Analyse van HBV-specifieke CD4 T-celresponsen en identificatie van HLA-DR-beperkte CD4 T-cel epitopen op basis van een peptidematrix
Summary
Op basis van een van hepatitis B-virus (HBV) afgeleide peptidematrix konden HBV-specifieke CD4 T-celresponsen parallel aan de identificatie van HBV-specifieke CD4 T-cel epitopen worden geëvalueerd.
Abstract
CD4 T-cellen spelen een belangrijke rol in de pathogenese van chronische hepatitis B. Als een veelzijdige celpopulatie zijn CD4 T-cellen geclassificeerd als verschillende functionele subsets op basis van de cytokines die ze hebben uitgescheiden: bijvoorbeeld IFN-γ voor CD4 T-helper 1-cellen, IL-4 en IL-13 voor CD4 T-helper 2-cellen, IL-21 voor CD4 T folliculaire helpercellen en IL-17 voor CD4 T-helper 17-cellen. Analyse van hepatitis B-virus (HBV)-specifieke CD4 T-cellen op basis van cytokinesecretie na HBV-afgeleide peptidenstimulatie zou niet alleen informatie kunnen opleveren over de omvang van HBV-specifieke CD4 T-celrespons, maar ook over de functionele subsets van HBV-specifieke CD4 T-cellen. Nieuwe benaderingen, zoals transcriptomics en metabolomics-analyse, kunnen meer gedetailleerde functionele informatie opleveren over HBV-specifieke CD4 T-cellen. Deze benaderingen vereisen meestal isolatie van levensvatbare HBV-specifieke CD4 T-cellen op basis van peptide-major histocompatibiliteit complex-II multimeren, terwijl momenteel de informatie over HBV-specifieke CD4 T-cel epitopen beperkt is. Op basis van een hbv-afgeleide peptidematrix is een methode ontwikkeld om HBV-specifieke CD4 T-celresponsen te evalueren en HBV-specifieke CD4 T-cel epitopen gelijktijdig te identificeren met behulp van perifere bloedmononucleaire celmonsters van chronische HBV-infectiepatiënten.
Introduction
Momenteel zijn er 3 hoofdbenaderingen om antigeenspecifieke T-cellen te analyseren. De eerste benadering is gebaseerd op de interactie tussen de T-celreceptor en het peptide (epitoop). Antigeenspecifieke T-cellen kunnen direct worden gekleurd met peptide-major histocompatibiliteitscomplex (MHC) multimeren. Het voordeel van deze methode is dat het levensvatbare antigeenspecifieke T-cellen kan verkrijgen, geschikt voor downstream transcriptomics / metabolomics-analyse. Een beperking van deze methode is dat het geen informatie kon geven over de hele T-celrespons op een specifiek antigeen, omdat het gevalideerde epitooppeptiden vereist, terwijl het aantal geïdentificeerde epitopen voor een specifiek antigeen voorlopig beperkt is. Vergeleken met hepatitis B-virus (HBV)-specifieke CD8 T-cel epitopen zijn er minder HBV-specifieke CD4 T-cel epitopen geïdentificeerd1,2, waardoor deze methode momenteel minder toepasbaar is voor de analyse van HBV-specifieke CD4 T-cellen.
De tweede benadering is gebaseerd op de upregulatie van een reeks activeringsgeïnduceerde markers na antigeenpeptidestimulatie3. De meest gebruikte markers zijn CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. Deze methode is nu gebruikt om antigeenspecifieke T-celresponsen te analyseren bij gevaccineerde personen5,6,human immunodeficiëntievirusinfectiepatiënten7en ernstig acuut respiratoir syndroom Coronavirus 2 infectiepatiënten8,9. In tegenstelling tot de op peptide-MHC-multimeren gebaseerde test, wordt deze methode niet beperkt door gevalideerde epitopen en kunnen levensvatbare cellen verkrijgen voor downstream-analyse. Een beperking van deze methode is dat het geen informatie kon geven over het cytokineprofiel van antigeenspecifieke T-cellen. Ook kan de expressie van deze activerings-geïnduceerde markers door sommige geactiveerde antigeen-niet-specifieke cellen bijdragen aan de achtergrondsignalen in de analyse, wat een probleem kan zijn, vooral wanneer de doelantigeenspecifieke T-cellen zeldzaam zijn. Momenteel is er beperkte toepassing van deze methode op HBV-specifieke CD4 T-cellen4. Of deze methode kan worden gebruikt om HBV-specifieke CD4 T-cellen op een betrouwbare manier te analyseren, moet verder worden onderzocht.
