تحليل استجابات الخلايا التائية CD4 الخاصة ب HBV وتحديد HLA-DR-CD4 المقيدة CD4 T-Cell Epitopes استنادا إلى مصفوفة الببتيد
Summary
واستنادا إلى مصفوفة الببتيد المشتقة من فيروس التهاب الكبد B، يمكن تقييم استجابات الخلايا التائية CD4 الخاصة بفيروس التهاب الكبد B بالتوازي مع تحديد الخلايا التائية CD4 الخاصة بفيروس التهاب الكبد B.
Abstract
تلعب خلايا CD4 T أدوارا مهمة في مسببات الأمراض لالتهاب الكبد B المزمن. كمحتوى خلايا متعددة الاستخدامات، تم تصنيف خلايا CD4 T كفئات فرعية وظيفية متميزة استنادا إلى السيتوكينات التي يفرزونها: على سبيل المثال، IFN-γ لخلايا المساعد CD4 T 1، IL-4 و IL-13 لخلايا المساعد CD4 T 2، وIL-21 لخلايا المساعد الجريبي CD4 T، وIL-17 لخلايا المساعد CD4 T. تحليل فيروس التهاب الكبد B (HBV) محددة CD4 الخلايا التائية على أساس إفراز السيتوكين بعد تحفيز الببتيدات المشتقة من HBV يمكن أن توفر معلومات ليس فقط حول حجم HBV محددة CD4 استجابة الخلايا التائية ولكن أيضا حول المجموعات الفرعية الوظيفية من خلايا CD4 T الخاصة HBV. ويمكن للنهج الجديدة، مثل علم النسخ وتحليل علم الأيض، أن توفر معلومات وظيفية أكثر تفصيلا عن خلايا CD4 T الخاصة ب HBV. تتطلب هذه النهج عادة عزل خلايا CD4 T الخاصة ب HBV القابلة للتطبيق استنادا إلى متعددات الخلايا التائية المعقدة II ذات الهستيد الرئيسية بالببتيد ، في حين أن المعلومات حول epitopes CD4 T-cell الخاصة ب HBV محدودة حاليا. استنادا إلى مصفوفة الببتيد المشتقة من HBV ، تم تطوير طريقة لتقييم استجابات الخلايا التائية CD4 الخاصة ب HBV وتحديد الخلايا التائية CD4 الخاصة ب HBV في وقت واحد باستخدام عينات خلايا الدم الأحادية الطرفية من مرضى عدوى HBV المزمنة.
Introduction
حاليا، هناك 3 النهج الرئيسية لتحليل الخلايا التائية المستضد محددة. ويستند النهج الأول على التفاعل بين مستقبلات الخلايا التائية والببتيد (epitope). يمكن أن تكون الخلايا التائية الخاصة بالمضاد ملطخة مباشرة بمتعددات مجمع توافق الهستوباتية الرئيسية للببتيد (MHC). ميزة هذه الطريقة هي أنه يمكن الحصول على خلايا T مستضد محددة قابلة للحياة، ومناسبة لتحليل النسخ المصب / المستقلب. أحد قيود هذه الطريقة هو أنه لا يمكن أن يوفر معلومات حول استجابة الخلايا التائية الكاملة لمستضد معين ، لأنه يتطلب ببتيدات الظهارة المعتمدة في حين أن عدد الأسطح المحددة لمستضد معين محدود في الوقت الحالي. بالمقارنة مع فيروس التهاب الكبد B (HBV) محددة CD8 تي الخلية epitopes, وقد تم تحديد أقل HBV محددة CD4 تي الخلية epitopes1,2, مما جعل هذه الطريقة أقل قابلية للتطبيق لتحليل خلايا CD4 T الخاصة HBV حاليا.
