Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Claudine Bisson; Corey W. Hecksel; James B. Gilchrist; M. Alejandra Carbajal; Roland A. Fleck

doi:10.3791/62350

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Biochemistry

Préparation de lamelles à partir d’échantillons biologiques vitreux à l’aide d’un microscope électronique à balayage à double faisceau pour la cryotomographie électronique

Published: August 05, 2021

doi:

10.3791/62350

Claudine Bisson^1,2, Corey W. Hecksel^3,4, James B. Gilchrist³, M. Alejandra Carbajal¹, Roland A. Fleck¹

¹Centre for Ultrastructural Imaging,New Hunt’s House, Guy’s Campus, King’s College London, ²Department of Biological Science,Birkbeck College, University of London, ³Electron Bio-Imaging Centre,Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus, ⁴SLAC National Accelerator Laboratory,Stanford University

Summary

Utilisation du broyage par faisceau d’ions focalisés pour produire des lamelles vitreuses sur grille à partir d’échantillons biologiques congelés pour la cryotomographie électronique.

Abstract

Un protocole de préparation de cryolamelles à partir de grilles surgelées d’érythrocytes humains infectés par Plasmodium falciparum est présenté ici, qui pourrait facilement être adapté à d’autres échantillons biologiques. Les principes de base pour la préparation des échantillons, le broyage et l’observation des lamelles sont communs à tous les instruments et le protocole peut être suivi comme guide général pour la préparation cryo-lamelle sur grille pour la cryo-microscopie électronique (cryoEM) et la cryo-tomographie électronique (cryoET). Les grilles de microscopie électronique soutenant les cellules sont surgelées dans de l’éthane liquide refroidi à l’azote liquide à l’aide d’un congélateur manuel ou automatisé, puis criblées sur un microscope optique équipé d’un cryo-étage. Les grilles congelées sont transférées dans un microscope électronique cryo-balayage équipé d’un faisceau d’ions focalisés (cryoFIB-SEM). Les grilles sont régulièrement revêtues de pulvérisation avant le broyage, ce qui facilite la dispersion de l’accumulation de charge pendant le fraisage. Alternativement, un revêtement rotatif à faisceau électrique peut être utilisé pour appliquer une couche de carbone-platine sur les grilles, dont l’épaisseur exacte peut être contrôlée plus précisément. Une fois à l’intérieur du cryoFIB-SEM, un revêtement supplémentaire d’un composé organoplatine est appliqué à la surface de la grille via un système d’injection de gaz (SIG). Cette couche protège le bord antérieur de la lamelle lors de son broyage, dont l’intégrité est essentielle pour obtenir des lamelles uniformément minces. Les régions d’intérêt sont identifiées par MEB et le broyage est effectué par étapes, réduisant le courant du faisceau d’ions lorsque la lamelle atteint la transparence des électrons, afin d’éviter une génération excessive de chaleur. Une grille avec plusieurs lamelles est ensuite transférée dans un microscope électronique à transmission (MET) dans des conditions cryogéniques pour une acquisition en série d’inclinaison. Un flux de travail robuste et sans contamination pour la préparation des lamelles est une étape essentielle pour les techniques en aval, y compris la cryoEM cellulaire, la cryoET et la moyenne des sous-tomogrammes. Le développement de ces techniques, en particulier pour le levage et le broyage d’échantillons congelés à haute pression, est hautement prioritaire sur le terrain.

Introduction

Seul le contenu cellulaire d’échantillons biologiques de <500 nm d’épaisseur peut être imagé efficacement par microscopie électronique à transmission (MET) à des températures cryogéniques, limitant ainsi la gamme de spécimens aux virus, aux procaryotes, aux organismes unicellulaires simples et aux régions plus minces des cellules eucaryotes^{plus grandes 1}. Le broyage par faisceau d’ions focalisés sur grille (FIB) permet d’amincir des échantillons biologiques surgelés plus épais en lamelles transparentes aux électrons à des températures cryogéniques (< -150 °C). Les lamelles résultantes sont ensuite transférées dans un TEM pour la visualisation et la collecte de données tomographiques, ce qui permet des reconstructions 3D à haute résolution des caractéristiques cellulaires et moléculaires à l’intérieur des cellules (pour des revues, voir Rigort et al., 2012², Oikonomou et al., 2016³, et Wagner et al., 2020⁴).

