Kriyo-Elektron Tomografisi için Çift Işınlı Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanarak Vitreus Biyolojik Numunelerinden Lamel Hazırlanması

P. falciparum schizonts’un dalma dondurma için hazırlanması Bileşik 2 ve E64 inhibitörleri, çıkışın farklı aşamalarında şizontları durdurmak için kullanılır ve sonraki çalışmalar için zenginleştirilmiş bir schizonts popülasyonu oluşturur. Bu önemlidir, çünkü tamamlayıcı bir korelasyon tekniği olmadan, spesifik hücre altı hedefleri veya hücre tiplerini frezelemek, süreç esasen kör olduğu için zordur. Bileşik 2, vakuol rüptüründen önce çıkışı durduran bir protein kinaz inhibitörüdür. Schizontlar 4 saat boyunca bileşik 2 üzerinde senkronize edilebilir, daha sonra inhibitörü çıkarmak için bileşik 2-free media ile yıkanabilir, bu noktada schizonts yaklaşık 30 dakika sonra olgunlaşır ve çıkar. Alternatif olarak, bileşik 2 senkronize şizontlar, geri dönüşümsüz bir geniş spektrumlu sistein proteaz inhibitörü olan E64’e yıkanabilir ve vakuol rüptürü noktasından sonra, ancak konakçı hücre rüptüründen önce çıkışı durdurmak için yaklaşık 1 saat boyunca inkübe edilebilir. Tedavi edilen şizontların morfolojisi ve homojenliği, dalma donmasından önce Giemsa boyalı kan yaymaları ile kontrol edilmelidir (Şekil 1). Schizontlar, bu yayında açıklanan yöntem kullanılarak bu durumlardan herhangi birinde dondurulmuş olarak daldırılabilir. Resim 1: Giemsa boyalı kan yaymaları ile bileşik 2 ve E64 duraklamış P. falciparum schizontlarının morfolojisi. (A) Bileşik 2’nin varlığında, parazitoforöz vakuol (PV), tek bir hemozoin kristali kümesi (koyu kahverengi daire) ile merozoitlerle (mor daireler) yoğun bir şekilde paketlenir. PV ile konakçı kırmızı kan hücresindeki (hRBC) (gri bant) çevresindeki hemoglobin arasındaki sınır, hRBC zarının yanı sıra iyi tanımlanmıştır. (B) E64 varlığında, PV membranı yırtılır ve merozoitler hRBC içinde yayılır. Her şizont hala tek bir hemozoin kristali kümesi içerir. Konakçı hücre zarı sızdırmaz ve kısmen çökmüştür, bu nedenle hücre periferisinde hemoglobin görünmez ve hRBC zarının sınırı kolayca görünmez. Ölçek çubuğu, 5 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Dalma dondurma optimizasyonuAltın ve bakır 200 örgü ızgaralar üzerinde 2/2, 3/3, 3.5/1 ve 5/2 (kare) delikli karbon dahil olmak üzere P. falciparum ile enfekte kırmızı kan hücreleri için lekelenme koşullarının optimizasyonu sırasında farklı delik boyutlarına sahip bir dizi ızgara denenmiştir. 2/4 delikli karbon filmli 200 örgülü bakır bulucu ızgaraları, uzun vitreus lamelleri öğütmek için uygun kalınlıkta bir hücre tabakası sağlar. Daha büyük veya daha küçük delikler genellikle sırasıyla çok ince veya kalın hücre katmanlarıyla sonuçlanır (Şekil 2A-C). 2/4 delikli karbon ile, şizontlar ızgarayı arkadan (karbon olmayan taraftan) lekeleyerek 2 μm deliklerden çekilir, bu da hücrelerin karbon filmin üstünde ve altında dışarı çıkmasına neden olur. Delikler arasındaki 4 μm karbon gerilmesi, ortaya çıkan lamellerin çoğunun ortasından geçen ve güç katan bir karbon şeridi ile sonuçlanır. Bulucu ızgaraları korelasyon ve eleme amaçları için en uygun olanıdır44, ancak ağ tasarımındaki sayıların / harflerin frezeleme alanlarını engelleyeceğinden çok büyük olmadığından emin olmak için özen gösterilmelidir. Manuel bir pistondaki lekelenme süresi yaklaşık 20 sn’dir, ancak lekelenmeyi durdurmak için kesin nokta, ızgaradan çekilen sıvı damlacığı filtre kağıdına yayılmayı bıraktığında gözle değerlendirildi. Lekeleme işlemini başlatmak için damlanın yüzey gerilimini kırmak için yırtık bir kenar gerekliydi. Bu çalışmada otomatik bir daldırma dondurucu kullanılmamıştır, ancak bu örnek için makul bir başlangıç noktası, manuel bir piston için kullanılanla aynı hacimde hücre ve ızgara tipi kullanmak ve ızgaraları yüksek nem (~% 70) ve ortam sıcaklığı (~ 25 ° C) olan koşullarda arkadan lekelediğinizden