ويستند النهج الثاني على upregulation من سلسلة من علامات التنشيط الناجمة بعد تحفيز الببتيد مستضد3. وتشمل العلامات الشائعة الاستخدام CD69، CD25، OX40، CD40L، PD-L1، 4-1BB4. وقد استخدمت هذه الطريقة الآن لتحليل استجابات الخلايا التائية الخاصة بالمضاد في الأفراد الملقحين5،6 ،مرضىعدوى فيروس نقص المناعة البشرية7، وفيروس كورونافيروس الالتهاب الرئوي الحاد الوخيم 2 مرضىالعدوى 8،9. على عكس المقايسة المستندة إلى الببتيد-MHC ، لا يتم تقييد هذه الطريقة عن طريق epitopes المعتمدة ويمكن الحصول على خلايا قابلة للحياة لتحليل المصب. وهناك قيود على هذا الأسلوب هو أنه لا يمكن توفير معلومات حول ملف تعريف السيتوكين من الخلايا التائية الخاصة مستضد. أيضا، التعبير عن هذه العلامات الناجمة عن التنشيط من قبل بعض الخلايا المنشطة مستضد غير محددة قد تسهم في إشارات الخلفية في التحليل، والتي يمكن أن تكون مشكلة خاصة عندما تكون الخلايا التائية المستهدفة مستضد محددة نادرة. حاليا، هناك تطبيق محدود من هذا الأسلوب على خلايا CD4 T CD4 الخاصة HBV4. ما إذا كان يمكن استخدام هذه الطريقة لتحليل خلايا CD4 T الخاصة ب HBV بطريقة موثوقة تحتاج إلى مزيد من التحقيق.
ويستند النهج الثالث على إفراز السيتوكين بعد تحفيز الببتيد مستضد. مثل التحليل القائم على علامة التنشيط الناجمة، لا يتم تقييد هذه الطريقة من قبل epitopes التحقق من صحتها. يمكن أن تكشف هذه الطريقة مباشرة عن ملف تعريف السيتوكين للخلايا التائية الخاصة بالمضاد. حساسية هذه الطريقة أقل من الطريقة القائمة على علامة التنشيط الناجمة لأنها تعتمد على إفراز السيتوكين من الخلايا التائية الخاصة بالمضاد وعدد السيتوكينات التي تم اختبارها عادة ما تكون محدودة. حاليا، يتم استخدام هذه الطريقة على نطاق واسع في تحليل الخلايا التائية الخاصة بفيروس التهاب الكبد B. كما السيتوكين إفراز خلايا T HBV محددة لا يكاد يمكن الكشف عنها عن طريق التحفيز المباشر الببتيد السابق فيفو10,11, يتم تحليل ملامح السيتوكين من الخلايا التائية HBV محددة عادة بعد 10 يوما في الببتيد المختبر حفز التوسع12,13,14,15,16. وقد استخدم ترتيب برك الببتيد في شكل مصفوفة لتسهيل تحديد epitopes مستضد محددة17،18. مع الجمع بين مصفوفة الببتيد وتحليل إفراز السيتوكين، تم تطوير طريقة لتقييم استجابات الخلايا التائية CD4 الخاصة ب HBV وتحديد الخلايا التائية CD4 الخاصة ب HBV في وقت واحد16. في هذا البروتوكول، يتم وصف تفاصيل هذا الأسلوب. يتم اختيار مستضد HBV الأساسية كمثال على مظاهرة في هذا البروتوكول.
Protocol
Representative Results
Discussion
وترد الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول على النحو التالي: 1) ما يكفي من مركبات PBMCs ذات الجدوى العالية لبدء توسيع PBMCs؛ (2) الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول؛ (2) الخطوات التي يمكن أن تكون ذات جدوى عالية لبدء توسعات PBMCs؛ (2) الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول. 2) البيئة المناسبة لتوسيع …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81930061) ومؤسسة تشونغتشينغ للعلوم الطبيعية (cstc2019jcyj-bshX0039 وcstc2019jcyj-zdxmX0004) والمفتاح الصيني
مشروع متخصص في الأمراض المعدية (2018ZX10723203).