Le fraisage FIB a émergé du domaine des sciences des matériaux, où les échantillons sont systématiquement éclaircis pour les préparer à l’analyse en aval⁵. Il est réalisé dans un microscope électronique à balayage (MEB), qui comporte deux colonnes optiques : l’optique classique au microscope électronique à balayage et une seconde colonne contenant des optiques capables de générer et de contrôler finement un faisceau d’ions focalisés (FIB) – appelé FIB-SEM. Cela permet d’ablation d’une région spécifique de l’échantillon par des ions générés par une source de gallium, en éliminant l’excès de matière et en laissant derrière elle une lamelle⁶. Le processus de broyage est guidé par l’imagerie MEB de la topographie de l’échantillon, qui est utilisée pour localiser les régions d’intérêt et surveiller la progression du broyage. Pour les applications biologiques, la configuration de base est en grande partie la même, mais le broyage est effectué à des températures cryogéniques. Cela a nécessité l’adaptation des FIB-SEM standard pour avoir des étages cryo-refroidis qui maintiennent des températures constantes et de faibles taux de contamination de surface, ainsi que des sas pour faciliter le transfert d’échantillons sans dévitrification ni contamination. Les navettes d’échantillons ont également été modifiées pour permettre le montage d’une gamme de supports différents à l’intérieur du cryoFIB-SEM, y compris des grilles TEM, des planchettes et des capillaires. Plusieurs groupes clés de chercheurs ont joué un rôle central dans le développement de ces méthodes et dans les progrès technologiques continus dans ce domaine 7,8,9,10,11,12. Les solutions commerciales sont maintenant plus largement disponibles pour le broyage biologique FIB à température cryogénique et le broyage sur grille des lamelles devient plus courant, compte tenu d’un échantillon optimisé.

Une gamme de techniques de température ambiante et de cryoEM peut être utilisée pour visualiser l’information cellulaire à toutes les échelles de la vie, des organismes multicellulaires entiers à résolution modeste à la compréhension du contexte de processus complexes au niveau cellulaire et, plus en détail encore, à la détermination de in situ Structures moléculaires¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹. Les techniques classiques à température ambiante comprennent la sectionnement des cellules et des tissus fixes et colorés incorporés dans la résine par ultramicrotomie pour l’analyse de la morphologie cellulaire par TEM (pour un examen, voir Studer et coll., 2008²⁰). Des techniques alternatives ont été développées exploitant la diffusion électronique secondaire par MEB pour imager la surface de blocs de cellules préservées, avant d’enlever progressivement le matériau soit avec un couteau (imagerie de face de bloc en série) ou un faisceau d’ions focalisés.²¹^,²²^,²³. Cette technique a également été mise en œuvre avec succès à des températures cryogéniques (appelée imagerie cryo-volume) avec un cryoFIB-SEM sur des blocs vitreux non colorés de cellules ou de tissus²⁴. Alternativement, des lamelles plus épaisses (~15 μm d’épaisseur) peuvent être broyées et étudiées par imagerie STEM²⁵. En utilisant ces techniques, des blocs entiers contenant de nombreuses cellules peuvent être imagés pour recueillir des informations sur la population ou un organe / organisme entier peut être imagé et reconstruit en 3D. Cependant, pour accéder à l’information moléculaire à haute résolution des cellules, les échantillons doivent être conservés dans un état quasi natif, congelé-hydraté et, par conséquent, doivent être préparés dans des conditions cryogéniques. La cryo-microscopie électronique des coupes vitreuses (CEMOVIS) est une technique par laquelle des blocs de matériel biologique congelés à haute pression sont sectionnés dans des conditions cryogéniques avec un ultramicrotome. Cela produit des rubans de cryo-sections (40-100 nm d’épaisseur)²⁶, qui sont attachés à une grille EM et imagés dans le GDT. Cependant, l’interaction physique du couteau avec l’échantillon vitré provoque des cavsanges et des artefacts de compression qui peuvent gravement déformer la structure cellulaire.²⁷^,²⁸^,²⁹^,³⁰. Les sections plus épaisses sont plus sujettes à ces artefacts, ce qui rend impossible l’utilisation de sections plus épaisses que ~70 nm²⁶. Cette limitation restreint considérablement la vue 3D de la structure biologique dans le tomogramme. Le fraisage FIB à des températures cryogéniques ne connaît pas ces problèmes, mais a ses propres artefacts causés par des vitesses de broyage différentielles sur certaines parties de l’échantillon, conduisant à des épaisseurs variables dans une lamelle – appelée rideau. Ce problème est atténué par l’application d’une couche organoplatine appliquée via un système d’injection de gaz (SIG), qui protège le bord avant de la lamelle pendant le broyage.³¹. La limite supérieure de l’épaisseur de l’échantillon pour le broyage FIB sur grille est définie par la capacité de congeler l’échantillon tout en le maintenant vitreux³², bien que, avec l’introduction de techniques de cryolevage et de supports d’échantillons adaptés aux échantillons biologiques, le broyage FIB peut également être utilisé pour traiter des échantillons congelés à haute pression³¹^,³³^,³⁴^,³⁵. De plus, les échantillons congelés ne peuvent pas être trop minces, car il doit y avoir suffisamment de matériel biologique pour générer une lamelle de taille raisonnable qui fournira une surface suffisante pour recueillir des séries d’inclinaison au grossissement requis. Ce problème peut être atténué en broyant des amas de cellules plus petites, telles que des bactéries ou des levures. L’épaisseur finale des lamelles (~100-300 nm) est généralement dictée par l’intégrité de l’échantillon et la stratégie de broyage. Les lamelles plus minces sont préférables pour les travaux structurels à haute résolution, tels que la moyenne des sous-tomogrammes, mais les lamelles plus épaisses contiennent des volumes cellulaires beaucoup plus importants que ceux qui peuvent être atteints par CEMOVIS, fournissant plus de contexte cellulaire dans un échantillon presque préservé nativement. Le broyage FIB peut également être utilisé pour amincir les cristaux de protéines surgelés pour les études de diffraction électronique³⁶.

