JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

הכנת Lamellae מדגימות ביולוגיות זגוגית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן כפולה עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונים

Published: August 05, 2021
doi:
10.3791/62350
, , , ,
1Centre for Ultrastructural Imaging,New Hunt’s House, Guy’s Campus, King’s College London, 2Department of Biological Science,Birkbeck College, University of London, 3Electron Bio-Imaging Centre,Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus, 4SLAC National Accelerator Laboratory,Stanford University

Summary

שימוש בכרסום קרן יונים ממוקדת כדי לייצר זגוגית על הרשת מדגימות ביולוגיות קפואות עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונית.

Abstract

מוצג כאן פרוטוקול להכנת cryo-lamellae מרשתות קפואות של אריתרוציטים אנושיים נגועים בפלציפרום, אשר יכול בקלות להיות מותאם עבור דגימות ביולוגיות אחרות. העקרונות הבסיסיים להכנת דגימות, כרסום וצפייה בלמלה משותפים לכל המכשירים וניתן לעקוב אחר הפרוטוקול כמדריך כללי להכנת קריו-למלה ברשת למיקרוסקופ קריו-אלקטרונים (cryoEM) וטומוגרפיית קריו-אלקטרונים (cryoET). רשתות מיקרוסקופיית אלקטרונים התומכות בתאים צוללות-מוקפאות לתוך אתאן נוזלי מקורר חנקן באמצעות מקפיא צלילה ידני או אוטומטי, ולאחר מכן מוקרנות במיקרוסקופ אור המצויד בשלב הקפאה. רשתות קפואות מועברות למיקרוסקופ אלקטרונים סורק בהקפאה המצויד באלומת יונים ממוקדת (cryoFIB-SEM). הרשתות מצופות באופן שגרתי לפני הכרסום, מה שמסייע לפיזור הצטברות המטען במהלך הכרסום. לחלופין, ניתן להשתמש בציפוי סיבובי של קרן אלקטרונית כדי להחיל שכבה של פחמן-פלטינה על הרשתות, שעובייה המדויק ניתן לשלוט בצורה מדויקת יותר. ברגע שנמצא בתוך ה- cryoFIB-SEM ציפוי נוסף של תרכובת אורגנופלטינום מוחל על פני השטח של הרשת באמצעות מערכת הזרקת גז (GIS). שכבה זו מגנה על הקצה הקדמי של הלמלה בזמן הטחינה, ששלמותה קריטית להשגת למלה דקה באופן אחיד. אזורי עניין מזוהים באמצעות SEM והכרסום מתבצע בצורה הדרגתית, הפחתת הזרם של קרן היונים כאשר הלמלה מגיעה לשקיפות אלקטרונים, על מנת למנוע יצירת חום מוגזם. רשת עם למליות מרובות מועברת לאחר מכן למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) בתנאים קריוגניים לרכישת סדרות הטיה. זרימת עבודה חזקה ונטולת זיהום להכנת lamella היא צעד חיוני עבור טכניקות במורד הזרם, כולל cryoEM תאי, cryoET, וממוצע sub-tomogram. פיתוח טכניקות אלה, במיוחד עבור הרמה וכרסום של דגימות קפואות בלחץ גבוה, הוא בעדיפות גבוהה בתחום.

Introduction

רק התוכן התאי של דגימות ביולוגיות בעובי <500 ננומטר ניתן להדמיה יעילה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM) בטמפרטורות קריוגניות, הגבלת טווח הדגימות לנגיפים, פרוקריוטים, אורגניזמים חד-תאיים פשוטים ואזורים דקים יותר של תאים איקריוטים גדולים יותר1. כרסום קרן יונים ממוקדת ברשת (FIB) מאפשר דילול דגימות ביולוגיות עבות יותר של צליפה קפואה ללמלה שקופה אלקטרונית בטמפרטורות קריוגניות (< -150°C). הלמלות המתקבלות מועברות לאחר מכן ל-TEM לצורך הדמיה ואיסוף נתונים טומוגרפיים, מה שמאפשר שחזורים תלת-ממדיים ברזולוציה גבוהה של התכונות התאיות והמולקולריות בתוך התאים (לסקירות ראו Rigort et al., 20122, Oikonomou et al., 20163, and Wagner et al., 20204).

כרסום FIB צמח מתחום מדעי החומרים, שם מדללים דגימות באופן שגרתי כדי להכין אותן לניתוח במורד הזרם5. הוא מתבצע במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM), בעל שתי עמודות אופטיות: אופטיקה של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קונבנציונלי וטור שני המכיל אופטיקה המסוגלת לייצר ולשלוט בעדינות באלומת יונים ממוקדת (FIB) – הנקראת FIB-SEM. זה מאפשר לאזור מסוים של הדגימה להיות ablated על ידי יונים שנוצרו על ידי מקור גליום, הסרת חומר עודף ולהשאיר מאחור lamella6. תהליך הכרסום מונחה על ידי הדמיית SEM של הטופוגרפיה של הדגימה, המשמשת לאיתור אזורי עניין ולמעקב אחר התקדמות הכרסום. עבור יישומים ביולוגיים, ההגדרה הבסיסית זהה במידה רבה, אך הכרסום מתבצע בטמפרטורות קריוגניות. זה דרש התאמה של FIB-SEMs סטנדרטיים לשלבים מקוררים בהקפאה השומרים על טמפרטורות קבועות ושיעורי זיהום פני שטח נמוכים, כמו גם מנעולים אוויריים כדי להקל על העברת הדגימה ללא סטייה או זיהום. מעבורות לדוגמה שונו גם כדי לאפשר למגוון של ספקים שונים להיות מותקנים בתוך cryoFIB-SEM, כולל רשתות TEM, פלנצ’טים ונימים. מספר קבוצות מפתח של חוקרים היו מרכזיות בפיתוח שיטות אלה ובהתקדמות הטכנולוגית המתמשכת בתחום זה 7,8,9,10,11,12. פתרונות מסחריים זמינים כעת באופן נרחב יותר עבור כרסום FIB ביולוגי בטמפרטורה קריוגנית, וכרסום ברשת של lamellae הופך שגרתי יותר, בהתחשב במדגם אופטימלי.

ניתן להשתמש במגוון טכניקות של טמפרטורת החדר ו-cryoEM כדי להמחיש מידע תאי בכל קנה מידה של חיים, החל מאורגניזמים רב-תאיים שלמים ברזולוציה צנועה, דרך הבנת ההקשר של תהליכים מורכבים ברמה התאית וביתר פירוט, ועד לקביעה של in situ מבנים מולקולריים13,14,15,16,17,18,19. טכניקות קלאסיות של טמפרטורת החדר כוללות חתך קבוע ומוכתם, תאים ורקמות מוטבעים בשרף על ידי אולטרה-מיקרוטומיה לניתוח מורפולוגיה תאית על ידי TEM (לסקירה ראו Studer et al., 200820). פותחו טכניקות חלופיות המנצלות פיזור אלקטרונים משני על ידי SEM כדי לדמות את פני השטח של בלוקים של תאים משומרים, לפני הסרה הדרגתית של חומר באמצעות סכין (הדמיית פנים של בלוק טורי) או קרן יונים ממוקדת21,22,23. טכניקה זו יושמה בהצלחה גם בטמפרטורות קריוגניות (המכונה דימות נפח קריו) עם cryoFIB-SEM על בלוקים זגוגיים ולא מוכתמים של תאים או רקמות24. לחלופין, ניתן לטחון ולחקור למלה עבה יותר (~ 15 מיקרומטר) באמצעות הדמיית STEM25. באמצעות טכניקות אלה, ניתן לצלם בלוקים שלמים המכילים תאים רבים כדי לאסוף מידע על האוכלוסייה או שניתן לצלם איבר/אורגניזם שלם ולשחזר אותו בתלת-ממד. עם זאת, כדי לגשת למידע מולקולרי ברזולוציה גבוהה מהתאים, הדגימות צריכות להישמר במצב כמעט טבעי, קפוא-מיובש, ולכן יש להכין אותן בתנאים קריוגניים. מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים של חלקי זגוגית (CEMOVIS) היא טכניקה שבה בלוקים קפואים בלחץ גבוה של חומר ביולוגי נחתכים בתנאים קריוגניים עם אולטרה-מיקרוטום. זה מייצר סרטים של קטעי הקפאה (40-100 ננומטר עובי)26אשר מחוברים לרשת EM ומצולמים ב- TEM., עם זאת, האינטראקציה הפיזית של הסכין עם דגימת הזגוגית גורמת לחריצים ודחיסה שיכולים לעוות קשות את מבנה התא27,28,29,30. חלקים עבים יותר נוטים יותר לחפצים אלה, מה שהופך את השימוש בקטעים עבים יותר מ~70 ננומטר לבלתי מעשי26. מגבלה זו מגבילה מאוד את הראייה התלת-ממדית של המבנה הביולוגי בטומוגרפיה. כרסום FIB בטמפרטורות קריוגניות אינו חווה בעיות אלה, אך יש לו ממצאים משלו הנגרמים על ידי קצבי כרסום דיפרנציאליים על פני חלקים של הדגימה, מה שמוביל לעובי משתנה בתוך למלה – הנקרא וילון. בעיה זו מתמתנת על ידי יישום של ציפוי אורגנופלטינום המיושם באמצעות מערכת הזרקת גז (GIS), המגנה על הקצה הקדמי של הלמלה במהלך הכרסום31. הגבול העליון של עובי הדגימה עבור כרסום FIB ברשת מוגדר על ידי היכולת לצלול, להקפיא את הדגימה תוך שמירה על זגוגית;32אם כי, עם כניסתן של טכניקות הרמת קריו, ונשאי דגימות מותאמים לדגימות ביולוגיות, ניתן להשתמש בכרסום FIB גם לעיבוד דגימות קפואות בלחץ גבוה.,31,33,34,35. בנוסף, דגימות קפואות צוללות אינן יכולות להיות דקות מדי מכיוון שחייב להיות מספיק חומר ביולוגי כדי ליצור למלה בגודל סביר שיספק מספיק שטח פנים לאיסוף סדרות הטיה בהגדלה הנדרשת. ניתן להקל על בעיה זו על ידי כרסום גושים של תאים קטנים יותר, כגון חיידקים או שמרים. עובי הלמלה הסופי (~100-300 ננומטר) מוכתב בדרך כלל על ידי שלמות הדגימה ואסטרטגיית הכרסום. למלות דקות יותר טובות יותר לעבודה מבנית ברזולוציה גבוהה, כגון ממוצע תת-טומוגרפיה, אך למלות עבות יותר מכילות נפחים תאיים גדולים בהרבה ממה שניתן להשיג על ידי CEMOVIS, ומספקות הקשר תאי רב יותר בדגימה שהשתמרה כמעט באופן מקורי. כרסום FIB יכול לשמש גם לדילול גבישי חלבון קפואים עבור מחקרי עקיפה של אלקטרונים36.

