Preparazione di lamelle da campioni biologici vitreali utilizzando un microscopio elettronico a scansione a doppio raggio per la tomografia crioelettronica

Preparazione degli schizonti di P. falciparum per il congelamento a tuffoGli inibitori composti 2 ed E64 sono usati per bloccare gli schizonti in diversi stadi di uscita, generando una popolazione arricchita di schizonti per studi successivi. Questo è importante perché senza una tecnica correlativa complementare, la fresatura di specifici bersagli subcellulari o tipi di cellule è impegnativa in quanto il processo è essenzialmente cieco. Il composto 2 è un inibitore della protein chinasi che blocca l’uscita prima della rottura del vacuolo. Gli schizonti possono essere sincronizzati sul composto 2 per 4 ore, quindi lavati con mezzi composti 2-free per rimuovere l’inibitore, a quel punto gli schizonti matureranno e usciranno dopo circa 30 minuti. In alternativa, gli schizonti sincronizzati composti 2 possono essere lavati in E64, un inibitore irreversibile della proteasi della cisteina ad ampio spettro, e incubati per circa 1 ora per bloccare l’uscita dopo il punto di rottura del vacuolo, ma prima della rottura della cellula ospite. La morfologia e l’omogeneità degli schizonti trattati devono essere verificate mediante strisci di sangue colorati con Giemsa prima del congelamento a immersione (Figura 1). Gli schizonti possono essere immersi in uno di questi stati usando il metodo descritto in questa pubblicazione. Figura 1: La morfologia degli schizonti composti 2 e E64-stalled di P. falciparum mediante strisci di sangue colorati di Giemsa. (A) In presenza del composto 2 il vacuolo parassitoforo (PV) è densamente ricco di merozoiti (cerchi viola) con un singolo gruppo di cristalli di emozoina (cerchio marrone scuro). Il confine tra il PV e l’emoglobina circostante nel globulo rosso ospite (hRBC) (banda grigia) è ben definito, così come la membrana hRBC. (B) In presenza di E64, la membrana PV viene rotta e i merozoiti si diffondono all’interno dell’hRBC. Ogni schizonte contiene ancora un singolo gruppo di cristalli di emozoina. La membrana della cellula ospite è permeabile e parzialmente collassata, quindi nessuna emoglobina è visibile all’interno della periferia cellulare e il confine della membrana hRBC non è facilmente visibile. Barra scala, 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Ottimizzazione del congelamento a tuffoUna serie di griglie con diverse dimensioni dei fori sono state testate durante l’ottimizzazione delle condizioni di blotting per i globuli rossi infetti da P. falciparum, tra cui 2/2, 3/3, 3,5/1 e 5/2 (quadrato) Holey carbonio su griglie a maglia 200 in oro e rame. Le griglie di ricerca in rame a maglie 200 con film di carbonio Holey 2/4 forniscono uno strato di cellule adeguatamente spesso per fresare lunghe lamelle vitreali. Fori più grandi o più piccoli hanno generalmente portato a strati cellulari troppo sottili o spessi, rispettivamente (Figura 2A-C). Con 2/4 di carbonio holey, gli schizonti vengono tirati attraverso i fori da 2 μm cancellando la griglia dal retro (lato non carbonioso), con conseguente fuoriuscita delle cellule sopra e sotto il film di carbonio. Il tratto di carbonio di 4 μm tra i fori si traduce in una striscia di carbonio che attraversa il centro della maggior parte delle lamelle risultanti, aggiungendo forza. Le griglie del Finder sono più adatte per scopi di correlazione e vagliatura44, ma è necessario prestare attenzione per assicurarsi che i numeri / lettere nel design della mesh non siano troppo grandi in quanto ciò bloccherà le aree per la fresatura. Il tempo di tamponamento su uno stantuffo manuale è di circa 20 s, ma il punto esatto in cui interrompere l’asciugatura è stato giudicato ad occhio quando la goccia di liquido prelevata dalla griglia ha smesso di diffondersi sulla carta da filtro. Era necessario un bordo strappato per rompere la tensione superficiale della goccia per avviare il processo di asciugatura. In questo studio non è stato utilizzato un congelatore automatico a tuffo, ma un punto di partenza ragionevole per questo campione sarebbe quello di utilizzare lo stesso volume di celle e lo stesso tipo di griglia utilizzati per uno stantuffo manuale, assicurandosi di asciugare le griglie dal retro in condizioni di elevata umidità (~ 70%) e temperatura ambiente (~ 25 ° C). I tempi e le condizioni di blotting dovrebbero essere ottimizzati per il particolare sistema automatizzato utilizzato. Le griglie congelate