Le broyage FIB des cellules vitreuses vaut le temps et les efforts à réaliser si la question scientifique nécessite des détails moléculaires à haute résolution de spécimens quasi natifs in situ. Avec l’accès à plus d’installations pour la production de routine de lamelles, l’étape limitant la vitesse est souvent l’optimisation de l’échantillon avant le broyage, où le temps doit être pris pour s’assurer que l’échantillon est vitreux et d’une épaisseur appropriée pour produire des lamelles robustes et uniformément minces. L’optimisation de l’échantillon pour les globules rouges humains surgelés par bac FIB infectés par des parasites Plasmodium falciparum , l’agent causal du paludisme, est décrite ici, mais cette approche pourrait être adaptée à n’importe quel échantillon donné.

Protocol

Le sang humain a été obtenu à partir de donneurs anonymes par l’intermédiaire du service national de sang et de transplantation du Royaume-Uni et est utilisé dans les 2 semaines suivant la réception. Aucune approbation éthique n’est requise pour son utilisation. 1. Préparation et congélation des globules rouges infectés par Plasmodium falciparum Isoler les schizontes matures par centrifugation (1 580 x g) sur un milieu gradient de densité isotonique de 70 % (v/v) (pour les procédures standard sur la façon de cultiver des stades sanguins asexués de 3D7 Plasmodium falciparum dans des érythrocytes humains, voir Blackman M.J., 199537). Fixez les fines pellicules de sang séchées à l’air sur une lame de verre avec 100% de méthanol pour vérifier l’homogénéité morphologique des schizontes avant de les colorer avec 10% de Giemsa dans un tampon phosphate de 6,7 mM, pH 7,1.REMARQUE : Pour enrichir la préparation des schizontes bloqués à des points spécifiques de sortie, les schizontes peuvent être synchronisés davantage avec les inhibiteurs des composés 2 et E64 (voir Résultats représentatifs et Figure 1 pour une explication de l’effet de ces inhibiteurs).MISE EN GARDE : Plasmodium falciparum est un agent pathogène humain et ne doit être manipulé que dans une installation de confinement appropriée, conformément aux directives locales en matière de santé et de sécurité. Centrifuger doucement les schizontes (240 x g) pour les granuler et les remettre en suspension dans 2x le volume de la pastille cellulaire de média RPMI, ce qui donne une suspension d’hématocrite à 50%. Sur une plate-forme de congélation manuelle, appliquer 2,5 μL de schizonts sur le côté carbone d’une grille en cuivre à 200 mailles à décharge luminescente (utilisez des réglages d’unité de décharge luminescente de 60 s, 30 mA dans l’air, en traitant uniquement le côté carbone de la grille) avec un film de carbone à 2/4 de trou et un transfert pendant ~20 s à partir de l’arrière de la grille en utilisant du papier filtre de grade 1 avec un bord déchiré. Plongez dans de l’éthane liquide refroidi à l’azote liquide et transférez les grilles pour les stocker (voir le tableau des matériaux pour l’équipement utilisé dans cette étude).REMARQUE: L’expérience peut être interrompue ici et les grilles peuvent être stockées indéfiniment sous azote liquide.ATTENTION : L’azote liquide est un asphyxiant et provoque des engelures; Manipuler avec précaution dans un environnement approprié avec surveillance de l’oxygène.ATTENTION : L’éthane liquide provoque de graves brûlures et est inflammable; Utiliser dans une hotte loin des sources d’inflammation.REMARQUE: Les schizontes congelés ne sont plus viables. Cela a été déterminé en incubant du