Materials
| Albumin Bovine V (BSA) | Beyotime | ST023 | |
| APC-conjugated Anti-human TNF-α | eBioscience | 17-7349-82 | Keep protected from light |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Limit cell clumping |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09126 | HLA-DRB1*0803 homozygote |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09121 | HLA-DRB1*1202 homozygote |
| Cell Culture Flask (T75) | Corning | 430641 | |
| Cell Culture Plate (96-well, flat bottom) | Corning | 3599 | Flat bottom |
| Cell Culture Plate (96-well, round bottom) | Corning | 3799 | Round bottom |
| Cell Strainer | Corning | CLS431751 | Pore size 70 μm, white, sterile |
| Centrifuge Tube (15 mL) | KIRGEN | KG2611 | Sterile |
| Centrifuge Tube (50 mL) | Corning | 430829 | Sterile |
| Centrifuge, Refrigerated | Eppendorf | 5804R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | ST16R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | Legend Micro 21R | |
| Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) | BD Biosciences | 562574 | Prepare solution before use |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Keep at room temperature to prevent crystallization |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Prepare ddH2O (1000 ml) containing NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), and Na2HPO4.7H2O (2160 mg). Adjust PH to 7.4. Sterilize through autoclave. | ||
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Filter Tips (0.5-10) | Kirgen | KG5131 | Sterile |
| Filter Tips (100-1000) | Kirgen | KG5333 | Sterile |
| Filter Tips (1-200) | Kirgen | KG5233 | Sterile |
| FITC-conjugated Anti-human CD4 | BioLegend | 300506 | Keep protected from light |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | eBioscience | 65-0865-14 | Keep protected from light |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | Protein Transport Inhibitor |
| Haemocytometer | Brand | 718620 | |
| HBV Core Antigen Derived Peptides | ChinaPeptides | ||
| HEPES | Gibco | 15630080 | 100 ml |
| Human Serum AB | Gemini Bio-Products | 100-51 | 100 ml |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| KCl | Sangon Biotech | A100395-0500 | |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A100781-0500 | |
| LSRFortessa Flow Cytometer | BD | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | 100 ml |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Corning | MCT-150-C | Autoclaved sterilization before using |
| Microplate Shakers | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sangon Biotech | A100348-0500 | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241-0500 | |
| PCR Tubes (0.2 mL) | Kirgen | KG2331 | |
| PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 | BioLegend | 300914 | Keep protected from light |
| PE-conjugated Anti-human IFN-γ | eBioscience | 12-7319-42 | Keep protected from light |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | 100 ml |
| PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 | eBioscience | 45-0037-42 | Keep protected from light |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Recombinant Human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | C11875500BT | 500 ml |
| Sodium pyruvate,100mM | Gibco | 15360070 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR | BioLegend | 307648 | |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 |
References
- Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
- Mizukoshi, E., et al. Cellular immune responses to the hepatitis B virus polymerase. Journal of Immunology. 173, 5863-5871 (2004).
- Wölfl, M., Kuball, J., Eyrich, M., Schlegel, P. G., Greenberg, P. D. Use of CD137 to study the full repertoire of CD8+ T cells without the need to know epitope specificities. Cytometry Part A. 73, 1043-1049 (2008).
- Reiss, S., et al. Comparative analysis of activation induced marker (AIM) assays for sensitive identification of antigen-specific CD4 T cells. PLoS One. 12, 0186998 (2017).
- Herati, R. S., et al. Successive annual influenza vaccination induces a recurrent oligoclonotypic memory response in circulating T follicular helper cells. Science Immunology. 2, (2017).
- Bowyer, G., et al. Activation-induced Markers Detect Vaccine-Specific CD4+ T Cell Responses Not Measured by Assays Conventionally Used in Clinical Trials. Vaccines. 6, (2018).
- Morou, A., et al. Altered differentiation is central to HIV-specific CD4(+) T cell dysfunction in progressive disease. Nature Immunology. 20, 1059-1070 (2019).
- Grifoni, A., et al. Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals. Cell. 181, 1489-1501 (2020).
- Meckiff, B. J., et al. Imbalance of Regulatory and Cytotoxic SARS-CoV-2-Reactive CD4+ T Cells in COVID-19. Cell. , (2020).
- Boni, C., et al. Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection. Journal of Virology. 81, 4215-4225 (2007).
- Chang, J. J., et al. Reduced hepatitis B virus (HBV)-specific CD4+ T-cell responses in human immunodeficiency virus type 1-HBV-coinfected individuals receiving HBV-active antiretroviral therapy. Journal of Virology. 79, 3038-3051 (2005).
- Boni, C., et al. Restored Function of HBV-Specific T Cells After Long-term Effective Therapy With Nucleos(t)ide Analogues. Gastroenterology. 143, 963-973 (2012).
- Kennedy, P. T., et al. Preserved T-cell function in children and young adults with immune-tolerant chronic hepatitis B. Gastroenterology. 143, 637-645 (2012).
- de Niet, A., et al. Restoration of T cell function in chronic hepatitis B patients upon treatment with interferon based combination therapy. Journal of Hepatology. 64, 539-546 (2016).
- Rinker, F., et al. Hepatitis B virus-specific T cell responses after stopping nucleos(t)ide analogue therapy in HBeAg-negative chronic hepatitis B. Journal of Hepatology. 69, 584-593 (2018).
- Wang, H., et al. TNF-α/IFN-γ profile of HBV-specific CD4 T cells is associated with liver damage and viral clearance in chronic HBV infection. Journal of Hepatology. 72, 45-56 (2020).
- Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
- Anthony, D. D., Lehmann, P. V. T-cell epitope mapping using the ELISPOT approach. Methods. 29, 260-269 (2003).