כרסום FIB של תאי זגוגית שווה את הזמן והמאמץ לביצוע אם השאלה המדעית דורשת פירוט מולקולרי ברזולוציה גבוהה של דגימות כמעט מקומיות באתרן. עם גישה למתקנים נוספים לייצור שגרתי של lamellae, השלב המגביל את קצב הוא לעתים קרובות אופטימיזציה של הדגימה לפני הטחינה, שבו יש לקחת זמן כדי להבטיח את הדגימה היא זגוגית ועובי מתאים כדי לייצר lamellae חזק ודק באופן אחיד. מתוארת כאן אופטימיזציה של הדגימה עבור כדוריות דם אדומות אנושיות קפואות הנגועות בטפילי פלסמודיום פלציפארום , הגורם הסיבתי למלריה, אך גישה זו יכולה להיות מותאמת לכל דגימה נתונה.

Protocol

דם אנושי נלקח מתורמים אנונימיים באמצעות שירות הדם וההשתלות הלאומי בבריטניה ונעשה בו שימוש תוך שבועיים מקבלתו. אין צורך באישור אתי לשימוש בו. 1. הכנה והקפאה של פלסמודיום falciparum נגוע כדוריות דם אדומות נגועות בודד סכיזונטים בוגרים על ידי צנטריפוגה (1,580 x גרם) מעל תווך שיפוע צפיפות איזוטונית של 70% (v/v) (להליכים סטנדרטיים כיצד לגדל בתרבית שלבי דם א-מיניים של 3D7 Plasmodium falciparum באריתרוציטים אנושיים ראה Blackman M.J., 199537). תקן את יריעות הדם הדקות המיובשות באוויר על מגלשת זכוכית עם 100% מתנול כדי לבדוק את ההומוגניות המורפולוגית של הסכיזונטים לפני הצביעה בכתם 10% Giemsa במאגר פוספט 6.7 mM, pH 7.1.הערה: כדי להעשיר את ההכנה לסכיזונטים שנתקעו בנקודות יציאה ספציפיות, ניתן לסנכרן סכיזונטים עם מעכבי תרכובת 2 ו-E64 (ראו תוצאות מייצגות ואיור 1 להסבר על ההשפעה של מעכבים אלה).זהירות: פלסמודיום פלציפרום הוא פתוגן אנושי ויש לטפל בו רק במתקן הכלה מתאים בהתאם להנחיות הבריאות והבטיחות המקומיות. סכיזונט צנטריפוגות בעדינות (240 x גרם) כדי לגלול אותם ולהשהות מחדש בנפח פי 2 של גלולת התא של מדיית RPMI, וכתוצאה מכך מתלה המטוקריט 50%. במתקן הקפאה ידני, יש למרוח 2.5 μL של סכיזונטים על צד הפחמן של פריקת זוהר (השתמש בהגדרות יחידת פריקת זוהר של 60 שניות, 30 mA באוויר, תוך טיפול בצד הפחמן של הרשת בלבד) רשת נחושת של 200 רשת עם סרט פחמן 2/4 חור וכתם עבור ~20 שניות מגב הרשת באמצעות נייר סינון דרגה 1 עם קצה קרוע. צללו לתוך אתאן נוזלי מקורר בחנקן והעבירו את הרשתות לאחסון (ראו טבלת חומרים לציוד המשמש במחקר זה).הערה: ניתן להשהות את הניסוי כאן, ולאחסן רשתות תחת חנקן נוזלי ללא הגבלת זמן.זהירות: חנקן נוזלי הוא חומר חונק וגורם לכוויות קור; לטפל בזהירות בסביבה מתאימה עם ניטור חמצן.אזהרה: אתאן נוזלי גורם לכוויות חמורות והוא דליק; יש להשתמש במכסה אדים הרחק ממקורות ההצתה.הערה: סכיזונטים קפואים אינם בני קיימא עוד. זה נקבע על ידי דגירה של דם אנושי עם כמה רשתות זהב של סכיזונטים קפואים שהופשרו באוויר ולא צפו בצמיחת טפילים לאחר מספר ימים, בהשוואה לבקרות שלא הוקפאו. לפיכך, רשתות קפואות של סכיזונטים בטוחות לטיפול מחוץ למתקני הכלה באמצעות נהלי בטיחות וטיהור רגילים (כפפות, עיקור משטח/כלים עם >70% אתנול וסילוק רשתות באתנול >70%). רשתות מסך המשתמשות בשלב הקפאה עבור מיקרוסקופ אור, תוך מתן תשומת לב מיוחדת לשיפוע הקרח על פני הרשת. באזורים הדקים יותר של קרח, בדוק את כיסוי התאים בריבועי רשת בודדים.הערה: הריבועים הטובים ביותר צריכים להיות בעובי תא אחד במרכז ריבוע הרשת (איור 2). זה מבטיח שניתן יהיה לטחון למלה במרכז הריבוע מבלי לפגוע בקרח העבה יותר בקצוות כנגד פסי הרשת. ניתן להשהות את הניסוי כאן, ולאחסן רשתות תחת חנקן נוזלי ללא הגבלת זמן. אם תאים נושאים סמן פלואורסצנטי, רשתות יכולות גם להיות מוקרנות על ידי cryoCLEM כדי לאתר מיקומי X/Y בעלי עניין, אשר יכולים להיות מתואמים עם מיקומי רשת ב- cryoFIB-SEM לכרסם ישיר. 2. כרסום FIB ברשת של תאים קפואים צוללים סמנו את החלק הקדמי של חישוקי רשת אוטומטית ספציפיים ל-cryoFIB בעט טוש שחור בלתי מחיק כדי לציין את מרכז מקטע החיתוך ואת הצד הנגדי של השפה (איור 3). הגדר את תחנת החיתוך ואת רשתות החיתוך לטבעות המסומנות בצד הפחמן כלפי מטה. טען רשתות לתוך מעבורת cryoFIB-SEM (בדרך כלל 2 רשתות, תלוי במעבורת) בצד פחמן כלפי מעלה והחל ציפוי פלטינום מתיז באטמוספירה ארגון (5 x 10-2 mbar) (5 mA עבור 60 s – עובי משתנה) או ציפוי סיבובי פחמן / פלטינה e-beam (~ 4 ננומטר עובי) על פני השטח של התאים.הערה: שני סוגי הציפויים מסייעים לפיזור מטען במהלך הדמיית SEM. היתרון של ציפוי סיבובי e-beam הוא שניתן להגדיר את העובי המדויק של הציפוי. טען את המעבורת לתוך cryoFIB-SEM והערך את התפלגות התאים בכל רשת על ידי SEM ב 5 kV (13 pA או 25 pA). קבל סקירה כללית של הגדלה נמוכה (~ 100x) כדי להסתכל על מעברי קרח ברחבי הרשת. לאחר מכן, צלם תמונות בהגדלה גבוהה יותר (~ 5,000x) כדי להסתכל על ריבועי רשת בודדים ולזהות את אזורי הרשת עם תכונות תאיות גלויות וזיהום פני שטח נמוך לטחינה. יש למרוח שכבת אורגנופלטינום >2 מיקרומטר על פני השטח של כל רשת באמצעות מערכת הזרקת הגז (GIS). לשם כך, הכנס את מחט ה- GIS לתא שמעל הרשת וחמם את מקור האורגנופלטינום לטמפרטורה מוגדרת לזמן מוגדר (לדוגמה, ~ 27 ° C עבור 3-10 שניות) כדי לייצר זרימה של אדים.הערה: יש למטב את זווית היישום, הטמפרטורה והתזמון של ציפוי אורגנופלטינום באמצעות מחט GIS כדי למקסם ציפוי אחיד. זה יהיה תלוי ב- cryoFIB-SEM הספציפי המשמש (ראה תוצאות מייצגות להסבר נוסף). הטה את הדגימה כך שמישור הרשת יהיה ~10° מזווית ההיארעות של קרן היונים והזז את המרכז של ריבוע רשת מתאים שניתן לראות הן בתמונות SEM והן בתמונות FIB. סקור את הרשת באמצעות קרן היונים בזרם נמוך (נומינלית 1.5 pA, 30 kV) ועבור להגדלה גבוהה מספיק (~ 7,000x) כדי לדמיין את התאים במרכז ריבוע רשת. יש למקד את הדגימה בזרם הכרסום הראשון (300 pA) ולתקן אסטיגמציה. התאם את הבהירות ואת הניגודיות, ולאחר מכן סמן שתי תבניות מלבניות לטחינה, אחת מעל ואחת מתחת לאזור מוגן בעובי 3 מיקרומטר, שמרכזו הוא המיקום הרצוי של הלמלה הסופית.הערה: הרוחב הנבחר של התבניות יהיה תלוי בטופוגרפיה של שכבת התא שמסביב ובגודל התא. 7-20 מיקרומטר הוא רוחב מתאים לסכיזונטים, אך ללמלות רחבות יותר לוקח זמן רב יותר לטחון. הגובה הנבחר של הדפוסים לשלב הכרסום הראשון תלוי בעובי המדגם, החל בסביבות 6 מיקרומטר; ייתכן שיהיה צורך להתאים זאת במהלך הטחינה. הכרסום מתבצע בכיוון מהקצוות החיצוניים העליונים והתחתונים של התבניות לכיוון פני הלמלה. ניתן לעשות זאת במקביל, כאשר שני התבניות נטחנות במקביל או ברצף, תחילה מסירים חומר מעל הלמלה ולאחר מכן מתחתיה. התחל כרסום בזרם הראשון; נטר את ההתקדמות בזמן אמת בתצוגת קרן היונים ולסירוגין באמצעות SEM (5 kV, 13 או 25 pA). בדקו שקרן היונים פרצה את הדגימה מעל ומתחת לאזור המוגן. אם לא, הגדילו את גובה הדוגמאות המלבניות כדי להסיר חומר נוסף. עצור כאשר המשטח מעל ומתחת ללמלה חלק לחלוטין בתצוגת קרן היונים.הערה: קרן היונים פרצה את הדגימה מעל ומתחת לאזור המוגן כאשר החלק הפנימי של התבניות המלבניות אינו מכיל תכונות במישור המוקד. תכונות מסוימות, כגון סרגלי רשת, עשויות להיות גלויות מחוץ למיקוד ברקע. שינוי לזרם הכרסום הבא (100 pA); התמקד וכוונן את הבהירות/ניגודיות. הקטן את הרווח בין שתי התבניות המלבניות ל- 1.5 מיקרומטר והקטנת גובה הדוגמה כך שיכסה רק את החומר הלא טחון. התחילו לכרסם בזרם החדש עד שהמשטח שמעל ומתחת ללמלה יהיה חלק לחלוטין. חזור על תהליך זה בהדרגה עד שתגיע לעובי של 0.3 מיקרומטר, תוך הפחתת זרם קרן היונים בכל פעם בהתאם לסכימת הכרסום בטבלה 1. טחנו מספר למלות (הכמות תלויה בעובי הדגימה ובזמן הזמין) על רשת אחת או שתיהן לעובי של 0.3 מיקרומטר, רשמו את מיקום X/Y/Z של כל למלה ושמרו ~1-2 שעות בסוף ההפעלה כדי ללטש את הלמלה לעובי הסופי שלהן (60-200 ננומטר). בצעו סקירה כללית של SEM בהגדלה נמוכה של הרשת כולה ותכננו מסלול ליטוש החל מ-lamellae בקדמת הרשת (קרוב יותר למקור קרן היונים) ועד lamellae בחלק האחורי של הרשת (הכי רחוק ממקור קרן היונים) (איור 5).הערה: פעולה זו מפחיתה את השקיעה מחדש של חומר ablated בחזרה על פני השטח של lamellae מלוטש. צמצמו את המרווח בין שתי התבניות המלבניות ל-100-200 ננומטר והתחילו את שלב הליטוש הסופי בזרם קרן יונים של 30 pA. עקוב אחר ההתקדמות על ידי SEM ב- 2-3 kV (13 pA, להתעכב = 300 n, 3072 x 2048, ~ 2 s עבור מסגרת מלאה) ולהפסיק ללטש כאשר הניגודיות אובדת בלמלה על ידי SEM או כאשר ציפוי האורגנופלטינום של הלמלה עצמה מתחיל לאבד שלמות. לפני הסרת הרשתות, השג תמונת SEM בהגדלה נמוכה של הרשת כולה ושמור תמונות של כל למלה. השתמש בהם כדי להצליב את הרשת מאוחר יותר ב- TEM. השהה את הניסוי כאן ואחסן את הרשתות עם lamellae תחת חנקן נוזלי – לטפל בזהירות.הערה: רשתות יכולות להיות מצופות קלות עם הוצאתן מה- cryoFIB-SEM, מה שיכול לעזור להגביל את הסחף והטעינה ב- TEM בהגדלה גבוהה, אך יש לעשות זאת בזהירות מכיוון שציפוי יתר של מרזב יכול לטשטש את התוכן הביולוגי בתוך הלמלה. ניתן לסנן lamellae עבור פלואורסצנטיות בשלב זה; עם זאת, קבלת אות מספיק יהיה תלוי בשפע של חלבון מסומן בתוך עובי של lamella. יש לנקוט בזהירות רבה בטיפול ברשתות כדי להגביל את הנזק ללמלה ולמנוע זיהום פני השטח. 3. רכישת סדרת Tilt וסקירה כללית של עיבוד נתונים טען את הרשתות לתוך ה- TEM, ויישר את כיוון הכרסום בניצב לציר ההטיה של הבמה.הערה: יישור הרשתות נעשה באמצעות העין באמצעות הסימנים על שפת הרשת האוטומטית. שולי טעות ~ 10° מקובלים, אחרת קירות התעלה משני צדי הלמלה עלולים לטשטש את הלמלה כאשר הרשת מוטה. רכוש מפה בהגדלה נמוכה (~ 150x) של הרשת כולה ואתר את lamellae; לאחר מכן, רכשו מפת הגדלה בינונית (~1,500x, תלוי בגודל הלמלה) של כל למלה ואתרו את תחומי העניין. הטה מראש את הרשת ב- ±10° כדי להפוך את מישור הלמלה (לא הרשת) לניצב לציר האופטיהערה: ניתן לקבוע את כיוון ההטיה מראש על ידי מיקום הקצה הקדמי של הלמלה (מחפש את שאריות ציפוי האורגנופלטינה) במפות ההגדלה הנמוכה והבינונית. עבור ה- TEM המשמש כאן, רשתות דורשות הטיה מראש של +10° אם הקצוות הקדמיים של ה- lamellae מצביעים כלפי מעלה במפות ודורשות הטיה מראש של -10° אם הם מצביעים כלפי מטה. כל רשת עשויה להיות שונה בשל האופן שבו הם נאספו והוכנסו לטוען האוטומטי. קבל סדרת הטיה סימטרית38 (לדוגמה, -54° עד +54° עם הפרש קבוע של 3-5°) בגודל פיקסל המאפשר הן את שדה הראייה והן את הרזולוציה הדרושים לאזור העניין. השתמש בטווח של ערכי ביטול מיקוד בין -2 ל- -5 מיקרומטר. אסוף סרטים עם 3-10 מסגרות בכל הפרש קבוע ולשם כך, התאם פרמטרים אלה בהתאם לגודל הפיקסלים כדי לצבור מינון כולל של ~ 150 e-/Å2 (עבור 300 kV TEM).הערה: יש להימנע מסדקים בלמלה מכיוון שאזורים אלה עלולים להיסחף. יש להימנע גם מזיהום פני השטח מכיוון שהוא עלול לטשטש את אזור העניין או את אזור המיקוד בהטיה גבוהה. תנועה לתקן את הסרטים באמצעות תוכנית כגון MotionCor239. החל מסנן שקלול מינון על התמונות המתוקנות (e-/image מצטבר)40 והערך את ביטול המיקוד של כל תמונה באמצעות תוכנית כגון CTFFIND441. השתמש ביישור ללא פידוקיאל (מעקב אחר טלאים) בתוכנית כגון etomo (IMOD)42 כדי לחשב את היישור ואת הקשר הזוויתי של התמונות בסדרות הטיה. הזן את מידע היישור והסיבוב, יחד עם ערכי ביטול המיקוד לתוכנית שיכולה להחיל תיקון CTF תלת מימדי, לדוגמה, NovaCTF43. חשב טומוגרפיה מתוקנת כדי לקבל טומוגרפיות פלט עם גורמי קישור רלוונטיים לניתוח במורד הזרם. נתח את השחזורים והתכונן לכל עיבוד במורד הזרם, לדוגמה, סינון, סגמנטציה או ממוצע תת-טומוגרפיה.