sang humain avec plusieurs grilles d’or de schizontes surgelés à l’air et en n’observant aucune croissance parasitaire après plusieurs jours, par rapport aux témoins non congelés. Les grilles congelées de schizonts peuvent donc être manipulées en toute sécurité à l’extérieur des installations de confinement en utilisant les procédures normales de sécurité et de décontamination (gants, stérilisation des surfaces et des outils avec de l’éthanol >70 % et élimination des grilles dans de l’éthanol >70 %). Grilles d’écran utilisant un cryo-étage pour un microscope optique, en accordant une attention particulière au gradient de glace à travers la grille. Dans les zones les plus minces de la glace, vérifiez les carrés de la grille individuelle pour la couverture cellulaire.REMARQUE : Les meilleurs carrés doivent avoir une épaisseur de cellule au centre du carré de la grille (Figure 2). Cela garantit qu’une lamelle peut être broyée au centre du carré sans heurter la glace plus épaisse sur les bords contre les barres de la grille. L’expérience peut être interrompue ici, et les grilles peuvent être stockées sous azote liquide indéfiniment. Si les cellules portent un marqueur fluorescent, les grilles peuvent également être criblées par cryoCLEM pour localiser les positions X/Y d’intérêt, qui peuvent être corrélées avec les emplacements de grille dans le cryoFIB-SEM pour un broyage direct. 2. Fraisage FIB sur grille de cellules surgelées Marquez l’avant des jantes de grille automatique spécifiques à cryoFIB avec un marqueur noir indélébile pour indiquer le centre de la section coupée et le côté opposé de la jante (Figure 3). Installez la station d’écrêtage et les grilles de clip dans les anneaux marqués côté carbone vers le bas. Chargez les grilles dans la navette cryoFIB-SEM (généralement 2 grilles, selon la navette) côté carbone vers le haut et appliquez une couche de pulvérisation de platine dans une atmosphère d’argon (5 x 10-2 mbar) (5 mA pendant 60 s – l’épaisseur est variable) ou une couche rotative à faisceau e carbone / platine (~ 4 nm d’épaisseur) à la surface des cellules.REMARQUE: Les deux types de revêtements facilitent la dispersion de la charge pendant l’imagerie SEM. L’avantage de l’enduit rotatif à faisceau électrique est que l’épaisseur exacte du revêtement peut être spécifiée. Chargez la navette dans le cryoFIB-SEM et évaluez la distribution des cellules sur chaque grille par SEM à 5 kV (13 pA ou 25 pA). Prenez une vue d’ensemble à faible grossissement (~100x) pour examiner les gradients de glace sur la grille. Ensuite, prenez des images à fort grossissement (~ 5 000x) pour examiner les carrés individuels de la grille et identifier les zones de la grille présentant des caractéristiques cellulaires visibles et une faible contamination de surface à usiner. Appliquez une couche organoplatine de >2 μm sur la surface de chaque grille à l’aide du système d’injection de gaz (SIG). Pour ce faire, insérez l’aiguille SIG dans la chambre au-dessus de la grille et réchauffez la source organoplatine à une température définie pendant un temps défini (par exemple, ~27 °C pendant 3-10 s) pour produire un flux de vapeur.REMARQUE: L’angle d’application, la température et le moment de la couche organoplatine via l’aiguille SIG doivent être optimisés pour maximiser un revêtement uniforme. Cela dépendra du cryoFIB-SEM spécifique utilisé (voir Résultats représentatifs pour plus d’explications). Inclinez l’échantillon de sorte que le plan de la grille soit ~10° par rapport à