emin olmak olacaktır. Blotlama süreleri ve koşullarının, kullanılan belirli otomatik sistem için optimize edilmesi gerekir. P. falciparum schizonts’un dalma dondurulmuş ızgaraları, TEM yerine kriyo-aşama ile donatılmış bir ışık mikroskobu ile tarandı, çünkü numune elektronlara aktarılamadı. Daha ince numuneler için, ızgaralar, ulusal bir tesise erişim için bir ön koşul olabilecek cryoFIB-SEM’e numune transferinden önce TEM (~ 150x büyütmede tüm ızgara atlası) tarafından taranabilir. Buz kalınlığının gradyanına ızgara boyunca ve ayrıca bireysel ızgara kareleri içinde özel dikkat gösterilmelidir. İyi ızgara kareleri bir hücre kalınlığında olmalı veya karbon filme merkezlerinden çarpmalıdır (Şekil 2C). Bu, ızgara karesinin kenarındaki ızgara çubuklarına karşı daha kalın buzda frezelenmeyi önler ve iyon ışınının hücre tabakasının üstünden ve altından geçmesini sağlayarak kama yerine serbest bir lamel üretir. Tekrarlanabilir lekeleme ve daldırma dondurma koşulları optimize edildikten sonra, FIB frezelemeden önce genellikle tarama gerekli değildir. Şekil 2. Dalma dondurulmuş P. falciparum schizonts ızgaralarındaki hücre dağılımının kriyo-ışık mikroskobu ile analiz edilmesi. (A) Kriyo-ışık mikroskobu ile bir ızgara karesi boyunca çok kalın olan buzun hücreleri ve karbon filmini gizleyen bir örneği. Ölçek çubuğu, 10 μm. (B) Delik boyutunun (5/2 kare delikli karbon filmli 300 örgü bakır ızgara) hücreler için çok büyük olmasına bir örnek, buzsuz boş bölgelerle çevrili çok ince bir biyolojik malzeme tabakasına neden olur. Bunun gibi ızgaralar çok kısa, kararsız lameller üretir. Ölçek çubuğu, 10 μm. (C) 2/4 delikli karbon filmli 200 örgülü bakır ızgarada iyi hücre dağılımına bir örnek. Bu şizontlar E64 inhibitörü ile tedavi edildi. İyi tanımlanmış bir periferiye sahip büyük hücreler (kırmızı kutu, ~ 5 μm çapında), hala sağlam bir vakuol zarına sahip olan enfekte kırmızı kan hücreleridir. Küçük hücre kümeleri (mavi kutu, ~ 1 μm), kısmen çökmüş bir konakçı kırmızı kan hücresinde bulunan bireysel merozoitlerdir. Her şizontun merkezinde, hemozoin kristallerinin konumunu gösteren siyah bir nokta vardır (Ek ayrıntılar için Şekil 1’e bakınız). Hücre morfolojisindeki farkı, kriyoFIB-SEM’in içinde bir kez görmek kadar kolay değildir; Bu nedenle, kriyo-ışık mikroskobu ile ön tarama, tekrarlanabilir lekelenme koşullarına ulaşılana kadar faydalıdır. Izgara çubuklarının (beyaz kesikli alanlar) yanındaki ızgara karesinin kenarlarının etrafındaki hücre kapsamı frezeleme için çok kalındır. Izgara karesinin ortasındaki daha ince bölge (sarı kesikli alan), lamelleri çevreleyen hücre tabakasına genişleterek öğütmek için ideal bir yerdir. Ölçek çubuğu, 6 μm. (D) KriyoFIB’ye özgü bir otomatik ızgara jantının, biri kesme bölümünde (siyah braket) ve diğeri tam tersi olmak üzere saat 12 ve saat 6 konumunda iki siyah işaretli görüntüsü. Siyah ok, frezeleme yönünü temsil eder. (E) Izgaralar otomatik yükleyici kasetine yüklendiğinde, işaretlerin yükleme cımbızının her iki tarafına eşit uzaklıkta olması gerekir, bu da lamellerin sahnenin eğim eksenine dik olarak uzanmasına neden olur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Tomografi için cryoFIB’e özgü otomatik ızgara jantlarının işaretlenmesiTipik olarak, ızgaralar, kullanımı kolaylaştırmak ve sertlik sağlamak için frezelemeden önce otomatik ızgara jantlarına kırpılır, bu da sonraki transfer adımları sırasında lamelleri hasardan korur. CryoFIB’e özgü otomatik ızgara jantları, frezeleme sırasında ızgara yüzeyinin daha fazlasına erişmeye yardımcı olmak için kesme özelliği ile tasarlanmıştır. Frezeleme yönünün TEM’in eğim eksenine dik olarak yönlendirilmesi önemlidir, böylece eğim serisi edinimi, lamelleri uzunluğu boyunca döndürerek devam eder. Bu, lamelleri çevreleyen açmanın yüksek duvarlarının, ızgara eğilirken biyolojik bilgiyi gizlememesini sağlar. Tipik