Representative Results

הכנת P. falciparum schizonts להקפאת צלילהמעכבי תרכובת 2 ו-E64 משמשים לעיכוב סכיזונטים בשלבים שונים של יציאה, ויוצרים אוכלוסייה מועשרת של סכיזונטים למחקר הבא. זה חשוב מכיוון שללא טכניקה מתאמת משלימה, כרסום מטרות תת-תאיות ספציפיות או סוגי תאים הוא מאתגר מכיוון שהתהליך עיוור במהותו. תרכובת 2 היא מעכב חלבון קינאז שמעכב את היציאה לפני הקרע בחלל החלילי. ניתן לסנכרן סכיזונטים בתרכובת 2 במשך 4 שעות, ולאחר מכן לשטוף אותם במדיה נטולת תרכובת 2 כדי להסיר את המעכב, ואז סכיזונטים יבשילו וייצאו לאחר כ-30 דקות. לחלופין, ניתן לשטוף סכיזונט מסונכרן תרכובת 2 לתוך E64, מעכב פרוטאז ציסטאין רחב ספקטרום בלתי הפיך, ולדגור במשך כשעה אחת כדי לעכב את היציאה לאחר נקודת הקרע vacuole, אבל לפני קרע התא המארח. המורפולוגיה וההומוגניות של סכיזונטים מטופלים צריכות להיבדק על-ידי מריחות דם מוכתמות בגימסה לפני הקפאה (איור 1). Schizonts ניתן לצלול קפוא בכל אחד ממצבים אלה באמצעות השיטה המתוארת בפרסום זה. איור 1: המורפולוגיה של תרכובת 2 ו-E64-stalled P. falciparum schizonts על-ידי כתמי דם מוכתמים בגימסה. (A) בנוכחות תרכובת 2, הוואקול הטפילי (PV) צפוף במרוזואיטים (עיגולים סגולים) עם אשכול יחיד של גבישי המוזואין (עיגול חום כהה). הגבול בין PV לבין המוגלובין שמסביב בתא הדם האדום המארח (hRBC) (פס אפור) מוגדר היטב, כמו גם קרום hRBC. (B) בנוכחות E64, קרום ה-PV נקרע והמרוזואיטים מתפשטים בתוך hRBC. כל סכיזונט עדיין מכיל אשכול יחיד של גבישי המוזואין. קרום התא המארח דולף וקורס חלקית, ולכן אין המוגלובין נראה בשולי התא וגבול קרום hRBC אינו נראה בקלות. סרגל קנה מידה, 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. אופטימיזציה של הקפאת צלילהמגוון רשתות עם גדלים שונים של חורים נוסו במהלך אופטימיזציה של תנאי הכתמים עבור תאי דם אדומים נגועים ב- P. falciparum, כולל 2/2, 3/3, 3.5/1 ו- 5/2 (מרובע) פחמן חורי על רשתות רשת זהב ונחושת 200. 200 רשתות מאתר נחושת רשת עם 2/4 סרט פחמן חורי מספקות שכבה עבה כראוי של תאים לטחינת זגוגית ארוכה. חורים גדולים או קטנים יותר יצרו בדרך כלל שכבות תאים דקות או עבות מדי, בהתאמה (איור 2A-C). עם 2/4 פחמן חורי, סכיזונטים נמשכים דרך חורי 2 מיקרומטר על ידי כתם הרשת מאחור (צד שאינו פחמן), וכתוצאה מכך תאים מבצבצים מעל ומתחת לסרט הפחמן. מתיחה של 4 מיקרומטר של פחמן בין החורים גורמת לרצועה של פחמן העוברת דרך אמצע רוב הלמלה המתקבלת, ומוסיפה חוזק. רשתות איתור מתאימות ביותר למטרות קורלציה וסינון44, אך יש להקפיד לוודא שהמספרים/אותיות בעיצוב הרשת אינם גדולים מדי מכיוון שהדבר יחסום אזורים לכרסום. זמן הכתמים בבוכנה ידנית הוא כ-20 שניות, אך הנקודה המדויקת שבה יש להפסיק את הכתמים נשפטה על ידי העין כאשר טיפת הנוזל שנשאבה מהרשת הפסיקה להתפשט על נייר הפילטר. קצה קרוע נדרש כדי לשבור את מתח הפנים של הטיפה כדי להתחיל את תהליך הניקוי. במחקר זה לא נעשה שימוש במקפיא צלילה אוטומטי, אך נקודת התחלה סבירה לדגימה זו תהיה להשתמש באותו נפח תאים וסוג רשת המשמש לבוכנה ידנית, תוך הקפדה על כתם הרשתות מאחור בתנאים עם לחות גבוהה (~70%) וטמפרטורת הסביבה (~ 25 מעלות צלזיוס). זמני הניקוי והתנאים יצטרכו להיות מותאמים למערכת האוטומטית המסוימת שבה נעשה שימוש. רשתות קפואות של P. falciparum schizonts הוקרנו על ידי מיקרוסקופ אור מצויד בשלב הקפאה ולא על ידי TEM, מכיוון שהדגימה לא הייתה ניתנת להעברה לאלקטרונים. עבור דגימות דקות יותר, רשתות יכולות להיות מוקרנות על ידי TEM (אטלס רשת שלם בהגדלה ~ 150x) לפני העברת הדגימה לתוך cryoFIB-SEM, אשר עשוי להיות תנאי מוקדם לגישה למתקן לאומי. יש להקדיש תשומת לב מיוחדת לשיפוע של עובי הקרח על פני הרשת וגם בתוך ריבועי רשת בודדים. ריבועי רשת טובים צריכים להיות בעובי תא אחד או לפגוע בסרט הפחמן שבמרכזם (איור 2C). זה ימנע כרסום בקרח העבה כנגד פסי הרשת סביב קצה ריבוע הרשת ויבטיח שקרן היונים תפרוץ מעל ומתחת לשכבת התא, ותיצור למלה חופשית במקום טריז. לאחר שתנאי הכתם והקפאת הצניחה הניתנים לשחזור עברו אופטימיזציה, בדרך כלל אין עוד צורך בסינון לפני כרסום FIB. איור 2. ניתוח התפלגות התא על רשתות של P. falciparum schizonts קפוא על ידי מיקרוסקופ cryo-light. (A) דוגמה לכך שקרח עבה מדי על פני ריבוע רשת באמצעות מיקרוסקופ קריו-אור, המסתיר את התאים ואת סרט הפחמן. סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר. (B) דוגמה לכך שגודל החור (רשת נחושת של 300 רשת עם סרט פחמן חורי בגודל 5/2 מרובע) גדול מדי עבור התאים, וכתוצאה מכך נוצרת שכבה דקה מאוד של חומר ביולוגי המוקפת באזורים ריקים ללא קרח. רשתות כאלה מייצרות למלה קצרה מאוד ולא יציבה. סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר. (C) דוגמה לפיזור תאים טוב ברשת נחושת של 200 רשת עם 2/4 סרט פחמן חורי. סכיזונטים אלה טופלו במעכב E64. התאים הגדולים (קופסה אדומה, ~ 5 מיקרומטר קוטר) עם פריפריה מוגדרת היטב הם תאי דם אדומים נגועים שעדיין יש להם קרום vacuole שלם. אשכולות התאים הקטנים (קופסה כחולה, ~1 מיקרומטר) הם המרוזואיטים הבודדים הכלולים בתוך תא דם אדום מארח שהתמוטט חלקית. לכל סכיזונט יש כתם שחור במרכזו, המציין את מיקום גבישי ההמוזואין (ראו איור 1 לפרטים נוספים). ההבדל במורפולוגיה של התא אינו קל לראות פעם אחת בתוך cryoFIB-SEM; לכן, סינון מוקדם על ידי מיקרוסקופ קריו-לייט מועיל עד שמגיעים לתנאי כתמים הניתנים לשחזור. כיסוי התא סביב קצות ריבוע הרשת ליד פסי הרשת (אזורים מקווקווים לבנים) עבה מדי לכרסום. האזור הדק יותר במרכז ריבוע הרשת (אזור מקווקו צהוב) הוא מקום אידיאלי לטחון ממנו, המרחיב את הלמלה לשכבת התאים שמסביב. סרגל קנה מידה, 6 מיקרומטר. (D) תמונה של שפת רשת אוטומטית ספציפית ל-cryoFIB עם שני סימנים שחורים, אחד בתוך קטע החיתוך (סוגר שחור) והשני ממול, בשעה 12 ובשעה 6. החץ השחור מייצג את כיוון הכרסום. (E) כאשר הרשתות נטענות לתוך קלטת הטוען האוטומטי, הסימנים צריכים להיות במרחק שווה משני צדי פינצטת הטעינה, וכתוצאה מכך הלמלה מונחת בניצב לציר ההטיה של הבמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. סימון חישוקי רשת אוטומטית ספציפיים ל- cryoFIB לטומוגרפיהבדרך כלל, רשתות נחתכות לתוך חישוקי רשת אוטומטית לפני הכרסום על מנת להקל על הטיפול ולספק קשיחות, אשר מגנה על lamellae מפני נזק במהלך שלבי ההעברה הבאים. חישוקי רשת אוטומטית ספציפיים ל- CryoFIB תוכננו עם תכונת חיתוך כדי לסייע בגישה ליותר מפני הרשת במהלך הכרסום. חשוב לכוון את כיוון הכרסום בניצב לציר ההטיה של ה-TEM, כך שרכישת סדרת ההטיה תתקדם על ידי סיבוב הלמלה לאורכו. זה מבטיח שהקירות הגבוהים של התעלה המקיפה את הלמלה לא יטשטשו את המידע הביולוגי בזמן הטיית הרשת. בדרך כלל, שפת הרשת האוטומטית מסומנת כדי לסייע ביישור חזותי בתוך מעבורת cryoFIB-SEM ומאוחר יותר בעת טעינת ה- TEM. עבור הדגימות האלה, שני סימנים יושמו בשעה 12 ובשעה 6 עם סמן בלתי ניתן למחיקה (ראו טבלת חומרים), אחד במרכז החלק המנותק של טבעת הקליפ והשני ישירות ממול (איור 2D). בעת העמסה לתוך TEM (ראו טבלת חומרים), שני הסימנים צריכים להיות גלויים משני צדי פינצטת ההעמסה ומיושרים ב-90° לקצה הפינצטה (איור 2E). יש לציין כי היצרן ממליץ ליישר רשתות באמצעות הנקודות החרוטות על חישוקי הרשת האוטומטית, שכן דיו מסוים בקרבת קרן היונים עלול להפריע לכרסום. רשתות חתוכות יכולות להיות מוקרנות על ידי מיקרוסקופ אור עם קלטת שונה לשלב הקפאה, אשר יכול להיות מועיל כדי לבדוק כי תהליך הגזירה לא הרס את הסרט פחמן של הרשת. בהתאם לקלטת המדגם, ניתן גם לטחון רשתות ללא מעצורים, אך יש לנקוט בזהירות רבה במהלך ההעברה מה- cryoFIB-SEM ל- TEM כדי להגביל כל כיפוף של הרשת מכיוון שזה ישבור את הלמלה. רשתות לא חתוכות ניתן לטעון לתוך TEM על ידי מחזיקי קריו, אבל יש סיכוי גבוה כי lamellae יישבר אם חיתוך מתבצעת לאחר כרסום. ציפוי אורגנופלטינוםציפוי אורגנופלטינום מתבצע על רשת אחת או שתיהן לאחר שהן נטענות לתוך cryoFIB-SEM. המחט של מערכת הזרקת הגז (GIS) מוחדרת לתא שמעל הדגימה כדי לכוון זרימה של אדי אורגנופלטינום על פני השטח של הרשת ממקור מחומם למשך זמן מוגדר. האדים מתעבים על משטחים קרים ויוצרים שכבה מוצקה (~ 2 מיקרומטר עובי). שלמות המעיל הזה היא קריטית כדי לאפשר טחינת למלה דקה באופן אחיד. תנאי היישום האופטימליים עבור מעיל אורגנופלטינום נקבעים בדרך כלל מראש על ידי יצרן המכשיר, אך עדיין ייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה מסוימת. רוב המערכות מיישרות את מחט ה-GIS קרוב לכיוון הכרסום או בניצב לכיוון הכרסום, בהתאם לגיאומטריה של יציאות בתא ולגבולות הסיבוב של הבמה. ניתן לנסות הגדרות שונות על ידי ציפוי הרשת, כרסום אזור קטן, הטיית הבמה ומדידת עובי המעיל על ידי SEM. בנוסף להתקנה של cryoFIB-SEM עצמו, מספר גורמים אחרים יכולים להשפיע על היישום של ציפוי אורגנופלטינום, כולל 1) הטופוגרפיה של הדגימה, 2) זיהום פני השטח ברשת ו -3) יכולת השחזור של זרימת האדים ממחט GIS. מכיוון שזרימת GIS היא כיוונית, טופוגרפיה לא אחידה עלולה לגרום לאזורים בצל תאים או זיהום פני השטח להיות לא מצופים או בעלי פרווה דקה יותר. זה יכול להוביל לקריסה של שכבת אורגנופלטינום במהלך ליטוש (איור 3). בעת בחירת שטח לטחינה, יש