l’angle d’incidence du faisceau d’ions et déplacez le centre d’un carré de grille approprié pour être vu dans les images SEM et FIB. Surveillez la grille à l’aide du faisceau d’ions à faible courant (nominalement 1,5 pA, 30 kV) et passez à un grossissement suffisamment élevé (~ 7 000x) pour visualiser les cellules au centre d’un carré de grille. Mettre l’échantillon au point au premier courant de broyage (300 pA) et corriger l’astigmatisme. Ajustez la luminosité et le contraste, puis tracez deux motifs rectangulaires à fraiser, l’un au-dessus et l’autre au-dessous d’une région protégée de 3 μm d’épaisseur, dont le centre est l’emplacement souhaité de la lamelle finale.Remarque : La largeur choisie des motifs dépendra de la topographie de la couche cellulaire environnante et de la taille de la cellule. 7-20 μm est une largeur appropriée pour les schizontes, mais les lamelles plus larges prennent plus de temps à moudre. La hauteur choisie des motifs pour la première étape de fraisage dépend de l’épaisseur de l’échantillon, à partir d’environ 6 μm; Cela peut avoir besoin d’être ajusté pendant le fraisage. Le fraisage est effectué de manière directionnelle à partir des bords extérieur supérieur et inférieur des motifs vers la face de la lamelle. Cela peut être fait en parallèle, où les deux motifs sont broyés simultanément ou séquentiellement, en enlevant d’abord le matériau au-dessus de la lamelle, puis en dessous. Commencer le fraisage au premier courant; surveiller la progression en direct dans la vue du faisceau d’ions et par intermittence par MEB (5 kV, 13 ou 25 pA). Vérifiez que le faisceau d’ions a traversé l’échantillon au-dessus et au-dessous de la région protégée. Sinon, augmentez la hauteur des motifs rectangulaires pour enlever plus de matière. Arrêtez-vous lorsque la surface au-dessus et au-dessous de la lamelle est complètement lisse dans la vue du faisceau d’ions.REMARQUE: Le faisceau d’ions a percé l’échantillon au-dessus et au-dessous de la région protégée lorsque l’intérieur des motifs rectangulaires ne contient aucune caractéristique dans le plan focal. Certaines entités, telles que les barres de grille, peuvent être visibles flou en arrière-plan. Passage au courant de fraisage suivant (100 pA); Effectuez la mise au point et ajustez la luminosité / contraste. Réduisez l’espace entre les deux motifs rectangulaires à 1,5 μm et diminuez la hauteur du motif pour ne couvrir que le matériau non fraisé. Commencez à moudre au nouveau courant jusqu’à ce que la surface au-dessus et au-dessous de la lamelle soit complètement lisse. Répétez ce processus étape jusqu’à ce qu’une épaisseur de 0,3 μm soit atteinte, en réduisant le courant du faisceau d’ions à chaque fois selon le schéma de fraisage du tableau 1. Fraiser plusieurs lamelles (la quantité dépend de l’épaisseur de l’échantillon et du temps disponible) sur une ou les deux grilles à une épaisseur de 0,3 μm, noter la position X/Y/Z de chaque lamelle et réserver ~1-2 h à la fin de la séance pour polir les lamelles à leur épaisseur finale (60-200 nm). Prenez une vue d’ensemble SEM à faible grossissement de l’ensemble de la grille et planifiez un itinéraire de polissage partant des lamelles à l’avant de la grille (plus près de la source du faisceau d’ions) aux lamelles à l’arrière de la grille (les plus éloignées de la source du faisceau d’ions) (Figure 5).NOTE: Cela réduit le redépôt du matériau ablé sur la surface des lamelles polies. Réduisez l’espace entre les deux motifs rectangulaires à 100-200 nm