olarak, otomatik ızgara jantı, kriyoFIB-SEM mekiği içinde ve daha sonra TEM’i yüklerken görsel hizalamaya yardımcı olmak için işaretlenir. Bu örnekler için, saat 12 ve saat 6 pozisyonlarında, biri klips halkasının kesik bölümünün ortasında, ikincisi ise tam tersi olmak üzere silinmez bir işaretleyici ile iki işaret uygulanmıştır (Şekil 2D). TEM’e yükleme yaparken (bkz. Malzeme Tablosu), her iki işaret de yükleme cımbızının her iki tarafında görünür olmalı ve cımbızın kenarına 90° hizalanmalıdır (Şekil 2E). İyon ışınına yakın bazı mürekkepler frezelemeye müdahale edebileceğinden, üreticinin otomatik ızgara jantlarındaki oyulmuş noktaları kullanarak ızgaraların hizalanmasını önerdiğine dikkat edilmelidir. Kırpılmış ızgaralar, bir kriyo-aşama için modifiye edilmiş bir kasetle ışık mikroskobu ile taranabilir, bu da kırpma işleminin ızgaranın karbon filmini tahrip etmediğini kontrol etmek için faydalı olabilir. Numune kasetine bağlı olarak, kırpılmamış ızgaralar da frezelenebilir, ancak lamelleri kıracağı için ızgaranın herhangi bir bükülmesini sınırlamak için cryoFIB-SEM’den TEM’e aktarım sırasında büyük özen gösterilmelidir. Kırpılmamış ızgaralar, yandan girişli kriyo tutucular tarafından TEM’e yüklenebilir, ancak frezelemeden sonra kırpma yapılırsa lamellerin kırılma olasılığı yüksektir. Organoplatin kaplamaOrganoplatin kaplama, kriyoFIB-SEM’e yüklendikten sonra bir veya her iki ızgarada gerçekleştirilir. Gaz enjeksiyon sisteminin (GIS) iğnesi, ızgaranın yüzeyi boyunca belirli bir süre ısıtılmış bir kaynaktan organoplatin buharı akışını yönlendirmek için numunenin üzerindeki odaya yerleştirilir. Buhar soğuk yüzeylerde yoğunlaşır ve katı bir tabaka oluşturur (~ 2 μm kalınlığında). Bu katın bütünlüğü, düzgün ince lamellerin öğütülmesini sağlamak için kritik öneme sahiptir. Organoplatin kaplama için en uygun uygulama koşulları genellikle cihazın üreticisi tarafından önceden belirlenir, ancak yine de bazı optimizasyonlar gerekebilir. Çoğu sistem, CBS iğnesini frezeleme yönüne yakın veya frezeleme yönüne dik olarak hizalar, odadaki portların geometrisine ve sahnenin dönme sınırlarına bağlı olarak. Izgaranın kaplanması, küçük bir bölgenin frezelenmesi, sahnenin eğilmesi ve katın kalınlığının SEM ile ölçülmesi ile farklı ayarlar denenebilir. KriyoFIB-SEM’in kendisinin kurulumunun yanı sıra, 1) numunenin topografyası, 2) ızgaradaki yüzey kontaminasyonu ve 3) CBS iğnesinden buhar akışının tekrarlanabilirliği dahil olmak üzere organoplatin kaplamanın uygulanmasını bir dizi başka faktör etkileyebilir. CBS akışı yönlü olduğundan, düzensiz topografya, hücrelerin gölgesindeki bölgelerin veya yüzey kontaminasyonunun kaplanmamış olmasına veya daha ince bir kaplamaya sahip olmasına neden olabilir. Bu, parlatma sırasında organoplatin tabakasının çökmesine neden olabilir (Şekil 3). Frezelenecek bir alan seçerken, çevredeki topografyaya dikkat etmek gerekir, örneğin, büyük yüzey kirliliği, hücre kümeleri veya ızgaranın yüzeyinden birkaç ızgara karesine kadar dışarı yansıyan kırık karbon, buhar akışını engelleyebilir ve bir lamelleri zayıflatabilecek daha ince organoplatin gölgesi oluşturabilir. Ek olarak, lamelmanın ön kenarına yakın çok küçük yüzey kirliliği parçacıklarından da kaçınılmalıdır, çünkü frezeleme sırasında patlayabilirler, parlatma sırasında lamelde bir delik oluşmasına neden olabilecek zayıflamış bir çıplak buz yaması bırakırlar. Son olarak, frezeleme başladıysa ve organoplatin kaplama dengesiz görünüyorsa, tekrar daha uzun süre kaplayın veya bir yedek ızgaraya geçin. Şekil 3: İnce, eşit öğütülmüş lameller elde etmek için kaliteli bir organoplatin kaplama kritik öneme sahiptir . (A) Organoplatin kaplamanın (OP, sarı) çok ince uygulandığı, lamelmanın ön kenarında parlatma (yeşil daire) ve lamelin tüm genişliği boyunca düzensiz frezeleme (çizgiler) sırasında gelişen bir deliğe yol açan bir lamelin ön kenarının