לשים לב לטופוגרפיה שמסביב, למשל, זיהום פני שטח גדול, גושי תאים או פחמן שבור המקרינים מפני השטח של הרשת עד כמה ריבועי רשת משם, עלולים לחסום את זרימת האדים, וליצור צל של אורגנופלטינום דק יותר שעלול להחליש את הלמלה. בנוסף, יש להימנע גם מחלקיקים קטנים מאוד של זיהום פני השטח בסמוך לקצה הקדמי של הלמלה מכיוון שהם יכולים לצוץ במהלך הטחינה, ולהשאיר כתם מוחלש של קרח חשוף שעלול לגרום לחור להתפתח בלמלה במהלך הליטוש. לבסוף, אם הכרסום החל וציפוי האורגנופלטינום נראה לא יציב, צפו שוב, למשך זמן רב יותר, או החליפו ברשת גיבוי. איור 3: ציפוי אורגנופלטינום באיכות טובה הוא קריטי לקבלת למלה דקה וטחינה שווה. (A) מיקרוגרף של הקצה הקדמי של למלה שבו ציפוי אורגנופלטינום (OP, צהוב) נמרח דק מדי, מה שמוביל לחור בקצה הקדמי של הלמלה שהתפתח במהלך ליטוש (עיגול ירוק) ולכרסום לא אחיד לכל רוחב הלמלה (פסים). משטח האורגנופלטינום נחתך על ידי קרן היונים, מה שמוביל להתזה של חומר מאחורי הקצה הקדמי של הציפוי (קו מקווקו צהוב). (B) ציפוי האורגנופלטינום (OP) נמרח בצורה עבה יותר, והתוצאה היא למלה דקה יותר באופן שווה. שלמות הפרווה נשמרת לכל רוחב הלמלה והממשק בין ציפוי האורגנופלטינום לחומר הביולוגי הזגוגי מוגדר היטב (קו צהוב-מקווקו). ניתן לראות את שכבת הפחמן עוברת דרך החלק האחורי של הלמלה (כתום). פסי קנה מידה, 1 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. הערכת איכות הרשת ב- cryoFIB-SEM ותהליך הכרסוםלאחר העברת רשתות ל-cryoFIB-SEM, ניתן לסנן SEM את שלמות סרט הפחמן ואת פיזור התאים ברשתות (איור 4A-C). שיפועי קרח, מיקומם של פסי רשת ומיקום מספרי הרשת ברשתות איתור יכולים להיבדק על-ידי SEM בהגדלה נמוכה של 30 kV (איור 4B), אך יש להפחית את המתח בחזרה ל-5 kV תוך איתור מיקומי כרסום בהגדלה גבוהה וניטור תהליך הכרסום כדי להגדיל את הניגודיות מהטופוגרפיה של פני השטח. איור 4: הערכת איכות הרשת ואיתור אזורים לטחינה ב- cryoFIB-SEM . (A) סקירה כללית בהגדלה נמוכה של רשת ב- 5 kV באמצעות SEM. אזור החיתוך של שפת הרשת האוטומטית גלוי בתחתית התמונה. סרגל קנה מידה, 0.5 מ”מ. (B) אותה רשת ב- 30 kV by SEM, המציגה אזורים של קרח עבה יותר (ריבועי רשת כהים יותר) וקרח דק יותר (ריבועי רשת בהירים יותר). הכניסה מציגה את האזור בתיבה, עם חצים המציינים את המספור ברשת המוצא, הנראית ב- 30 kV. סרגל קנה מידה, 0.5 מ”מ. (C) סקירה בהגדלה בינונית של שני ריבועי רשת המעריכים את התפלגות התאים על סרט הפחמן ואת מיקום פסי הרשת. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. (D) סידור תבניות כרסום לחיתוך הראשון בהגדלה גבוהה (תצוגת קרן יונים ב- 1.5 pA ו- 30 kV). האזור האדום (בעובי 3 מיקרומטר) מוגן, בעוד שהאזורים הצהובים יוכתמו על ידי קרן היונים. הקו המקווקו הלבן מציין את מיקום הלמלה הסופית. סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר. (E) תצוגה בהגדלה גבוהה של 3 kV דרך SEM של למלה מלוטשת בעובי 200 ננומטר (רוחב 10 מיקרומטר x 15 מיקרומטר אורך). אובדן הניגודיות בתוך הלמלה ב -3 קילו וולט מעיד על כך שהגיע לעובי מתאים. הקצה הקדמי הלבן-בהיר הוא שכבת האורגנופלטינום הנותרת שמורחים על הרשת דרך ה-GIS לפני הכרסום. סרגל קנה מידה, 5 מיקרומטר. (F) אותה למלה מ-(E) שנצפתה באמצעות קרן היונים ב-30 kV וב-1.5 pA. הקו הלבן הדק לרוחב הריבוע השחור (חץ לבן) הוא ציפוי האורגנופלטינום שנותר בקצה הקדמי מאוד של הלמלה. סרגל קנה מידה, 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. אזור לטחינה נבחר על-ידי פריסת זוג תבניות מלבניות משני צדי אזור מוגן בהגדלה גבוהה (~7,000x עבור סכיזונטים) בתצוגת קרן היונים (איור 4D). זה קריטי כי לא חלקיקים של זיהום פני השטח מחוברים ליד אזור הטחינה כמו אלה עשויים לטשטש את היישום של ציפוי אורגנופלטינה מגן. חשוב גם שהטופוגרפיה של האזור תתאים לתמוך בצידי הלמלה לאחר שהושג עובייה הסופי. עבור סכיזונט מלריה (גודל התא: ~ 5 קוטר x 2 מיקרומטר עובי, בצורת דיסק) lamellae בין 7-20 מיקרומטר רוחב ניתן לטחון. אם שכבת התא עבה בהתאם, הלמלה בדרך כלל תגיע לאורך ~10-15 מיקרומטר, ותלכוד תאים מרובים מעל ומתחת לשכבת הפחמן (איור 4E-F). ניתן לצפות לטחינה של 5-10 למלה בהפעלה של 8 שעות (6-7 שעות של כרסום ו-1-2 שעות של ליטוש). זה ישתנה בהתאם לעובי הדגימה ולרוחב הלמלה, כאשר דגימות עבות יותר ולמלות רחבות יותר לוקחות זמן רב יותר לטחינה. אפילו רשתות פגומות ניתנות לטחינה מאחר שנדרש רק קומץ ריבועי רשת טובים כדי ליצור קבוצה של למלות (איור 5A). בנוסף, אם הדגימה דקה מהצפוי, למשל, עקב כתם יתר או שונות בהמטוקריט של התרבית, ניתן לטחון למלה קצרה יותר במהירות יחסית; עם זאת, אורכם הקצר יותר יגביל את השטח הזמין לאיסוף נתונים ב-TEM (איור 5B). איור 5: קביעה מתי הגיעו לעובי הלמלה הסופי במהלך הכרסום. (A) סקירה כללית בהגדלה נמוכה של רשת על ידי SEM ב- 5 kV המראה נזק פחמן במהלך גזירה. האזורים שלא ניזוקו הכילו דגימה דקה מאוד עקב כתם יתר; עם זאת, עדיין ניתן היה לטחון שש Lamellae על רשת זו (האזור בתוך המתווה המקווקו הלבן) בפגישה של יום שלם על cryoFIBSEM. סרגל קנה מידה, 0.5 מ”מ. (B) למלה קצרה (~10 מיקרומטר רוחב x 3 מיקרומטר אורך, לא כולל שכבת אורגנופלטינה) שהופקה מרשת זו (SEM ב 3 קילו וולט), שעדיין סיפקה שני אזורים שמהם ניתן לאסוף סדרות הטיה. סרגל קנה מידה, 25 מיקרומטר. (C) סדרה של תמונות SEM (3 kV) של למלה במהלך שלב הליטוש הסופי המראה כיצד הניגודיות אובדת בלמלה כאשר היא מידללת (נעה משמאל לימין). הקו השחור הכהה לאורך אמצע הלמלה בכל התמונות הוא רצועה של סרט פחמן מהרשת. תאים לפני אזור זה היו מזוגגים מעל סרט הפחמן ותאים מאחורי אזור זה היו מזוגגים מתחת לסרט הפחמן. הכרסום הופסק כאשר ציפוי האורגנופלטינום בצד שמאל של הקצה הקדמי של הלמלה היה קרוב לאבד את שלמותו המבנית. נקודת עצירה זו הייתה לפני שהלמלה כולה הובאה לעובי אחיד, ולכן עדיין יש חומר ניגודיות גבוה יותר בחלק האחורי של הלמלה. (D) דוגמה למסלול ליטוש המבוסס על הלמלה שנטחנה על הרשת המוצגת ב-(A). מסלול ליטוש צריך להתחיל ב-lamellae קרוב יותר למקור FIB, ולהתרחק ממקור FIB כדי להגביל את השקיעה מחדש של חומר טחון על פני השטח של lamellae. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. במהלך הליטוש, העובי הסופי של למלה יהיה תלוי במבנה הדגימה באזור הטחינה, שלמות ציפוי האורגנופלטינה והזמן הזמין. באופן אידיאלי, יש לדלל את הדגימה עד לאיבוד הניגודיות על פני כל פני השטח של הלמלה על ידי SEM ב-3 קילו-וולט, מה שמרמז על כך שהיא שקופה אלקטרונים באופן שווה ועובי של כ-150-200 ננומטר (איור 5C). עם זאת, ייתכן שיהיה צורך להפסיק את הכרסום לפני נקודה זו אם שכבת אורגנופלטינה מפתחת חור או lamella מתחיל להתכופף. במקרה זה, lamella עדיין עשוי להיות דק מספיק בחזית להישאר שימושי עבור טומוגרפיה. לעומת זאת, ניתן לדלל מעבר לשלב אובדן הניגודיות אם הלמלה נראית יציבה, מה שהופך אותה לדקה עוד יותר על ידי הזזת תבניות הכרסום קרוב יותר זו לזו (~ 100 ננומטר או פחות). הדבר תלוי בעובי אם נדרש עבור זרימת העבודה במורד הזרם. תמונת SEM בהגדלה נמוכה נדרשת כדי לתכנן מסלול ליטוש, שמתחיל קרוב יותר למקור קרן היונים ומתרחק (איור 5D). כיוון מסלול הליטוש חשוב כדי למנוע שיקוע מחדש של חומר אבלטי על למלה שכבר הושלמה. איסוף ועיבוד נתונים מסדרות הטיהלאחר הטעינה לתוך TEM, מונטאז’ רשת מלאה בהגדלה נמוכה (~ 150x) יזהה את המיקומים של lamellae, אשר יכול להיות מתואם עם תמונת SEM בהגדלה נמוכה שצולמה בסוף כרסום. עבור סכיזונטים קפואים, רוב הרשת אינה שקופה לאלקטרונים, כך שמיקומי הלמלה מופיעים כחריצים לבנים על רקע שחור (איור 6A). יש לציין את זווית הלמלה ביחס לציר ההטיה של המיקרוסקופ, שכן מרחק של יותר מ~10° מהניצב עלול להקשות על רכישת סדרות הטיה. מונטאז’ הגדלה בינונית (~1,500x) במיקום של כל למלה ייתן סקירה כללית של התוכן הביולוגי ויבדוק אם יש נזקי העברה, קרח גבישי או זיהום מוגזם של פני השטח (איור 6B-D). יש לבדוק זאת גם בהטיה גבוהה כדי להבטיח שאף זיהום פני השטח אינו מסתיר את אזור הרכישה או המיקוד. בחירת אזור רכישה תהיה תלויה לא רק בתכונות הביולוגיות, אלא גם בשלמות המבנית של הקרח באזור שמסביב, למשל, הימנעות מסדקים, שכן אזורים אלה ייסחפו, או אזורים עם וילונות מוגזמים, שבהם למלה יהיה עובי משתנה. לפני רכישת סדרת הטיה, מוחלת על הרשת הטיה מראש של ±10° כדי להפוך את מישור הלמלה (לא הרשת) לניצב לציר האופטי. ניתן לקבוע את כיוון ההטיה המוקדמת על ידי מיקום הקצה הקדמי של הלמלה (מחפש את שאריות מעיל האורגנופלטינה) במונטאז’ ההגדלה הבינונית. עבור TEM המשמש כאן (300 kV Titan Krios), אם הקצוות הקדמיים של lamellae הצביעו למעלה במפה, זה דרש +10° pre-tilt ואם הם הצביעו למטה, זה דרש -10° pre-tilt. כל רשת עשויה להיות שונה בשל הכיוון שבו הם נקלטו בפינצטה והוכנסו לטוען האוטומטי (קטע חיתוך הפונה שמאלה או ימינה, מייצר סיבוב של 180 מעלות). שיקול אחרון הוא גודל הפיקסלים. באופן שגרתי, סדרות הטיה נאספות סביב 2.5-7 Å / פיקסל, תוך התחשבות בגודל התכונה של עניין, את רזולוציית היעד של הנתונים הטומוגרפיים המתקבלים ואת שטח הפנים של lamella, אשר עשוי להגביל את גודל שטח הרכישה. ניתן להשתמש בגודל פיקסלים קטן יותר כדי לקבל מידע ברזולוציה גבוהה, והקטן