a tuffo degli schizonti di P. falciparum sono state schermate da un microscopio ottico dotato di un crio-stadio piuttosto che da TEM, perché il campione non era trasmissibile agli elettroni. Per i campioni più sottili, le griglie possono essere vagliate da TEM (intero atlante della griglia con ingrandimento ~ 150x) prima del trasferimento del campione nel cryoFIB-SEM, che può essere un prerequisito per accedere a una struttura nazionale. Particolare attenzione dovrebbe essere prestata al gradiente dello spessore del ghiaccio attraverso la griglia e anche all’interno dei singoli quadrati della griglia. I quadrati della griglia buoni dovrebbero essere spessi una cella o colpire il film di carbonio al loro centro (Figura 2C). Ciò evita la fresatura nel ghiaccio più spesso contro le barre della griglia attorno al bordo del quadrato della griglia e assicurerà che il fascio di ioni si rompa sopra e sotto lo strato cellulare, producendo una lamella libera piuttosto che un cuneo. Una volta ottimizzate le condizioni di blotting riproducibile e di congelamento a tuffo, lo screening di solito non è più necessario prima della fresatura FIB. Figura 2. Analisi della distribuzione cellulare su griglie di schizonti di P. falciparum congelati a tuffo mediante microscopia crioleggera. (A) Un esempio di ghiaccio troppo spesso attraverso un quadrato della griglia mediante microscopia crioleggera, oscurando le cellule e il film di carbonio. Barra di scala, 10 μm. (B) Un esempio della dimensione del foro (griglia di rame a 300 maglie con pellicola di carbonio Holey quadrata 5/2) è troppo grande per le cellule, risultando in uno strato molto sottile di materiale biologico circondato da regioni vuote senza ghiaccio. Griglie come questa producono lamelle molto corte e instabili. Barra di scala, 10 μm. (C) Un esempio di buona distribuzione delle celle su una griglia di rame a 200 maglie con film di carbonio holey a 2/4. Questi schizonti sono stati trattati con inibitore E64. Le grandi cellule (scatola rossa, ~ 5 μm di diametro) con una periferia ben definita sono globuli rossi infetti che hanno ancora una membrana vacuola intatta. I gruppi di piccole cellule (scatola blu, ~ 1 μm) sono i singoli merozoiti contenuti all’interno di un globulo rosso ospite parzialmente collassato. Ogni schizonte ha una macchia nera al centro, che indica la posizione dei cristalli di emozoina (vedi Figura 1 per ulteriori dettagli). La differenza nella morfologia cellulare non è così facile da vedere una volta all’interno del cryoFIB-SEM; Pertanto, il pre-screening mediante microscopia crioleggera è utile fino al raggiungimento di condizioni di blotting riproducibili. La copertura delle celle attorno ai bordi del quadrato della griglia accanto alle barre della griglia (aree tratteggiate di bianco) è troppo spessa per la fresatura. La regione più sottile al centro del quadrato della griglia (area tratteggiata di giallo) è un luogo ideale per fresare, estendendo la lamella nello strato circostante di cellule. Barra di scala, 6 μm. (D) Immagine di un cerchio autogrid specifico per crioFIB con due segni neri, uno all’interno della sezione di taglio (parentesi nera) e l’altro opposto, a ore 12 e ore 6. La freccia nera rappresenta la direzione di fresatura. (E) Quando le griglie vengono caricate nella cassetta del caricatore automatico, i segni devono essere equidistanti su entrambi i lati delle pinzette di carico, con il risultato che le lamelle giacciono perpendicolarmente all’asse di inclinazione del palco. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Marcatura di cerchi autogrid specifici per crioFIB per la tomografiaTipicamente, le griglie vengono agganciate ai cerchi della griglia automatica prima della fresatura per facilitare la manipolazione e fornire rigidità, che protegge le lamelle da danni durante le successive fasi di trasferimento. I cerchi autogrid specifici di CryoFIB sono stati progettati con una funzione di taglio per aiutare ad accedere a più della faccia della griglia durante la fresatura. È importante orientare la direzione di fresatura perpendicolarmente all’asse di inclinazione del TEM in modo che l’acquisizione della serie di inclinazione proceda ruotando la lamella lungo la sua lunghezza. Ciò garantisce che le alte pareti della trincea che circonda la lamella non oscurino le informazioni biologiche mentre la griglia è inclinata. Tipicamente, il cerchio della griglia automatica è contrassegnato per aiutare con l’allineamento visivo all’interno della navetta