mikrografisi. Organoplatin yüzeyi, iyon ışını tarafından kesilmiştir ve kaplamanın ön kenarının arkasında bir malzeme spreyine yol açmıştır (sarı kesikli çizgi). (B) Organoplatin kat (OP) daha kalın bir şekilde uygulanmıştır, bu da daha eşit şekilde inceltilmiş bir lamel ile sonuçlanır. Katın bütünlüğü, lamelin tüm genişliği boyunca korunur ve organoplatin kaplama ile vitrifiye biyolojik materyal arasındaki arayüz iyi tanımlanmıştır (sarı kesikli çizgi). Karbon tabakası, lamelin (turuncu) arkasından geçerken görülebilir. Ölçek çubukları, 1 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. KriyoFIB-SEM’de ızgara kalitesinin değerlendirilmesi ve frezeleme prosesiIzgaralar kriyoFIB-SEM’e aktarıldıktan sonra, karbon filmin bütünlüğü ve hücrelerin ızgaralardaki dağılımı SEM ile taranabilir (Şekil 4A-C). Buz gradyanları, ızgara çubuklarının konumları ve ızgara numaralarının bulucu ızgaralarındaki konumları, 30 kV’da düşük büyütmeli SEM ile kontrol edilebilir (Şekil 4B), ancak frezeleme konumlarını yüksek büyütmede konumlandırırken ve yüzey topografyasından kontrastı artırmak için frezeleme işlemini izlerken voltaj 5 kV’a düşürülmelidir. Şekil 4: Izgara kalitesinin değerlendirilmesi ve kriyoFIB-SEM’de öğütülecek alanların belirlenmesi . (A) SEM aracılığıyla 5 kV’da bir ızgaranın düşük büyütmeli bir genel bakışı. Otomatik ızgara jantının kesit bölümü, görüntünün altında görülebilir. Ölçek çubuğu, 0,5 mm. (B) SEM tarafından 30 kV’da aynı ızgara, daha kalın buz (daha koyu ızgara kareleri) ve daha ince buz (daha açık ızgara kareleri) alanlarını gösterir. İç kısım, 30 kV’de görülebilen bulucu ızgarasındaki numaralandırmayı gösteren oklarla birlikte kutudaki bölgeyi gösterir. Ölçek çubuğu, 0,5 mm. (C) Hücrelerin karbon film üzerindeki dağılımını ve ızgara çubuklarının konumunu değerlendiren iki ızgara karesine orta büyütmeli bir genel bakış. Ölçek çubuğu, 50 μm. (D) Yüksek büyütmede ilk kesim için frezeleme desenlerinin düzenlenmesi (1,5 pA ve 30 kV’de iyon ışını görünümü). Kırmızı bölge (3 μm kalınlığında) korunurken, sarı bölgeler iyon ışını tarafından ablatlanacaktır. Beyaz kesikli çizgi, son lamelin konumunu gösterir. Ölçek çubuğu, 10 μm. (E) Cilalanmış 200 nm kalınlığında (10 μm genişlik x 15 μm uzunluğunda) SEM aracılığıyla 3 kV’da yüksek büyütmeli bir görünüm. Lamel içindeki kontrast kaybı 3 kV’da uygun kalınlığa ulaşıldığını gösterir. Parlak beyaz ön kenar, frezelemeden önce CBS aracılığıyla ızgaraya uygulanan kalan organoplatin tabakadır. Ölçek çubuğu, 5 μm. (F) (E)’den aynı lamel, iyon ışını kullanılarak 30 kV ve 1,5 pA’da görüntülendi. Siyah kare (beyaz ok) boyunca ince beyaz çizgi, lamelin en ön kenarında kalan organoplatin kattır. Ölçek çubuğu, 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Frezelenecek bir bölge, iyon ışını görünümünde yüksek büyütmede (şizontlar için ~ 7.000x) korunan bir bölgenin her iki tarafına bir çift dikdörtgen desen yerleştirilerek seçilir (Şekil 4D). Frezeleme bölgesine yakın hiçbir yüzey kontaminasyon partikülünün bağlanmaması çok önemlidir, çünkü bunlar koruyucu organoplatin kaplamanın uygulanmasını engellemiş olabilir. Bölgenin topografyasının, nihai kalınlığına ulaşıldıktan sonra lamelin kenarlarını desteklemeye uygun olması da önemlidir. Sıtma şizontları için (hücre boyutu: ~5 μm çap x 2 μm kalınlığında, disk şeklinde) 7-20 μm genişliğinde lameller öğütülebilir. Hücre tabakası uygun şekilde kalınsa, lameller genellikle ~ 10-15 μm uzunluğunda olacak ve karbon tabakasının üstünde ve altında birden fazla hücre yakalayacaktır (Şekil 4E-F). 