ביותר שבו השתמשנו בהצלחה בדגימות אלה הוא 1.4 Å/pixel (הנתונים אינם מוצגים). Drift יהיה בולט יותר בגודל פיקסל קטן יותר והוא מתאים רק עבור lamellae דק (<100 ננומטר) שבו למקסם את הרזולוציה הוא בעל חשיבות במחקר. איור 6: בחירת אזורי עניין נגישים שמהם ניתן לרכוש סדרות הטיה (A) קטע במפת TEM בהגדלה נמוכה המציג אזור המכיל lamellae, המופיע כשישה חריצים לבנים על רקע שחור (חיצים אדומים). הריבועים הלבנים הם סרט פחמן שבור. (B) מפת הגדלה בינונית של למלה פגומה וחריגה. בקצה הקדמי של הלמלה (FE) מעיל האורגנופלטינום נשבר (1). יש כתם ברור של קרח גבישי במרכז הלמלה (2). קרן היונים לא הצליחה לפרוץ בקצה האחורי של הלמלה (BE) מכיוון שהקרח סמיך מדי ליד פסי הרשת. רק חלק קטן מהלמלה חופשי מהקרח שמסביב ב-BE (3), מה שיוצר טריז. העובי גרם גם לחיתוך מדפים מעל הלמלה (4), מה שככל הנראה יחסום את שדה הראייה של התאים בהטיה גבוהה ב-TEM. (C) מונטאז’ הגדלה בינונית של למלה שלמה שנצפתה ב-TEM. בעיות או אזורים אופייניים שיש להימנע מהם בעת איסוף סדרות הטיה מלמלה הם אזורים: מכוסים בזיהום פני השטח (SC), מכוסים בציפוי אורגנופלטינום (OP, צהוב), ליד סדקים (CR וחצים שחורים), עם וילונות עקב שינויי צפיפות בחומר ביולוגי (CU ואזור בתוך סוגריים כחולים), ואזורים שנחלשו על ידי שברים בציפוי אורגנופלטינום (עיגול ירוק). האזורים היחידים הנגישים לרכישת סדרות הטיה הם האזורים בתוך שתי התיבות המקווקו השחור (המסומנות 1 ו- 2). יש לבדוק את הנוף בהטיה גבוהה כדי לוודא שזיהום פני השטח אינו מסתיר את אזור העניין או את אזור המיקוד. (D) מונטאז’ בהגדלה בינונית של למלה נקייה בהרבה, אך עדיין יש בה סדקים (CR) הנגרמים כתוצאה מדילול שכבת האורגנופלטינום (עיגול ירוק) במהלך הליטוש. כאן, אזור העניין מודגש על ידי סוג התא שנצפה בתוך lamella, אשר במקרה זה הם merozoites בודדים, ממוקם מאחורי שכבת פחמן (כתום) לכיוון החלק האחורי של lamella (קופסה מקווקו שחור). פסי קנה מידה, 3 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 7: קבלת נתוני cryo-ET מלאמלה טחונה FIB. (A) מיקרוגרף של אזור של למלה המכיל תא דם אדום שאליו פלש לאחרונה P. falciparum merozoite. ב-(B) אותה תמונה מבוארת כדי להראות את הגבול של תא הדם האדום (אדום), מספר שלפוחיות תוך-תאיות בעלות דופן כפולה (סגול וכחול עבור הממברנה הפנימית והחיצונית, בהתאמה) והמרוזואיט (ירוק) המוקפות בקרום שני שמקורו בתא המארח (צהוב). קופסה שחורה מציגה את האזור שבו נרכשה סדרת הטיה. סרגל קנה מידה, 500 ננומטר. (C) ממוצע של 20 פרוסות מרכזיות שנצפו במישור XY מטומוגרפיה של 8x binned (2.4 Å/pixel) שנרכשו בקצה האפי של המרוזואיט וב-(D) הביאור שלו, המראה את שני הקרומים המקיפים את התא (ירוק וצהוב) וארבעה קרומים המוערמים בקודקוד המרוזואיט (כחול) הקשורים לתכונה צפופה בצורת פטריית אלקטרונים (סגול). חץ אדום מציין את הצטלבות ערימות הממברנות בקודקוד ואת התכונה דמוית הפטרייה (מוצגת גם בחלק F, i). חץ שחור מציין אירוע איחוי בין קרום הפלזמה של המרוזואיטים לבין אחת הבועיות הרב-שכבתיות בתוך הטפיל (מוצג גם בחלק F, ii). קרום תא הדם האדום המארח מוצג (אדום) וקו מקווקו שחור מראה את המיקום של חתך רוחב שנצפה במישור XZ, מוצג ב- (E). התכונות בחתך רוחב (E) צבועות ומסומנות כמו בחלק (D), עם חצים צבעוניים המצביעים על הממברנות. חץ שחור מציין את המיקום של מעיל שפריץ שהוחל על הלמלה לאחר הכרסום ואת עובי הלמלה שצוין. עבור חלקים (C-E), סרגל קנה מידה, 500 ננומטר. (F) תצוגה מפורטת יותר של התכונות המצוינות על ידי ראשי החצים האדומים והשחורים בחלק (C), המראה את ההגדרה בשתי שכבות השומנים של ערימת הממברנה בקודקוד המרוזואיט (i) ואת אירוע האיחוי בין השלפוחית הרב-שכבתית עם קרום הפלזמה של המרוזויט. סרגל קנה מידה, 75 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. המוקד העיקרי של העבודה הוא לנתח את מסלול היציאה של המרוזואיטים פנימה P. falciparum אבל בהתחשב בכך שאוכלוסיית התאים המשמשים במחקר לעולם לא יכולה להיות הומוגנית לחלוטין, לעתים קרובות נצפו שלבים אחרים של התפתחות תאים בתוך הלמלה. הדוגמה המוצגת כאן (תרשים 7) מכיל תא דם אדום שפלש לאחרונה על ידי P. falciparum טפיל (merozoite). עובי הלמלה בה נעשה שימוש היה 240 ננומטר, והרשת צופתה קלות בפלטינה באטמוספירה של ארגון לפני הכנסתה ל-TEM, מה שהביא לניגודיות מעט פחותה מהצפוי בדרך כלל. ניתן היה לעקוב אחר קרום תאי הדם האדומים בשלמותו סביב התא. בתוך תא הדם האדום היו שלושה מבנים סגורים הקשורים לממברנה, שתי שלפוחיות, שכל אחת מהן מוקפת בקרום כפול ובתכונה בצורת נורה (1.2 מיקרומטר x 0.9 מיקרומטר בחלקיו הרחבים ביותר), מה שתואם את היותו מרוזואיט (איור 7A-B). תכולת שתי הבועיות נראתה דומה בניגוד לתכולת תאי הדם האדומים, מה שמרמז על כך ששלפוחיות אלה עשויות להכיל המוגלובין. נוכחות של שלפוחיות בתוך תא הדם האדום המארח לאחר הפלישה נצפתה בעבר45. הסברה היא שהם נובעים מהפרשת שומנים וגורמי אלימות אחרים מאברוני הפרשה הנקראים רופטריות במרוזויט, אשר משתחררים לתוך התא האדום המארח במהלך הפלישה. המרוזואיט מוקף בשני קרומים הקשורים זה לזה, הפנימי שבהם הוא ככל הנראה קרום הפלזמה הטבעי של המרוזויט, שעליו אין שכבת פני שטח נראית לעין, והחיצוני ביותר חייב לנבוע מקרום התא האדום המארח העוטף את המרוזואיט בעת פלישתו. הציטופלסמה של המרוזואיט מכילה שלפוחיות רב-שכבתיות רבות ותכונה צפופה בצורת פטריית אלקטרונים הצמודה לערימת קרומים בקודקוד. סדרת הטיה שנרכשה מעל אזור זה (2.4 Å/pixel) מראה שהוא מכיל ערימה של ארבעה קרומים, שנראים מחוברים לתכונה בצורת פטרייה (איור 7C-E). באופן מדהים, מורפולוגיה זו שונה למדי מהסידור הרגיל של אברונים ומבנים תאיים בקצה האפי של מרוזויט בוגר. כדי להעריך זאת, התקבלה סדרת הטיה השוואתית (2.74 Å/pixel) מעל הקצה האפי על מרוזואיט בוגר מסכיזונט שטופל ב-E64 לפני הקפאה וכרסום (תרשים 8). זה מראה שהקצה האפי של המרוזואיט מכיל שני אברוני הפרשה בולטים בצורת מועדון הנקראים רופטריות, השוכנים בתוך קבוצה של שלוש טבעות קוטביות בקצה האפי של התא ומוקפים במספר אברוני הפרשה קטנים יותר הנקראים מיקרונמים. טבעת הקוטב הפנימית ביותר מחוברת למבנה קרום כפול העומד בבסיס קרום הפלזמה של המרוזואיטים, הנקרא קומפלקס הממברנה הפנימית, המכיל חלבונים מוטוריים המניעים פלישה. הוכח כי במהלך הפלישה התוכן של אברוני ההפרשה משתחרר על פני השטח של המרוזואיטים ולתוך תא הדם האדום המארח, מה שמקל על התקשרות של מרוזואיטים לתאים אדומים מארחים ויוזם את הקומפלקס המוטורי המניע פלישה45. הנתונים כאן מראים כי לאחר הפלישה, המרוזואיט אינו מכיל מבנים נצפים הדומים לראופטריות, מיקרונמים או טבעות קוטביות, דבר המצביע על כך שהמורפולוגיה של הקצה האפי של המרוזואיט משתנה באופן דרמטי. היתוך של רופטריות לפני הפלישה הוכח בעבר על ידי TEM של מקטעים קבועים בטמפרטורת החדר46אשר עולה בקנה אחד עם הייצור של תכונה בצורת פטרייה שאנו רואים במצב שלנו לאחר הפלישה merozoite., ערימות הממברנות המחוברות לתכונה זו לא נצפו בעבר ומכיוון שאין אינדיקציה להימצאות IMC במרוזויט שזה עתה פלש, אנו משערים כי ערימות הממברנות עשויות להיות שרידים של מכונות IMC שנותרו לאחר השלמת הפלישה, אך עדיין יש לאשר זאת. איור 8: הקצה האפי של מרוזואיטים בוגרים על-ידי cryo-ET של למלה טחונה FIB ו-TEM של חתכי פלסטיק. (A) ממוצע של 20 פרוסות מרכזיות מטומוגרפיה של 8x binned (2.74 Å/pixel) מלמלה בעובי 230 ננומטר, המראה את המורפולוגיה האופיינית של הקצה האפי של מרוזויט בוגר. הסכיזונטים טופלו ב-E64 לפני הקפאת הצוללת, ולכן קרום ה-PV נקרע והמרוזואיטים נמצאים בתוך התא האדום המארח. (B) מראה זהה ל-(A), אבל עם ביאורים כדי לציין את קרום תאי הדם האדומים המארחים (RCM, אדום), את קרום הפלזמה של המרוזואיטים (ירוק), את קומפלקס הממברנה הפנימית (IMC, סגול), טבעות קוטביות (PR, שחור), מיקרונמים (M, צהוב), רופטריות (R, אפור) ואת המעטפת הגרעינית (NE, כחול). מרוזויט שכן, אשר מחוץ למישור באזור זה של טומוגרפיה מסומן על ידי משולש ירוק. סרגל קנה מידה, 200 ננומטר. (C) התכונות התאיות שנצפו על-ידי cryoET תואמות לאלה של TEM של סכיזונטים שנשמרו בקטעי פלסטיק. תכונות תאיות דומות מסומנות במרוזואיט בוגר מסכיזונט שטופל בתרכובת 2, עיכוב היציאה לפני קרע קרום PV. סרגל קנה מידה, 500 ננומטר. (D) סכמה מוערת של מרוזואיט המראה את התכונות הסלולריות בחלקים (A-C). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. עובי האזור המוגן בין תבניות הכרסום המלבניות (מיקרומטר) זרם קרן יון נומית (pA) ב- 30 kV 3 300 1.5 100 0.75 50 0.3 30 0.2 – 0.06 (ליטוש סופי) 30* טבלה 1: אסטרטגיית כרסום לייצור למלה דקה. כרסום שלב מתבצע על ידי הפחתת זרם קרן היונים המתאים לעובי האזור המוגן. זה מגביל את חימום הדגימה, ומונע סטייה. *יש לבצע את הליטוש במקביל כדי להפעיל חום אחיד על הלמלה משני הצדדים, ובכך להפחית את הסיכון שהן יתכופפו או ישתחוו כשהן מגיעות לעובי הסופי שלהן. צעדים אחרים יכולים להיעשות ברצף, כרסום את התבנית מעל lamella ולאחר מכן מתחת lamella, לפני המעבר לזרם הקרן הבא. סקר הרשת לאיתור עמדות כרסום צריך להתבצע בזרם קרן של 1.5 pA כדי למזער את חימום הדגימה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Discussion