cryoFIB-SEM e successivamente durante il caricamento del TEM. Per questi campioni, a ore 12 e a ore 6 sono stati applicati due segni con un marcatore indelebile (vedi Tabella dei materiali), uno al centro della sezione di taglio dell’anello della clip e il secondo direttamente opposto (Figura 2D). Durante il caricamento nel TEM (vedere Tabella dei materiali), entrambi i segni devono essere visibili su entrambi i lati delle pinzette di caricamento e allineati di 90° al bordo delle pinzette (Figura 2E). Va notato che il produttore consiglia di allineare le griglie utilizzando i punti incisi sui cerchi della griglia automatica, poiché alcuni inchiostri in prossimità del fascio ionico possono interferire con la fresatura. Le griglie ritagliate possono essere schermate al microscopio ottico con una cassetta modificata per un crio-stadio, che può essere utile per verificare che il processo di clipping non abbia distrutto il film di carbonio della griglia. A seconda della cassetta del campione, le griglie non tagliate possono anche essere fresate, ma è necessario prestare molta attenzione durante il trasferimento dal crioFIB-SEM al TEM per limitare qualsiasi flessione della griglia in quanto ciò romperebbe le lamelle. Le griglie non agganciate possono essere caricate nel TEM da crio-supporti ad ingresso laterale, ma c’è un’alta probabilità che le lamelle si rompano se il clipping viene eseguito dopo la fresatura. Rivestimento organoplatinoIl rivestimento organoplatino viene eseguito su una o entrambe le griglie una volta caricate nel cryoFIB-SEM. L’ago del sistema di iniezione di gas (GIS) viene inserito nella camera sopra il campione per dirigere un flusso di vapore organoplatino attraverso la superficie della griglia da una fonte riscaldata per un tempo prestabilito. Il vapore si condensa su superfici fredde e forma uno strato solido (~ 2 μm di spessore). L’integrità di questo strato è fondamentale per consentire la fresatura di lamelle uniformemente sottili. Le condizioni ottimali di applicazione per il rivestimento organoplatino sono solitamente predeterminate dal produttore dello strumento, ma potrebbe essere necessaria una certa ottimizzazione. La maggior parte dei sistemi allinea l’ago GIS vicino alla direzione di fresatura o perpendicolarmente alla direzione di fresatura, a seconda della geometria delle porte sulla camera e dei limiti di rotazione dello stadio. Diverse impostazioni possono essere provate rivestendo la griglia, fresando una piccola regione, inclinando il palcoscenico e misurando lo spessore del rivestimento mediante SEM. Oltre alla configurazione del cryoFIB-SEM stesso, una serie di altri fattori possono influenzare l’applicazione del rivestimento organoplatino, tra cui 1) la topografia del campione, 2) la contaminazione superficiale sulla griglia e 3) la riproducibilità del flusso di vapore dall’ago GIS. Poiché il flusso GIS è direzionale, la topografia irregolare può causare la rimozione di regioni all’ombra delle cellule o la contaminazione superficiale o un rivestimento più sottile. Ciò può portare a un collasso dello strato di organoplatino durante la lucidatura (Figura 3). Quando si seleziona un’area da fresare, è necessario essere consapevoli della topografia circostante, ad esempio, grandi contaminazioni superficiali, grumi di cellule o carbonio rotto che sporgono dalla superficie della griglia fino a un paio di quadrati di griglia di distanza, possono bloccare il flusso di vapore, creando un’ombra di organoplatino più sottile che può indebolire una lamella. Inoltre, dovrebbero essere evitate particelle molto piccole di contaminazione superficiale vicino al bordo anteriore della lamella in quanto possono staccarsi durante la fresatura, lasciando una macchia indebolita di ghiaccio nudo che può causare lo sviluppo di un foro nella lamella durante la lucidatura. Infine, se la fresatura è iniziata e il rivestimento organoplatino sembra instabile, rivestire di nuovo, più a lungo, o passare su una griglia di riserva. Figura 3: Un rivestimento organoplatino di buona qualità è fondamentale per ottenere lamelle sottili e uniformemente fresate. (A) Una micrografia del bordo anteriore di una lamella in cui il rivestimento organoplatino (OP, giallo) è stato applicato in modo troppo sottile, causando un foro nel bordo anteriore della lamella che si è sviluppato durante la lucidatura (cerchio verde) e una fresatura irregolare su tutta la larghezza della lamella (striature). La superficie organoplatino è stata tagliata