8 saatlik bir seansta 5-10 lamellerin öğütülmesi beklenebilir (6-7 saat frezeleme ve 1-2 saat parlatma). Bu, numunenin kalınlığına ve lamellerin genişliğine bağlı olarak değişecektir, daha kalın numuneler ve daha geniş lamellerin öğütülmesi daha uzun sürecektir. Bir dizi lamel oluşturmak için sadece bir avuç iyi ızgara karesi gerektirdiğinden hasarlı ızgaralar bile öğütülebilir (Şekil 5A). Ek olarak, numune beklenenden daha inceyse, örneğin, aşırı lekelenme veya kültürün hematokritindeki varyasyon nedeniyle, daha kısa lameller nispeten hızlı bir şekilde öğütülebilir; ancak, daha kısa uzunlukları TEM’de veri toplama için kullanılabilir alanı sınırlayacaktır (Şekil 5B). Şekil 5: Frezeleme sırasında nihai lamel kalınlığına ne zaman ulaşıldığının belirlenmesi. (A) Kırpma sırasında karbon hasarını gösteren 5 kV’da SEM tarafından bir ızgaranın düşük büyütmeli genel bakışı. Hasar görmemiş alanlar, aşırı lekelenme nedeniyle çok ince numune içeriyordu; Bununla birlikte, kriyoFIBSEM’de tam günlük bir oturumda bu ızgarada (beyaz kesikli anahat içindeki bölge) altı lamel öğütmek hala mümkündü. Ölçek çubuğu, 0,5 mm. (B) Bu ızgaradan (3 kV’de SEM) üretilen kısa bir lamel (~ 10 μm genişliğinde x 3 μm uzunluğunda, organoplatin tabakası hariç), yine de eğim serilerinin toplanacağı iki bölge sağladı. Ölçek çubuğu, 25 μm. (C) Son parlatma adımı sırasında lamellerin inceltildikçe (soldan sağa hareket ettikçe) kontrastın nasıl kaybolduğunu gösteren bir dizi lamel görüntüsü (3 kV). Tüm görüntülerde lamelin ortasındaki koyu siyah çizgi, ızgaradan bir karbon film şerididir. Bu bölgenin önündeki hücreler karbon filmin üzerinde vitrifiye edildi ve bu bölgenin arkasındaki hücreler karbon filmin altında vitrifiye edildi. Lamelin ön kenarının sol tarafındaki organoplatin kaplama yapısal bütünlüğünü kaybetmek üzereyken frezeleme durduruldu. Bu durma noktası, tüm lamel eşit bir kalınlığa getirilmeden önceydi, bu yüzden lamelin arkasında hala daha yüksek kontrastlı bir malzeme var. (D) (A)’da gösterilen ızgara üzerinde öğütülmüş lamelleri temel alan bir parlatma yolu örneği. Bir parlatma rotası, FIB kaynağına yakın lamellerde başlamalı ve öğütülmüş malzemenin lamellerin yüzeyine yeniden birikmesini sınırlamak için FIB kaynağından uzaklaşmalıdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Parlatma sırasında, bir lamelin nihai kalınlığı, öğütülen bölgedeki numunenin yapısına, organoplatin kaplamanın bütünlüğüne ve mevcut zamana bağlı olacaktır. İdeal olarak, numune, 3 kV’da SEM tarafından lamelin tüm yüzeyi boyunca kontrast kaybolana kadar inceltilmelidir, bu da eşit elektron saydam ve yaklaşık 150-200 nm kalınlığında olduğunu düşündürmektedir (Şekil 5C). Bununla birlikte, organoplatin tabakası bir delik geliştirirse veya lamel bükülmeye başlarsa, bu noktadan önce frezelemeyi durdurmak gerekebilir. Bu durumda, lamel hala ön tarafta yeterince ince olabilir ve tomografi için yararlı olmaya devam edebilir. Tersine, lamel sabit görünüyorsa, kontrast aşaması kaybını aşmak mümkündür, bu da frezeleme desenlerini birbirine yaklaştırarak (~ 100 nm veya daha az) daha da inceltilir. Bu, aşağı akış iş akışı için gerekirse hangi kalınlığa bağlı olacaktır. İyon ışını kaynağına daha yakın başlayıp uzaklaşan bir parlatma rotası planlamak için düşük büyütmeli bir SEM görüntüsü gereklidir (Şekil 5D). Parlatma işleminin yönü, ablatlanmış malzemenin daha önce bitmiş olan lamel üzerine yeniden birikmesini önlemek için önemlidir. Eğim serisi verilerinin toplanması ve işlenmesiTEM’e yüklendikten sonra, düşük büyütmeli bir tam ızgara montajı (~ 150x), frezeleme sonunda çekilen düşük büyütmeli SEM görüntüsüyle ilişkilendirilebilen lamellerin konumlarını tanımlayacaktır. Dalma donmuş şizontlar için, ızgaranın çoğu elektronlara karşı şeffaf değildir, bu nedenle lamel pozisyonları siyah bir arka plan üzerinde beyaz çentikler olarak görünür (Şekil 6A). Lamellerin mikroskobun eğim eksenine göre açısı not edilmelidir, çünkü dikeyden ~ 10 ° ‘den daha fazla uzakta olması eğim serisi edinimini zorlaştırabilir. Her bir lamelin bulunduğu yerdeki orta büyütmeli bir montaj (~ 1.500x), biyolojik içeriğe genel bir bakış sunacak ve transfer hasarı, kristalin buz veya aşırı yüzey