De derde benadering is gebaseerd op de cytokinesecretie na antigeenpeptidestimulatie. Net als activeringsgeïnduceerde markergebaseerde analyse wordt deze methode niet beperkt door gevalideerde epitopen. Deze methode zou direct het cytokineprofiel van antigeenspecifieke T-cellen kunnen onthullen. De gevoeligheid van deze methode is lager dan de activeringsgeïnduceerde markergebaseerde methode, omdat deze afhankelijk is van de cytokinecretie van antigeenspecifieke T-cellen en het aantal geteste cytokines meestal beperkt is. Momenteel wordt deze methode veel gebruikt bij de analyse van HBV-specifieke T-cellen. Omdat cytokine-afscheidende HBV-specifieke T-cellen nauwelijks konden worden gedetecteerd door directe ex vivo peptidestimulatie10,11,wordt het cytokineprofiel van HBV-specifieke T-cellen meestal geanalyseerd na 10-daagse in vitro peptide gestimuleerde expansie12,13,14,15,16. Rangschikking van peptidepools in een matrixvorm is gebruikt om de identificatie van antigeenspecifieke epitopen17,18te vergemakkelijken. Met de combinatie van peptidematrix en cytokinesecretieanalyse is een methode ontwikkeld om HBV-specifieke CD4 T-celresponsen te evalueren en HBV-specifieke CD4 T-cel epitopen tegelijkertijd te identificeren16. In dit protocol worden de details van deze methode beschreven. HBV-kernantigeen wordt gekozen als voorbeeld van demonstratie in dit protocol.
Protocol
Representative Results
Discussion
De meest kritieke stappen in dit protocol worden als volgt opgesomd: 1) voldoende PBMC’s met een hoge levensvatbaarheid om pbmc-uitbreiding te starten; 2) geschikte omgeving voor pbmc-uitbreiding; en 3) volledige verwijdering van resterende peptidepools in PBMC-cultuur vóór epitoopidentificatie.
Alle analyse in dit protocol hangt af van de robuuste proliferatie van CD4 T-cellen. Over het algemeen zal het aantal PBMC’s na 10-daagse uitbreiding 2-3 keer het oorspronkelijke aantal zijn. Het cel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81930061), Chongqing Natural Science Foundation (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) en Chinese Key
Project Gespecialiseerd voor Infectieziekten (2018ZX10723203).
Materials
| Albumin Bovine V (BSA) | Beyotime | ST023 | |
| APC-conjugated Anti-human TNF-α | eBioscience | 17-7349-82 | Keep protected from light |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Limit cell clumping |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09126 | HLA-DRB1*0803 homozygote |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09121 | HLA-DRB1*1202 homozygote |
| Cell Culture Flask (T75) | Corning | 430641 | |
| Cell Culture Plate (96-well, flat bottom) | Corning | 3599 | Flat bottom |
| Cell Culture Plate (96-well, round bottom) | Corning | 3799 | Round bottom |
| Cell Strainer | Corning | CLS431751 | Pore size 70 μm, white, sterile |
| Centrifuge Tube (15 mL) | KIRGEN | KG2611 | Sterile |
| Centrifuge Tube (50 mL) | Corning | 430829 | Sterile |
| Centrifuge, Refrigerated | Eppendorf | 5804R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | ST16R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | Legend Micro 21R | |
| Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) | BD Biosciences | 562574 | Prepare solution before use |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Keep at room temperature to prevent crystallization |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Prepare ddH2O (1000 ml) containing NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), and Na2HPO4.7H2O (2160 mg). Adjust PH to 7.4. Sterilize through autoclave. | ||
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Filter Tips (0.5-10) | Kirgen | KG5131 | Sterile |
| Filter Tips (100-1000) | Kirgen | KG5333 | Sterile |
| Filter Tips (1-200) | Kirgen | KG5233 | Sterile |
| FITC-conjugated Anti-human CD4 | BioLegend | 300506 | Keep protected from light |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | eBioscience | 65-0865-14 | Keep protected from light |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | Protein Transport Inhibitor |
| Haemocytometer | Brand | 718620 | |
| HBV Core Antigen Derived Peptides | ChinaPeptides | ||