dal fascio ionico, portando a uno spruzzo di materiale dietro il bordo anteriore del rivestimento (linea tratteggiata gialla). (B) Il rivestimento organoplatino (OP) è stato applicato più spesso, ottenendo una lamella più uniformemente assottigliata. L’integrità del mantello è preservata su tutta la larghezza della lamella e l’interfaccia tra il rivestimento organoplatino e il materiale biologico vetrificato è ben definita (linea tratteggiata gialla). Lo strato di carbonio può essere visto correre attraverso la parte posteriore della lamella (arancione). Barre di scala, 1 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Valutazione della qualità della griglia nel cryoFIB-SEM e del processo di fresaturaUna volta che le griglie sono state trasferite al cryoFIB-SEM, l’integrità del film di carbonio e la distribuzione delle celle sulle griglie possono essere vagliate da SEM (Figura 4A-C). I gradienti di ghiaccio, le posizioni delle barre della griglia e la posizione dei numeri di griglia sulle griglie del mirino possono essere controllati da SEM a basso ingrandimento a 30 kV (Figura 4B), ma la tensione dovrebbe essere ridotta a 5 kV mentre si individuano posizioni di fresatura ad alto ingrandimento e si monitora il processo di fresatura per aumentare il contrasto dalla topografia superficiale. Figura 4: Valutazione della qualità della rete e localizzazione delle aree da fresare nel cryoFIB-SEM . (A) Una panoramica a basso ingrandimento di una rete a 5 kV tramite il SEM. La sezione di taglio del bordo della griglia automatica è visibile nella parte inferiore dell’immagine. Barra di scala, 0,5 mm. (B) La stessa griglia a 30 kV di SEM, che mostra aree di ghiaccio più spesso (quadrati della griglia più scuri) e ghiaccio più sottile (quadrati della griglia più chiari). L’inserto mostra la regione nella casella, con frecce che indicano la numerazione sulla griglia del finder, che è visibile a 30 kV. Barra di scala, 0,5 mm. (C) Una panoramica a medio ingrandimento di due quadrati della griglia che valutano la distribuzione delle celle sul film di carbonio e la posizione delle barre della griglia. Barra di scala, 50 μm. (D) La disposizione dei modelli di fresatura per il primo taglio ad alto ingrandimento (vista del fascio ionico a 1,5 pA e 30 kV). La regione rossa (3 μm di spessore) è protetta, mentre le regioni gialle saranno ablate dal fascio ionico. La linea tratteggiata di bianco indica la posizione della lamella finale. Barra scala, 10 μm. (E) Una vista ad alto ingrandimento a 3 kV tramite il SEM di una lamella levigata spessa 200 nm (10 μm di larghezza x 15 μm di lunghezza). La perdita di contrasto all’interno della lamella a 3 kV indica che è stato raggiunto uno spessore adeguato. Il bordo frontale bianco brillante è lo strato organoplatino rimanente che viene applicato alla griglia tramite il GIS prima della macinazione. Barra della scala, 5 μm. (F) La stessa lamella di (E) vista usando il fascio ionico a 30 kV e 1,5 pA. La sottile linea bianca attraverso il quadrato nero (freccia bianca) è il rivestimento organoplatino rimanente sul bordo anteriore della lamella. Barra scala, 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Una regione da fresare viene selezionata disponendo una coppia di motivi rettangolari su entrambi i lati di una regione protetta ad alto ingrandimento (~ 7.000x per gli schizonti) nella vista del fascio ionico (Figura 4D). È fondamentale che nessuna particella di contaminazione superficiale sia attaccata vicino alla regione di macinazione in quanto potrebbero aver oscurato l’applicazione dello strato protettivo di organoplatino. È anche importante che la topografia della regione sia adatta a sostenere i lati della lamella una volta raggiunto il suo spessore finale. Per gli schizonti malarici (dimensione della cella: ~ 5 μm di diametro x 2 μm di spessore, forma a disco) è possibile fresare lamelle larghe tra 7-20 μm. Se lo strato cellulare è adeguatamente spesso, le lamelle di solito finiscono per ~ 10-15 μm di lunghezza, catturando più cellule sopra e sotto lo strato di carbonio (Figura 4E-F). Ci si può aspettare di fresare 5-10 lamelle in una sessione di 8 ore (6-7 h di fresatura e 1-2 ore di lucidatura). Questo varierà a seconda dello spessore del campione e della larghezza delle lamelle, con campioni più spessi e lamelle più larghe che richiedono più tempo per macinare. Anche le griglie danneggiate possono essere fresate in quanto richiede solo una manciata di buoni quadrati della griglia per generare