kirliliğini kontrol edecektir (Şekil 6B-D). Bu, hiçbir yüzey kontaminasyonunun edinme veya odak alanını gizlemediğinden emin olmak için yüksek eğimde de kontrol edilmelidir. Bir edinme bölgesi seçmek sadece biyolojik özelliklere değil, aynı zamanda çevredeki bölgedeki buzun yapısal bütünlüğüne de bağlı olacaktır, örneğin, bu bölgeler sürükleneceği için çatlaklardan kaçınmak veya bir lamelin değişken kalınlığa sahip olacağı aşırı perdelenmeye sahip alanlar. Bir eğim serisi elde etmeden önce, lamellerin düzlemini (ızgarayı değil) optik eksene dik hale getirmek için ızgaraya ±10 ° ‘lik bir ön eğim uygulanır. Ön eğimin yönü, orta büyütme montajında lamellerin ön kenarının konumu (organoplatin kaplama üzerinde sol tarafa bakarak) ile belirlenebilir. Burada kullanılan TEM için (300 kV Titan Krios), lamellerin ön kenarları haritada yukarı baktığında, bu +10 ° ‘lik bir ön eğim gerektiriyordu ve eğer aşağı işaret ediyorlarsa, bu -10 ° ‘lik bir ön eğim gerektiriyordu. Her ızgara, cımbızla alındıkları ve otomatik yükleyiciye yerleştirildikleri yön nedeniyle farklı olabilir (sola veya sağa bakan kesik bölüm, 180° dönüş üretir). Son bir husus piksel boyutudur. Rutin olarak, eğim serileri, ilgilenilen özelliğin boyutu, elde edilen tomografik verilerin hedef çözünürlüğü ve lamelin yüzey alanı dikkate alınarak 2,5-7 ş/ piksel civarında toplanır ve bu da edinme alanının boyutunu sınırlayabilir. Yüksek çözünürlüklü bilgi elde etmek için daha küçük bir piksel boyutu kullanmak mümkündür ve bu örneklerde başarıyla kullandığımız en küçük piksel boyutu 1,4 ş/ pikseldir (veriler gösterilmemiştir). Sürüklenme, daha küçük bir piksel boyutunda daha belirgin olacaktır ve yalnızca çalışmada çözünürlüğü en üst düzeye çıkarmanın önemli olduğu ince (<100 nm) lameller için gerçekten uygundur. Şekil 6: Eğim serisinin elde edileceği erişilebilir ilgi bölgelerinin seçilmesi (A) Düşük büyütmeli bir TEM haritasının, siyah bir arka plan üzerinde altı beyaz çentik (kırmızı oklar) olarak görünen lameller içeren bir bölgeyi gösteren bir bölümü. Beyaz kareler kırık karbon filmidir. (B) Hasarlı ve saptırılmış bir lamelin orta büyütme haritası. Lamelin (FE) ön kenarında organoplatin kaplama kopmuştur (1). Lamelin merkezinde berrak bir kristal buz parçası vardır (2). İyon ışını, lamelin (BE) arka kenarından geçemedi, çünkü buz ızgara çubuklarının yanında çok kalın. Lamelin sadece küçük bir kısmı BE’deki (3) çevreleyen buzdan arındırılmıştır ve bir kama oluşturur. Kalınlık ayrıca rafların lamellerin (4) üzerinde kesilmesine neden olmuştur, bu da büyük olasılıkla TEM’de yüksek eğimde hücrelerin görünümünü engelleyecektir. (C) TEM’de görülen bütün bir lamelin orta büyütmeli montajı. Lamellerden eğim serileri toplanırken kaçınılması gereken tipik problemler veya bölgeler şunlardır: yüzey kirliliği (SC) ile kaplı, organoplatin kaplama (OP, sarı) ile kaplanmış, çatlakların yakınında (CR ve siyah oklar), biyolojik materyaldeki yoğunluk değişiklikleri nedeniyle perdeleme ile (CU ve mavi braketler içindeki bölge) ve organoplatin kattaki kırılmalarla zayıflamış alanlar (yeşil daire). Eğim serisi alımı için erişilebilen tek bölge, iki siyah kesikli kutunun (1 ve 2 etiketli) içindeki alanlardır. Yüzey kirliliğinin ilgili bölgeyi veya netleme alanını gizlemediğinden emin olmak için görüntü yüksek eğimli olarak kontrol edilmelidir. (D) Çok daha temiz bir lamelin orta büyütmeli montajı, ancak parlatma sırasında organoplatin katın (yeşil daire) incelmesinden kaynaklanan çatlaklara (CR) sahiptir. Burada, ilgilenilen bölge, lamel içinde gözlenen hücre tipi ile vurgulanır; bu durumda, karbon tabakasının (turuncu) arkasında, lamelin arkasına (siyah kesikli kutu) doğru konumlandırılmış bireysel merozoitlerdir. Ölçek çubukları, 3 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 7: FIB ile öğütülmüş lamelden kriyo-ET verilerinin elde edilmesi. (A) Yakın