בעוד שכריית קריו-FIB הופכת שגרתית יותר, הכנת דגימות אופטימליות לטחינה לא; לכן, רוב השלבים הקריטיים בפרוטוקול זה מתרחשים לפני שהדגימה מגיעה ל- cryoFIB-SEM. אופטימיזציה של הדגימה על ידי סבבים מרובים של הכנת תאים, הקפאת צלילה וסינון על ידי מיקרוסקופ אור ואלקטרונים נדרשים כדי להפיק את הדגימה הטובה ביותר האפשרית לפני ניסיון הטחינה. לאחר המדגם הטוב ביותר האפשרי לא רק מגדיל את סיכויי ההצלחה, אלא גם מייעל את השימוש בציוד. מסיבה זו, רוב המתקנים הלאומיים דורשים ראיות לכך שבוצעה אופטימיזציה מספקת לפני מתן זמן למכונות שלהם. ברגע שנכנסים ל-cryoFIB-SEM, מקסום היעילות של ציפוי האורגנופלטינום הוא קריטי על מנת לייצר למלה דקה באופן אחיד. לבסוף, סבלנות וטיפול טוב בדגימות הוא מיומנות הכרחית מהמשתמש, שיידרש לשבת מספר ימים בייצור ולאחר מכן העברת רשתות המכילות למלה עדינה. זה עשוי להשתנות עם הצגת אסטרטגיות כרסום אוטומטיות47,48, אך עדיין, תהליך הכרסום כולו עדיין ידני ברובו ברוב המתקנים.