una serie di lamelle (Figura 5A). Inoltre, se il campione è più sottile del previsto, ad esempio, a causa di un’eccessiva macchiatura o di una variazione dell’ematocrito della coltura, le lamelle più corte possono essere fresate in tempi relativamente brevi; tuttavia, la loro lunghezza inferiore limiterà l’area disponibile per la raccolta dei dati nel TEM (Figura 5B). Figura 5: Determinazione del momento in cui è stato raggiunto lo spessore finale della lamella durante la fresatura. (A) Panoramica a basso ingrandimento di una griglia di SEM a 5 kV che mostra il danno al carbonio durante il clipping. Le aree non danneggiate contenevano campioni molto sottili a causa di over-blotting; tuttavia, era ancora possibile fresare sei lamelle su questa griglia (la regione all’interno del contorno tratteggiato di bianco) in una sessione di un’intera giornata sul crioFIBSEM. Barra della scala, 0,5 mm. (B) Una lamella corta (~10 μm di larghezza x 3 μm di lunghezza, escluso lo strato di organoplatino) prodotta da questa griglia (SEM a 3 kV), che forniva ancora due regioni da cui raccogliere le serie inclinate. Barra della scala, 25 μm. (C) Una serie di immagini SEM (3 kV) di una lamella durante la fase finale di lucidatura che mostrano come il contrasto viene perso nella lamella mentre viene assottigliata (spostandosi da sinistra a destra). La linea nera scura attraverso il centro della lamella in tutte le immagini è una striscia di pellicola di carbonio dalla griglia. Le cellule di fronte a questa regione sono state vetrificate sopra il film di carbonio e le cellule dietro questa regione sono state vetrificate sotto il film di carbonio. La fresatura è stata interrotta quando lo strato organoplatino sul lato sinistro del bordo anteriore della lamella stava per perdere l’integrità strutturale. Questo punto di arresto era prima che l’intera lamella fosse portata a uno spessore uniforme, motivo per cui c’è ancora del materiale a contrasto più elevato nella parte posteriore della lamella. (D) Un esempio di un percorso di lucidatura basato sulle lamelle fresate sulla griglia di cui al punto (A). Un percorso di lucidatura dovrebbe iniziare dalle lamelle più vicine alla sorgente FIB, allontanandosi dalla sorgente FIB per limitare la rideposizione di materiale fresato sulla superficie delle lamelle. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Durante la lucidatura, lo spessore finale di una lamella dipenderà dalla struttura del campione nella regione da fresare, dall’integrità dello strato organoplatino e dal tempo disponibile. Idealmente, il campione dovrebbe essere assottigliato fino a quando il contrasto non viene perso su tutta la superficie della lamella da SEM a 3 kV, suggerendo che è uniformemente trasparente agli elettroni e spesso circa 150-200 nm (Figura 5C). Tuttavia, potrebbe essere necessario interrompere la fresatura prima di questo punto se lo strato di organoplatino sviluppa un foro o la lamella inizia a piegarsi. In questo caso, la lamella può essere ancora abbastanza sottile nella parte anteriore e rimanere utile per la tomografia. Al contrario, è possibile assottigliare oltre la fase di perdita di contrasto se la lamella sembra stabile, rendendola ancora più sottile avvicinando i modelli di fresatura (~ 100 nm o meno). Ciò dipenderà dallo spessore, se necessario, per il flusso di lavoro a valle. È necessaria un’immagine SEM a basso ingrandimento per pianificare un percorso di lucidatura, iniziando più vicino alla sorgente del fascio ionico e lavorando lontano (Figura 5D). La direzione del percorso di lucidatura è importante per evitare la rideposizione di materiale ablato su lamelle già finite. Raccolta ed elaborazione dei dati della serie inclinataUna volta caricato nel TEM, un montaggio a griglia completa a basso ingrandimento (~150x) identificherà le posizioni delle lamelle, che possono essere correlate all’immagine SEM a basso ingrandimento scattata alla fine della fresatura. Per gli schizonti congelati a tuffo, la maggior parte della griglia non è trasparente agli elettroni, quindi le posizioni delle lamelle appaiono come tacche bianche su uno sfondo nero (Figura 6A). L’angolo delle lamelle rispetto all’asse di inclinazione del microscopio dovrebbe essere notato, poiché più di ~ 10 ° di distanza dalla perpendicolare potrebbe rendere difficile l’acquisizione della serie di inclinazione. Un montaggio a medio ingrandimento (~ 1.500x) nella posizione di ciascuna lamella fornirà una panoramica del contenuto biologico e verificherà