prepare solution before use |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Keep at room temperature to prevent crystallization |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Prepare ddH2O (1000 ml) containing NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), and Na2HPO4.7H2O (2160 mg). Adjust PH to 7.4. Sterilize through autoclave. | ||
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Filter Tips (0.5-10) | Kirgen | KG5131 | Sterile |
| Filter Tips (100-1000) | Kirgen | KG5333 | Sterile |
| Filter Tips (1-200) | Kirgen | KG5233 | Sterile |
| FITC-conjugated Anti-human CD4 | BioLegend | 300506 | Keep protected from light |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | eBioscience | 65-0865-14 | Keep protected from light |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | Protein Transport Inhibitor |
| Haemocytometer | Brand | 718620 | |
| HBV Core Antigen Derived Peptides | ChinaPeptides | ||
| HEPES | Gibco | 15630080 | 100 ml |
| Human Serum AB | Gemini Bio-Products | 100-51 | 100 ml |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| KCl | Sangon Biotech | A100395-0500 | |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A100781-0500 | |
| LSRFortessa Flow Cytometer | BD | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | 100 ml |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Corning | MCT-150-C | Autoclaved sterilization before using |
| Microplate Shakers | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sangon Biotech | A100348-0500 | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241-0500 | |
| PCR Tubes (0.2 mL) | Kirgen | KG2331 | |
| PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 | BioLegend | 300914 | Keep protected from light |
| PE-conjugated Anti-human IFN-γ | eBioscience | 12-7319-42 | Keep protected from light |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | 100 ml |
| PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 | eBioscience | 45-0037-42 | Keep protected from light |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Recombinant Human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | C11875500BT | 500 ml |
| Sodium pyruvate,100mM | Gibco | 15360070 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR | BioLegend | 307648 | |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 |
References
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