| HEPES | Gibco | 15630080 | 100 ml |
| Human Serum AB | Gemini Bio-Products | 100-51 | 100 ml |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| KCl | Sangon Biotech | A100395-0500 | |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A100781-0500 | |
| LSRFortessa Flow Cytometer | BD | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | 100 ml |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Corning | MCT-150-C | Autoclaved sterilization before using |
| Microplate Shakers | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sangon Biotech | A100348-0500 | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241-0500 | |
| PCR Tubes (0.2 mL) | Kirgen | KG2331 | |
| PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 | BioLegend | 300914 | Keep protected from light |
| PE-conjugated Anti-human IFN-γ | eBioscience | 12-7319-42 | Keep protected from light |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | 100 ml |
| PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 | eBioscience | 45-0037-42 | Keep protected from light |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Recombinant Human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | C11875500BT | 500 ml |
| Sodium pyruvate,100mM | Gibco | 15360070 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR | BioLegend | 307648 | |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 |
References
- Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
- Mizukoshi, E., et al. Cellular immune responses to the hepatitis B virus polymerase. Journal of Immunology. 173, 5863-5871 (2004).
- Wölfl, M., Kuball, J., Eyrich, M., Schlegel, P. G., Greenberg, P. D. Use of CD137 to study the full repertoire of CD8+ T cells without the need to know epitope specificities. Cytometry Part A. 73, 1043-1049 (2008).
- Reiss, S., et al. Comparative analysis of activation induced marker (AIM) assays for sensitive identification of antigen-specific CD4 T cells. PLoS One. 12, 0186998 (2017).
- Herati, R. S., et al. Successive annual influenza vaccination induces a recurrent oligoclonotypic memory response in circulating T follicular helper cells. Science Immunology. 2, (2017).
- Bowyer, G., et al. Activation-induced Markers Detect Vaccine-Specific CD4+ T Cell Responses Not Measured by Assays Conventionally Used in Clinical Trials. Vaccines. 6, (2018).
- Morou, A., et al. Altered differentiation is central to HIV-specific CD4(+) T cell dysfunction in progressive disease. Nature Immunology. 20, 1059-1070 (2019).
- Grifoni, A., et al. Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals. Cell. 181, 1489-1501 (2020).
- Meckiff, B. J., et al. Imbalance of Regulatory and Cytotoxic SARS-CoV-2-Reactive CD4+ T Cells in COVID-19. Cell. , (2020).
- Boni, C., et al. Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection. Journal of Virology. 81, 4215-4225 (2007).
- Chang, J. J., et al. Reduced hepatitis B virus (HBV)-specific CD4+ T-cell responses in human immunodeficiency virus type 1-HBV-coinfected individuals receiving HBV-active antiretroviral therapy. Journal of Virology. 79, 3038-3051 (2005).
- Boni, C., et al. Restored Function of HBV-Specific T Cells After Long-term Effective Therapy With Nucleos(t)ide Analogues. Gastroenterology. 143, 963-973 (2012).
- Kennedy, P. T., et al. Preserved T-cell function in children and young adults with immune-tolerant chronic hepatitis B. Gastroenterology. 143, 637-645 (2012).
- de Niet, A., et al. Restoration of T cell function in chronic hepatitis B patients upon treatment with interferon based combination therapy. Journal of Hepatology. 64, 539-546 (2016).
- Rinker, F., et al. Hepatitis B virus-specific T cell responses after stopping nucleos(t)ide analogue therapy in HBeAg-negative chronic hepatitis B. Journal of Hepatology. 69, 584-593 (2018).
- Wang, H., et al. TNF-α/IFN-γ profile of HBV-specific CD4 T cells is associated with liver damage and viral clearance in chronic HBV infection. Journal of Hepatology. 72, 45-56 (2020).
- Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
- Anthony, D. D., Lehmann, P. V. T-cell epitope mapping using the ELISPOT approach. Methods. 29, 260-269 (2003).