la presenza di danni da trasferimento, ghiaccio cristallino o eccessiva contaminazione superficiale (Figura 6B-D). Questo dovrebbe anche essere controllato ad alta inclinazione per garantire che nessuna contaminazione superficiale oscuri l’acquisizione o l’area di messa a fuoco. La scelta di una regione di acquisizione dipenderà non solo dalle caratteristiche biologiche, ma anche dall’integrità strutturale del ghiaccio nella regione circostante, ad esempio, evitando crepe, poiché queste regioni andranno alla deriva, o aree con cortina eccessiva, dove una lamella avrà uno spessore variabile. Prima di acquisire una serie di inclinazione, una pre-inclinazione di ±10° viene applicata alla griglia per rendere il piano delle lamelle (non la griglia) perpendicolare all’asse ottico. La direzione della pre-inclinazione può essere determinata dalla posizione del bordo anteriore delle lamelle (cercando il rivestimento organoplatino sinistro) nel montaggio a medio ingrandimento. Per il TEM usato qui (300 kV Titan Krios), se i bordi anteriori delle lamelle puntavano verso l’alto nella mappa, ciò richiedeva una pre-inclinazione di +10° e se puntavano verso il basso, ciò richiedeva una pre-inclinazione di -10°. Ogni griglia può essere diversa a causa dell’orientamento in cui sono stati prelevati nelle pinzette e inseriti nel caricatore automatico (sezione di taglio rivolta a sinistra o a destra, produce una rotazione di 180°). Un’ultima considerazione è la dimensione dei pixel. Di routine, le serie tilt-series sono raccolte intorno a 2,5-7 Å / pixel, tenendo conto della dimensione della caratteristica di interesse, della risoluzione target dei dati tomografici risultanti e della superficie della lamella, che può limitare la dimensione dell’area di acquisizione. È possibile utilizzare una dimensione di pixel più piccola per ottenere informazioni ad alta risoluzione e il più piccolo che abbiamo usato con successo su questi campioni è 1,4 Å / pixel (dati non mostrati). La deriva sarà più evidente a una dimensione di pixel più piccola ed è davvero adatta solo per lamelle sottili (<100 nm) in cui la massimizzazione della risoluzione è importante nello studio. Figura 6: Scelta delle regioni di interesse accessibili da cui acquisire la serie di inclinazione (A) Sezione di una mappa TEM a basso ingrandimento che mostra una regione contenente lamelle, che appare come sei tacche bianche su sfondo nero (frecce rosse). I quadrati bianchi sono film di carbonio rotto. (B) Una mappa di medio ingrandimento di una lamella danneggiata e devitrificata. Sul bordo anteriore della lamella (FE) il rivestimento organoplatino si è staccato (1). C’è una chiazza chiara di ghiaccio cristallino al centro della lamella (2). Il fascio ionico non è riuscito a sfondare sul bordo posteriore della lamella (BE) perché il ghiaccio è troppo spesso vicino alle barre della griglia. Solo una piccola porzione della lamella è libera dal ghiaccio circostante al BE (3), creando un cuneo. Lo spessore ha anche causato il taglio di scaffali sopra la lamella (4), che molto probabilmente bloccherà la vista delle celle ad alta inclinazione nel TEM. (C) Montaggio a medio ingrandimento di un’intera lamella vista nel TEM. I problemi tipici o le regioni da evitare quando si raccolgono le serie inclinate dalle lamelle sono le aree: coperte da contaminazione superficiale (SC), coperte dal rivestimento organoplatino (OP, giallo), vicino a crepe (CR e frecce nere), con tenda dovuta a cambiamenti di densità nel materiale biologico (CU e regione entro parentesi blu) e aree indebolite da rotture nel rivestimento organoplatino (cerchio verde). Le uniche aree accessibili per l’acquisizione della serie inclinabile sono le aree all’interno delle due caselle tratteggiate di nero (etichettate 1 e 2). La vista deve essere controllata ad alta inclinazione per assicurarsi che la contaminazione della superficie non oscuri la regione di interesse o l’area di messa a fuoco. (D) Un montaggio a medio ingrandimento di una lamella molto più pulita, ma che presenta ancora crepe (CR) causate dall’assottigliamento del rivestimento organoplatino (cerchio verde) durante la lucidatura. Qui, la regione di interesse è evidenziata dal tipo di cellula osservato all’interno della lamella, che in questo caso sono i singoli merozoiti, posizionati dietro lo strato di carbonio (arancione) verso la parte posteriore della lamella (scatola tratteggiata di nero). Barre della scala, 3 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 7: Acquisizione dei dati crio-ET da lamelle fresate FIB. (A) Una micrografia di una regione di una lamella contenente un globulo rosso che è stata recentemente invasa da un merozoite di P. falciparum. In (B) la stessa immagine è annotata per mostrare il confine del globulo rosso (rosso), un numero di vescicole intracellulari a doppia parete (viola e blu per le membrane interne ed esterne, rispettivamente) e il merozoite (verde) circondato da una seconda membrana derivata dalla cellula ospite (giallo). Una scatola nera mostra l’area in cui è stata acquisita una serie inclinabile. Barra scala, 500 nm. (C) Una media di 20 fette centrali osservate nel piano XY da un tomogramma binned 8x (2,4 Å / pixel) acquisito all’estremità apicale del merozoite e in (D) la sua annotazione, che mostra le due membrane che circondano la cellula (verde e giallo) e quattro membrane impilate all’apice del merozoite (blu) che sono associate a una caratteristica a forma di fungo denso di elettroni (viola). Una freccia rossa indica la giunzione delle pile di membrane nell’apice e la caratteristica a forma di fungo (mostrata anche nella parte F, i). Una freccia nera indica un evento di fusione tra la membrana plasmatica della merozoite e una delle vescicole multistrato all’interno del parassita (mostrata anche nella parte F, ii). Viene mostrata la membrana dei globuli rossi dell’ospite (rosso) e una linea tratteggiata nera mostra la posizione di una sezione trasversale visualizzata nel piano XZ, mostrata in (E). Le caratteristiche nella sezione trasversale (E) sono colorate ed etichettate come nella parte (D), con frecce colorate che puntano alle membrane. Una freccia nera indica la posizione di uno sputter coat applicato alla lamella dopo la fresatura e lo spessore della lamella in indicato. Per le parti (C-E), barra scala, 500 nm. (F) Una visione più dettagliata delle caratteristiche indicate dalle punte delle frecce rosse e nere nella parte (C), che mostra la definizione nei doppi strati lipidici della pila di membrana all’apice del merozoite (i) e l’evento di fusione tra la vescicola multistrato con la membrana plasmatica della merozoite. Barra scala, 75 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. L’obiettivo principale del lavoro è quello di sezionare il percorso di uscita dei merozoiti in P. falciparum Ma dato che la popolazione di cellule utilizzate nello studio non può mai essere completamente omogenea, spesso sono stati osservati altri stadi di sviluppo cellulare all’interno delle lamelle. L’esempio mostrato qui (Grafico 7) contiene un globulo rosso che è stato recentemente invaso da un P. falciparum parassita (merozoite). La lamella utilizzata aveva uno spessore di 240 nm e la griglia era stata leggermente rivestita di platino in un’atmosfera di argon prima dell’inserimento nel TEM, con conseguente contrasto leggermente inferiore a quello che ci si aspetterebbe normalmente. La membrana dei globuli rossi potrebbe essere tracciata nella sua interezza che circonda la cellula. All’interno del globulo rosso c’erano tre strutture racchiuse legate alla membrana, due vescicole, ciascuna circondata da una doppia membrana e una caratteristica a forma di lampadina (1,2 μm x 0,9 μm nelle sue parti più larghe), che è coerente con il fatto che si tratta di un merozoite (Figura 7A-B). Il contenuto delle due vescicole sembrava essere simile in contrasto con quello del contenuto dei globuli rossi, suggerendo che queste vescicole possono contenere emoglobina. La presenza di vescicole all’interno del globulo rosso ospite dopo l’invasione è stata osservata in precedenza45. Si pensa che derivino dalla secrezione di lipidi e altri fattori di virulenza da organelli secretori chiamati roptri nel merozoite, che si scaricano nel globulo rosso ospite durante l’invasione. Il merozoite è circondato da due membrane strettamente associate, la più interna delle quali è presumibilmente la membrana plasmatica nativa del merozoite, sulla quale non vi è alcun rivestimento superficiale visibile, e la parte più esterna deve derivare dalla membrana globularia ospite che avvolge il merozoite mentre invade. Il citoplasma del merozoite contiene molte vescicole multistrato e una caratteristica a forma di fungo densa di elettroni adiacente a una pila di membrane all’apice. Una serie di inclinazioni acquisite su questa regione (2,4 Å/pixel) mostra che contiene una pila di quattro membrane, che sembrano essere collegate alla caratteristica a forma di fungo (Figura 7C-E). Sorprendentemente, questa