בעוד שהעבודה התמקדה אך ורק בסכיזונטים של P. falciparum , ניתן היה לשנות בקלות את השיטה המוצגת כאן כדי לייעל את הכנת הרשת והכרסום עבור סוגי תאים אחרים. גורמים חשובים שיש לקחת בחשבון הם צפיפות התאים המיושמים ברשת, סוג הרשת (נחושת רעילה לתאים מסוימים), גודל וריווח החורים בסרט הפחמן, זמן הניקוי ושיטת הכתמים (חד צדדית/דו-צדדית, ידנית או אוטומטית). בנוסף, אם התאים גדלים על הרשתות (בדרך כלל רשתות זהב עם סרט פחמן חורי), ניתן לבדוק את המפגש על ידי מיקרוסקופ אור לפני הכתמה והקפאה. אסטרטגיית הכרסום תלויה באופן שבו התאים מופקדים ברשת. עבור תאי דם אדומים נגועים במלריה, הרשת מצופה למעשה על ידי שכבה בלתי שבורה של תאים, עבה יותר באזורים מסוימים ודלילה יותר באזורים אחרים. הכרסום מתבצע במספר נקודות באזור אחד לאורך שיפוע זה שבו עובי הקרח מייצר lamellae כי הם בגודל מתאים טומוגרפיה. גישה זו פועלת היטב עבור תאים קטנים יותר, שכן ניתן לייצר lamellae המכיל פרוסה דרך תאים מרובים. עבור תאים גדולים יותר או גושים של תאים, זה יכול להיות המקרה כי תא אחד או גוש התא עשוי לייצר lamella אחד.

טיפול ברשת והעברת דגימות נותרו אחד האתגרים העיקריים של זרימת עבודה זו. Lamellae יכול ללכת לאיבוד עקב שברים או סדקים, וילונות חפצים לטשטש את הביולוגיה, זיהום מוגזם פני השטח, כמו גם בעיות כיוון הרשת בתוך TEM, הדורשים שלב טיפול נוסף כדי למקם מחדש את הרשת. מידת ההפסדים משתנה מיום ליום ומרשת לרשת, אך היא משתפרת באמצעות תרגול וניסיון בטיפול לאורך זמן. במחקר זה, נמצא כי ניתן לכוון מחדש בזהירות את הרשתות בטוען האוטומטי מספר פעמים מבלי להרוס lamellae וזה לפעמים יש את היתרון של שטיפת קרח פני השטח. מגבלה עיקרית נוספת של זרימת עבודה זו היא הזמן שלוקח לייצר lamellae. מכיוון שהייצור איטי, קריטי לקבל מדגם אופטימלי כראוי, מה שהופך את הכרסום ליעיל ככל האפשר.

לאחרונה הוצגו מספר התאמות לטחינת FIB של דגימות ביולוגיות זגוגיות. משנה משחק הוא היישום של כלי הרמה מקוררים קריוגנית בתוך תא cryoFIB-SEM המאפשרים לטחון בלוקים גדולים יותר של חומר מדגימות קפואות בלחץ גבוה. ניתן לחבר את הבלוקים למוט מתכת או להרים אותם באחיזה ולהעביר אותם למצב דגימה שני, המכיל רשת EM ששונתה במיוחד. לאחר מכן ניתן לצפות את הבלוקים באורגנופלטינום ולטחון אותם ליצירת למלה. היכולת לטחון lamellae מחומר קפוא בלחץ גבוה פירושו שניתן לעבד תאים ורקמות גדולים בהרבה, במיוחד להתמקד באזורים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתאם12. התאמות אחרונות אחרות לשיטת הכרסום FIB כוללות הפחתת תוצרי וילונות על ידי כרסום טריז מראש של הדגימה16, קיבוע קריופלואיד מיקרופלואידי49 ופוטו-מיקרו-תבניות של רשתות מיקרוסקופיית אלקטרונים לשיפור התפלגות התא50. כמו כן, הוכח כי כרסום רווחי מיקרו-התפשטות משני צדי הלמלה יכול להקל על הדחיסה על ידי הדגימה הסובבת אותה כשהיא מגיעה לדקיקות הסופית שלה51. זה עשוי להיות שימושי במיוחד בעת כרסום שכבות תאים רציפות, כמו הדגימה במחקר זה, שם נראה לפעמים כיפוף של lamellae במהלך שלב הליטוש הסופי.

העתיד של מיקרוסקופ אלקטרונים יהיה ככל הנראה קביעת מבנים מולקולריים באתרם על ידי ממוצע תת-טומוגרפיה וכרסום FIB הוא כלי חשוב שיקל על ייצור דגימות ביולוגיות זגוגיות עבור סוגים אלה של זרימות עבודה. בעוד שכרסום FIB עדיין בחיתוליו עבור יישומים ביולוגיים, פיתוח שיטות מתרחש בקצב מהיר הודות לעבודה הקשה של חוקרים, הן אקדמיים והן במתקנים לאומיים, בתוספת השקעה מסחרית בפיתוח טכנולוגיית cryoFIB-SEM לתמיכה במחקר.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה מומן במלואו או בחלקו על ידי Wellcome Trust (212916/Z/18/Z). לצורך גישה פתוחה, המחבר החיל רישיון זכויות יוצרים ציבורי CC BY לכל גרסה של כתב היד המקובל על המחבר הנובעת מהגשה זו.

פרויקט זה שעבורו פותחה שיטה זו מומן על ידי מענק MR/P010288/1 של המועצה למחקר רפואי שהוענק להלן ר. סאיביל, רולנד א. פלק ומייקל ג’ בלקמן. תרבויות של P. falciparum גודלו במכון פרנסיס קריק, בתמיכת חברי הקבוצה של מייקל ג’יי בלקמן. המחברים רוצים להודות לד”ר סר יינג (מישל) טאן על שסיפק את התמונות של סכיזונטים שטופלו בתרכובת 2 ו-E64 בכתמי דם דקים. רוב הלמלות יוצרו בתמיכת צוות eBIC ואנו אסירי תודה על הגישה ל- Scios dual-beam cryoFIB-SEM בהצעת מחקר NT21004. המחברים מודים גם על תמיכתה של תוכנית מלגות התעשייה של החברה המלכותית (INF\R2\202061) בהמשך הפיתוח של טכניקת כרסום FIB בתוך CUI. המחברים רוצים גם להודות להלן ר. סאיביל על דיונים מועילים ביחס למאמר שיטות זה ופיקוח על הפרויקט.