zamanda bir P. falciparum merozoit tarafından istila edilmiş bir kırmızı kan hücresi içeren bir lamel bölgesinin mikrografisi. (B) ‘de aynı görüntü, kırmızı kan hücresinin sınırını (kırmızı), bir dizi çift duvarlı hücre içi vezikülü (sırasıyla iç ve dış zarlar için mor ve mavi) ve konakçı hücreden türetilen ikinci bir zarla (sarı) çevrili merozoiti (yeşil) göstermek için ek açıklamalıdır. Kara kutu, bir eğim serisinin edinildiği alanı gösterir. Ölçek çubuğu, 500 nm. (C) XY düzleminde, merozoitin apikal ucunda ve (D) ek açıklamasında elde edilen 8x bağlanmış bir tomogramdan (2.4 ş/ piksel) görüntülenen ortalama 20 merkezi dilim, hücreyi çevreleyen iki zarı (yeşil ve sarı) ve elektron yoğun mantar şeklindeki bir özellik (mor) ile ilişkili olan merozoitin tepesinde (mavi) istiflenmiş dört zarı gösterir. Kırmızı bir ok, tepedeki membran yığınlarının birleşme noktasını ve mantar şeklindeki özelliği gösterir (ayrıca F, i bölümünde de gösterilmiştir). Siyah bir ok, merozoit plazma zarı ile parazit içindeki çok katmanlı veziküllerden biri arasındaki füzyon olayını gösterir (ayrıca bölüm F, ii’de de gösterilmiştir). Konakçı kırmızı kan hücresi zarı (kırmızı) gösterilir ve siyah kesikli bir çizgi, (E) ‘de gösterilen XZ düzleminde görüntülenen bir kesitin konumunu gösterir. Enine kesitteki (E) özellikler renklidir ve membranlara işaret eden renkli oklarla (D) parçasındaki ile aynı şekilde etiketlenir. Siyah bir ok, frezelemeden sonra lamele uygulanan bir püskürtme katının konumunu ve belirtilen lamellerin kalınlığını gösterir. Parçalar için (C-E), ölçek çubuğu, 500 nm. (F) (C) bölümündeki kırmızı ve siyah ok başlıkları ile gösterilen, merozoitin (i) tepesindeki membran yığınının lipit çift katmanlarındaki tanımı ve çok katmanlı vezikül ile merozoit plazma zarı arasındaki füzyon olayını gösteren özelliklerin daha ayrıntılı bir görünümü. Ölçek çubuğu, 75 nm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Çalışmanın ana odağı, merozoit çıkış yolunu incelemektir. P. falciparum Ancak, çalışmada kullanılan hücre popülasyonunun hiçbir zaman tamamen homojen olamayacağı göz önüne alındığında, genellikle lameller içindeki hücre gelişiminin diğer aşamaları gözlenmiştir. Burada gösterilen örnek (Şekil 7) yakın zamanda bir tarafından istila edilmiş bir kırmızı kan hücresi içerir. P. falciparum parazit (merozoit). Kullanılan lamel 240 nm kalınlığındaydı ve ızgara, TEM’e yerleştirilmeden önce argon atmosferinde platin ile hafifçe püskürtülmüştü, bu da normalde beklenenden biraz daha az kontrastla sonuçlandı. Kırmızı kan hücresi zarı, hücreyi çevreleyen bütünüyle izlenebilir. Kırmızı kan hücresi içinde üç kapalı zara bağlı yapı, her biri çift zarla çevrili iki vezikül ve ampul şeklinde bir özellik (en geniş kısımlarında 1.2 μm x 0.9 μm) vardı, bu da bir merozoit (Şekil 7A-B). İki vezikülün içeriği, kırmızı kan hücresinin içeriğinin aksine benzer görünüyordu, bu da bu veziküllerin hemoglobin içerebileceğini düşündürüyordu. İnvazyon sonrası konakçı kırmızı kan hücresinde veziküllerin varlığı daha önce gözlenmiştir45. Merozoitteki rhoptries adı verilen salgı organellerinden lipitlerin ve diğer virülans faktörlerinin salgılanmasından kaynaklandığı düşünülmektedir ve bunlar istila sırasında konakçı kırmızı hücreye boşalmaktadır. Merozoy, en içte muhtemelen görünür bir yüzey kaplaması bulunmayan merozoitin doğal plazma zarı olan ve en dışta merozoiti istila ederken saran konakçı kırmızı hücre zarından türetilmesi gereken, yakından ilişkili iki membranla çevrilidir. Merozitin sitoplazması, birçok çok katmanlı vezikül ve tepedeki bir zar yığınına bitişik elektron yoğun mantar şeklinde bir özellik içerir. Bu bölge üzerinden elde edilen bir eğim serisi (2,4 ş/ piksel), mantar şeklindeki özelliğe (Şekil 7C-E). Çarpıcı bir şekilde, bu morfoloji, olgun bir merozoitin apikal ucundaki organellerin ve hücresel yapıların normal düzenlemesinden