morfologia è molto diversa dalla normale disposizione degli organelli e delle strutture cellulari nell’estremità apicale di un merozoite maturo. Per valutare ciò, una serie di inclinazioni comparative (2,74 Å/pixel) sull’estremità apicale su un merozoite maturo è stata ottenuta da uno schizonte che era stato trattato con E64 prima del congelamento a tuffo e della fresatura (Grafico 8). Ciò dimostra che l’estremità apicale di un merozoite contiene due importanti organelli secretori a forma di clava chiamati rhoptries annidati all’interno di una serie di tre anelli polari sulla punta apicale della cellula e circondati da un numero di organelli secretori più piccoli chiamati micronemi. L’anello polare più interno è attaccato a una struttura a doppia membrana che è alla base della membrana plasmatica merozoite, chiamata complesso di membrana interna, che contiene proteine motorie che guidano l’invasione. È stato dimostrato che durante l’invasione il contenuto degli organelli secretori viene scaricato sulla superficie dei merozoiti e nel globulo rosso ospite, facilitando l’attaccamento dei merozoiti ai globuli rossi ospiti e avviando il complesso motorio che guida l’invasione.45. I dati qui mostrano che dopo l’invasione, il merozoite non contiene strutture osservabili che assomigliano a rhoptries, micronemi o anelli polari, suggerendo che la morfologia dell’estremità apicale del merozoite cambia drasticamente. La fusione dei ritmi prima dell’invasione è stata dimostrata in precedenza da TEM di sezioni fisse a temperatura ambiente46, che è coerente con la produzione della caratteristica a forma di fungo che osserviamo nel nostro stato post-invasione merozoite. Le pile di membrane collegate a questa caratteristica non sono state osservate in precedenza e poiché non vi è alcuna indicazione di un IMC presente nella merozoite appena invasa, ipotizziamo che le pile di membrane possano essere i resti del macchinario IMC rimasto dopo che l’invasione è completata, ma questo rimane da confermare. Figura 8: L’estremità apicale dei merozoiti maturi mediante crio-ET di una lamella fresata FIB-e TEM di sezioni plastiche. (A) Una media di 20 fette centrali da un tomogramma binned 8x (2,74 Å/pixel) da una lamella spessa 230 nm che mostra la morfologia tipica dell’estremità apicale di un merozoite maturo. Gli schizonti sono stati trattati con E64 prima del congelamento a tuffo, quindi la membrana PV si è rotta e i merozoiti sono contenuti all’interno del globulo rosso ospite. (B) mostra lo stesso di (A), ma con annotazioni per indicare la membrana dei globuli rossi dell’ospite (RCM, rosso), la membrana plasmatica della merozoite (verde), il complesso della membrana interna (IMC, viola), gli anelli polari (PR, nero), i micronemi (M, giallo), i rometri (R, grigio) e l’involucro nucleare (NE, blu). Una merozoite vicina, che è fuori piano in questa regione del tomogramma è indicata da un triangolo verde. Barra scala, 200 nm. (C) Le caratteristiche cellulari osservate da cryoET sono coerenti con quelle da TEM di schizonti conservati in sezioni plastiche. Caratteristiche cellulari simili sono indicate in un merozoite maturo da uno schizonte che è stato trattato con composto 2, bloccando l’uscita prima della rottura della membrana fotovoltaica. Barra scala, 500 nm. (D) Uno schema annotato di un merozoite che mostra le caratteristiche cellulari in parti (A-C). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Spessore della regione protetta tra i modelli di fresatura rettangolari (μm) Corrente nominale del fascio ionico (pA) a 30 kV 3 300 1.5 100 0.75 50 0.3 30 0,2 – 0,06 (lucidatura finale) 30* Tabella 1: Strategia di fresatura per produrre lamelle sottili. La fresatura graduale viene eseguita riducendo la corrente del fascio ionico corrispondente allo spessore della regione protetta. Ciò limita il riscaldamento del campione, impedendo la devitrificazione. *La lucidatura deve essere eseguita in parallelo per applicare uniformemente il calore alle lamelle da entrambi i lati, riducendo il rischio che si pieghino o si pieghino quando raggiungono il loro spessore finale. Altri passaggi possono essere eseguiti in sequenza, fresando il modello sopra la lamella e poi sotto la lamella, prima di passare alla corrente del fascio successiva. Il rilevamento della griglia per individuare le posizioni di fresatura deve essere eseguito a una corrente del fascio di 1,5 pA per ridurre al minimo il riscaldamento del campione. Clicca qui per scaricare questa tabella.