Materials

c-clips Thermo Fisher Scientific 1036171
Clipping station Thermo Fisher Scientific n/a Direct quote from Thermo
Clipping station Sub-angstrom CSA-01
Compound 2 n/a n/a Synthesised by Dr Simon A. Osborne, LifeArc
Cryo-FIB specific autogrid rims Thermo Fisher Scientific 1205101
E64 Sigma E3132
Emitech K100X glow discharge unit Quorum n/a
Gibco RPMI 1640 media Thermo Fisher Scientific 12633012 Formulation used for culturing is custom made (REF 041-91762 A) and includes Albumax, glutamine, HEPES and hypoxanthine supplements
Giemsa Stain VWR International 350864X
Glass slides Thermo Fisher Scientific 11562203
Grid boxes Sub-angstrom PB For clipped grids
Grid boxes Thermo Fisher Scientific n/a For clipped grids – direct quote from Thermo Fisher Scientific
Grid boxes Agar Scientific AGG3727
Home-made manual plunge freezing rig n/a n/a With an insulated ethane pot (high-density foam) and liquid nitrogen bath (polystyrene) on a bench top in a containment facility.
Human blood n/a n/a UK National Blood and Transplant service
JEOL 4700F Z JSM with a Leica VCT500 stage cooling system JEOL n/a FIB-SEM
Leica EM ACE600 with a VCT500 cryostage Leica n/a sputter coater
Leica EM ACE900 Leica n/a e-beam rotary coater. In a humidity controlled room.
Linkam cryo-stage for light microscope Linkam Model No. CMS196 Cassettes for clipped and un-clipped grids. In a humidity controlled room.
Methanol Sigma 179957
Nikon Eclipse E200 light microscope Nikon n/a with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.
Percoll VWR International 17-0891-01 Solution for percoll cushion is 35 ml 10x PBS, 150 ml RPMI 1640 media and 315 ml Percoll
Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM Finder grids Quantifoil N1-C17nCuH2-01 100 pack
Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM grids Quantifoil N1-C17nCu20-01 100 pack
Quorum PP3010 prep-chamber Quorum n/a sputter coater
Scios dual beam equipped with a Quorum PP3010 transfer stage. FEI n/a FIB-SEM
Staedtler Lumocolor fine black permanent marker pen Viking Direct ND538522
TFS Titan Krios 300 kV TEM Thermo Fisher Scientific n/a TEM equipped with a K2 or K3 camera.
Whatmann grade 1 filter paper Sigma WHA1001150
Zeiss Axio Scope A1 light microscope Zeiss n/a with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baumeister, W. From proteomic inventory to architecture. FEBS Letters. 579 (4), 933-937 (2005).
  2. Rigort, A., Villa, E., Bäuerlein, F. J. B., Engel, B. D., Plitzko, J. M. Integrative approaches for cellular cryo-electron tomography: Correlative imaging and focused ion beam micromachining. Methods in Cell Biology. 111, 259-281 (2012).
  3. Oikonomou, C. M., Chang, Y. W., Jensen, G. J. A new view into prokaryotic cell biology from electron cryotomography. Nature Reviews Microbiology. 14, 205-220 (2016).
  4. Wagner, F. R., et al. Preparing samples from whole cells using focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Nature Protocols. 15 (6), 2041-2070 (2020).
  5. Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. A review of focused ion beam milling techniques for TEM specimen preparation. Micron. 30 (3), 197-204 (1999).
  6. Narayan, K., Subramaniam, S. Focused ion beams in biology. Nature Methods. 12 (11), 1021-1031 (2015).
  7. Rigort, A., et al. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proceedings of the National Acadamy of Science of the United States of America. 109 (12), 4449-4454 (2012).
  8. Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nature Methods. 4 (3), 215-217 (2007).
  9. Villa, E., Schaffer, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Opening windows into the cell: Focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography. Current Opinion in Structural Biology. 23 (5), 771-777 (2013).
  10. Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. 3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 180 (2), 318-326 (2015).
  11. de Winter, D. A. M., et al. In-situ integrity control of frozen-hydrated, vitreous lamellas prepared by the cryo-focused ion beam-scanning electron microscope. Journal of Structural Biology. 183 (1), 11-18 (2013).
  12. Schaffer, M., et al. A cryo-FIB lift-out technique enables molecular-resolution cryo-ET within native Caenorhabditis elegans tissue. Nature Methods. 16 (8), 757-762 (2019).
  13. Mahamid, J., et al. Visualizing the molecular sociology at the HeLa cell nuclear periphery. Science. 351 (6276), 969-972 (2016).
  14. Albert, S., et al. Proteasomes tether to two distinct sites at the nuclear pore complex. Proceedings of the National Acadamy of Science of the United States of America. 114 (52), 13726-13731 (2017).
  15. Guo, Q., et al. In situ structure of neuronal C9orf72 poly-GA aggregates reveals proteasome recruitment. Cell. 172 (4), 696-705 (2018).
  16. Schaffer, M., et al. Optimized cryo-focused ion beam sample preparation aimed at in situ structural studies of membrane proteins. Journal of Structural Biology. 197 (2), 73-82 (2017).
  17. Szwedziak, P., Wang, Q., Bharat, T. A. M., Tsim, M., Löwe, J. Architecture of the ring formed by the tubulin homologue FtsZ in bacterial cell division. eLife. 3, 04601 (2014).
  18. Carlson, L. A., et al. Cryo electron tomography of native HIV-1 budding sites. PLOS Pathogens. 6 (11), 1001173 (2010).
  19. Klein, S., et al. SARS-CoV-2 structure and replication characterized by in situ cryo-electron tomography. Nature Communications. 11 (1), 5885 (2020).
  20. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: Bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and Cell Biology. 130 (5), 877-889 (2008).
  21. Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. Journal of Structural Biology. 184 (2), 355-360 (2013).
  22. Murphy, G. E., et al. Correlative 3D imaging of whole mammalian cells with light and electron microscopy. Journal of Structural Biology. 176 (3), 268-278 (2012).
  23. Heymann, J. A. W., et al. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. Journal of Structural Biology. 155 (1), 63-73 (2012).
  24. Spehner, D., et al. Cryo-FIB-SEM as a promising tool for localizing proteins in 3D. Journal of Structural Biology. 211 (1), 107528 (2020).
  25. Kamino, T., Yaguchi, T., Ohnishi, T., Ishitani, T., Osumi, M. Application of a FIB-STEM system for 3D observation of a resin-embedded yeast cell. Journal of Electron Microscopy. 53 (5), 563-566 (2004).
  26. Han, H., Zuber, B., Dubochet, J. Compression and crevasses in vitreous sections under different cutting conditions. Journal of Microscopy. 230, 167-171 (2008).
  27. Matias, V. R. F., Al-amoudi, A., Dubochet, J., Beveridge, T. J. Cryo-transmission electron microscopy of frozen-hydrated sections of Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (20), 6112-6118 (2003).
  28. Al-Amoudi, A., Studer, D., Dubochet, J. Cutting artefacts and cutting process in vitreous sections for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 150 (1), 109-121 (2005).
  29. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. The EMBO Journal. 23 (18), 3583-3588 (2004).
  30. Bouchet-Marquis, C., Dubochet, J., Fakan, S. Cryoelectron microscopy of vitrified sections: A new challenge for the analysis of functional nuclear architecture. Histochemistry and Cell Biology. 125 (1-2), 43-51 (2006).
  31. Hayles, M. F., et al. The making of frozen-hydrated, vitreous lamellas from cells for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 172 (2), 180-190 (2010).
  32. Dubochet, J., Adrian, M., Chang, J. -. J., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryoelectron microscopy of vitrified specimens. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. , 114-131 (1987).
  33. Hsieh, C., Schmelzer, T., Kishchenko, G., Wagenknecht, T., Marko, M. Practical workflow for cryo focused-ion-beam milling of tissues and cells for cryo-TEM tomography. Journal of Structural Biology. 185 (1), 32-41 (2014).
  34. Harapin, J., et al. Structural analysis of multicellular organisms with cryo-electron tomography. Nature Methods. 12 (7), 634-636 (2015).
  35. Rubino, S., et al. A site-specific focused-ion-beam lift-out method for cryo Transmission Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 180 (3), 572-576 (2012).
  36. Duyvesteyn, H. M. E., et al. Machining protein microcrystals for structure determination by electron diffraction. Proceedings of the National Acadamy of Science of the United States of America. 115 (38), 9569-9573 (2018).
  37. Blackman, M. J. Purification of Plasmodium falciparum merozoites for analysis of the processing of merozoite surface protein-1. Microbes as Tools for Cell Biology. 45, 213-220 (1995).
  38. Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging. Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).
  39. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2 – anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  40. Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
  41. Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).
  42. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  43. Turoňová, B., Schur, F. K. M., Wan, W., Briggs, J. A. G. Efficient 3D-CTF correction for cryo-electron tomography using NovaCTF improves subtomogram averaging resolution to 3.4 Å. Journal of Structural Biology. 199 (3), 187-195 (2017).
  44. Arnold, J., et al. Site-specific cryo-focused ion beam sample preparation guided by 3d correlative microscopy. Biophysical Journal. 110 (4), 860-869 (2016).
  45. Riglar, D. T., et al. Super-resolution dissection of coordinated events during malaria parasite invasion of the human erythrocyte. Cell Host & Microbe. 9 (1), 9-20 (2011).
  46. Hanssen, E., et al. Electron tomography of Plasmodium falciparum merozoites reveals core cellular events that underpin erythrocyte invasion. Cellular Microbiology. 15 (9), 1457-1472 (2013).
  47. Buckley, G., et al. Automated cryo-lamella preparation for high-throughput in-situ structural biology. Journal of Structural Biology. 210 (2), 107488 (2020).
  48. Zachs, T., et al. Fully automated, sequential focused ion beam milling for cryo-electron tomography. eLife. 9, 52286 (2020).
  49. Fuest, M., et al. In situ microfluidic cryofixation for cryo focused ion beam milling and cryo electron tomography. Scientific Reports. 9 (1), 19133 (2019).
  50. Toro-Nahuelpan, M., et al. Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies. Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).
  51. Wolff, G., et al. Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of FIB-milled cryo-lamellae. Journal of Structural Biology. 208 (3), 107389 (2019).

Tags

Vitreous LamellaeCryo-electron TomographyPlasmodium FalciparumRed Blood CellsMalariaProtein ComplexesCryo-FIB-SEMOrganoplatinum CoatingIon Beam Milling

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bisson, C., Hecksel, C. W., Gilchrist, J. B., Carbajal, M. A., Fleck, R. A. Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography. J. Vis. Exp. (174), e62350, doi:10.3791/62350 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image