oldukça farklıdır. Bunu değerlendirmek için, olgun bir merozoit üzerinde apikal uç üzerinde karşılaştırmalı bir eğim serisi (2.74 ş/ piksel), dalma dondurma ve frezelemeden önce E64 ile muamele edilmiş bir şizonttan elde edilmiştir (Şekil 8). Bu, bir merozoitin apikal ucunun, hücrenin apikal ucundaki üç kutupsal halka kümesi içine yerleştirilmiş ve mikronem adı verilen bir dizi daha küçük salgı organeli ile çevrili rhoptries adı verilen iki belirgin kulüp şeklindeki salgı organeli içerdiğini göstermektedir. En içteki polar halka, istilaya neden olan motor proteinleri içeren iç membran kompleksi adı verilen merozoit plazma zarının altında yatan çift membranlı bir yapıya bağlanır. İnvazyon sırasında salgı organellerinin içeriğinin merozoit yüzeyine ve konakçı kırmızı kan hücresine boşaltıldığı, merozoitlerin konakçı kırmızı hücrelere bağlanmasını kolaylaştırdığı ve istilayı tetikleyen motor kompleksini başlattığı gösterilmiştir45. Buradaki veriler, istiladan sonra, merozoitin roptrilere, mikronemelere veya kutupsal halkalara benzeyen gözlemlenebilir yapılar içermediğini göstermektedir, bu da merozoitin apikal ucunun morfolojisinin çarpıcı bir şekilde değiştiğini düşündürmektedir. İstiladan önce rhoptrilerin füzyonu daha önce TEM tarafından sabit, oda sıcaklığında bölümlerin gösterilmesi46, istila sonrası durum merozoitimizde gözlemlediğimiz mantar şeklindeki özelliğin üretimi ile tutarlıdır. Bu özelliğe bağlı membran yığınları daha önce gözlemlenmemiştir ve yeni istila edilen merozoitte mevcut bir IMC belirtisi olmadığından, membran yığınlarının istila tamamlandıktan sonra kalan IMC makinesinin kalıntıları olabileceğini varsayıyoruz, ancak bu doğrulanmaya devam ediyor. Şekil 8: FIB ile öğütülmüş bir lamelin kriyo-ET’si ve plastik kesitlerin TEM ile olgun merozoitlerin apikal ucu. (A) Olgun bir merozoitin apikal ucunun tipik morfolojisini gösteren 230 nm kalınlığındaki bir lamelden 8x bağlanmış bir tomogramdan (2.74 ş/ piksel) ortalama 20 merkezi dilim. Şizontlar, dalma donmasından önce E64 ile muamele edildi, böylece PV zarı yırtıldı ve merozoitler konakçı kırmızı hücre içinde bulundu. (B), (A) ile aynı şeyi gösterir, ancak konakçı kırmızı kan hücresi zarını (RCM, kırmızı), merozoit plazma zarını (yeşil), iç zar kompleksini (IMC, mor), polar halkaları (PR, siyah), mikronemleri (M, sarı), rhometrileri (R, gri) ve nükleer zarfı (NE, mavi) belirtmek için ek açıklamalarla gösterir. Tomogramın bu bölgesinde düzlem dışı olan komşu bir merozoit yeşil bir üçgenle gösterilir. Ölçek çubuğu, 200 nm. (C) KriyoET tarafından gözlenen hücresel özellikler, plastik bölümlerde korunan şizontların TEM’inden gelenlerle tutarlıdır. Benzer hücresel özellikler, PV membran rüptüründen önce çıkışı durduran, bileşik 2 ile muamele edilmiş bir şizonttan olgun bir merozoitte belirtilir. Ölçek çubuğu, 500 nm. (D) Parçalardaki hücresel özellikleri gösteren bir merozoitin açıklamalı şeması (A-C). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın. Dikdörtgen frezeleme desenleri arasındaki korunan bölgenin kalınlığı (μm) 30 kV’da nomik iyon ışın akımı (pA) 3 300 1.5 100 0.75 50 0.3 30 0.2 – 0.06 (son parlatma) 30* Tablo 1: İnce lamel üretmek için frezeleme stratejisi. Kademeli frezeleme, korunan bölgenin kalınlığına karşılık gelen iyon ışını akımını azaltarak gerçekleştirilir. Bu, numune ısıtmasını sınırlayarak sapmayı önler. * Parlatma, lamellerin her iki tarafından eşit ısı uygulamak için paralel olarak yapılmalı, böylece son kalınlıklarına ulaştıklarında bükülme veya eğilme riski azaltılmalıdır. Diğer adımlar, bir sonraki ışın akımına geçmeden önce deseni lamelin üstünde ve daha sonra lamelin altında frezeleyerek sırayla yapılabilir. Frezeleme konumlarını bulmak için ızgaranın incelenmesi, numune ısıtmasını en aza indirmek için 1,5 pA ışın akımında yapılmalıdır. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.