et commencez l’étape finale de polissage à un courant de faisceau d’ions de 30 pA. Surveillez la progression par MEB à 2-3 kV (13 pA, palier = 300 n, 3072 x 2048, ~2 s pour un plein cadre) et arrêtez le polissage lorsque le contraste est perdu dans la lamelle par MEB ou lorsque la couche organoplatine de la lamelle elle-même commence à perdre son intégrité. Avant de retirer les grilles, obtenez une image MEB à faible grossissement de l’ensemble de la grille et enregistrez des images de chaque lamelle. Utilisez-les pour recouper la grille plus tard dans le TEM. Mettez l’expérience en pause ici et stockez les grilles avec des lamelles sous azote liquide – manipuler avec soin.REMARQUE: Les grilles peuvent être légèrement enduites de pulvérisation lors de leur retrait du cryoFIB-SEM, ce qui peut aider à limiter la dérive et la charge dans le TEM à fort grossissement, mais cela doit être fait avec prudence car trop de revêtement de pulvérisation peut obscurcir le contenu biologique à l’intérieur des lamelles. Il est possible de dépister la fluorescence des lamelles à ce stade; Cependant, l’obtention d’un signal suffisant dépendra de l’abondance de la protéine marquée dans l’épaisseur de la lamelle. Un grand soin doit être apporté à la manipulation des grilles pour limiter les dommages aux lamelles et éviter la contamination de surface. 3. Acquisition en série Tilt et aperçu général du traitement des données Chargez les grilles dans le TEM, en alignant la direction de fraisage perpendiculairement à l’axe d’inclinaison de la scène.REMARQUE: L’alignement des grilles se fait à l’œil nu à l’aide des marques sur le bord de la grille automatique. Une marge d’erreur de ~10° est acceptable, sinon les parois de la tranchée de chaque côté de la lamelle peuvent obscurcir la lamelle lorsque la grille est inclinée. Acquérir une carte à faible grossissement (~150x) de l’ensemble de la grille et localiser les lamelles; Ensuite, procurez-vous une carte de grossissement moyen (~1 500x, selon la taille des lamelles) de chaque lamelle et localisez les zones d’intérêt. Pré-incliner la grille de ±10° pour rendre le plan de la lamelle (pas la grille) perpendiculaire à l’axe optiqueNOTE: La direction de la pré-inclinaison peut être déterminée par la position du bord avant des lamelles (à la recherche de la couche organoplatine restante) dans les cartes de grossissement faible et moyen. Pour le TEM utilisé ici, les grilles nécessitent une pré-inclinaison de +10° si les bords antérieurs des lamelles pointent vers le haut sur les cartes et nécessitent une pré-inclinaison de -10° si elles pointent vers le bas. Chaque grille peut être différente en raison de la façon dont elles ont été ramassées et insérées dans le chargeur automatique. Acquérir la série d’inclinaison symétrique de dose38 (par exemple, -54° à +54° avec un incrément de 3-5°) à une taille de pixel qui permet à la fois le champ de vision et la résolution requis pour la région d’intérêt. Utilisez une plage de valeurs de flou comprise entre -2 et -5 μm. Collectez des films avec 3-10 images à chaque incrément et pour cela, ajustez ces paramètres en fonction de la taille des pixels pour accumuler une dose totale de ~150 e-/Å2 (pour un TEM 300 kV).REMARQUE: Les fissures dans la lamelle doivent être évitées car ces régions peuvent dériver. La contamination de surface doit également être évitée, car elle peut masquer la région d’intérêt ou la zone de mise au point à forte inclinaison. Motion corrige les films à l’aide d’un programme tel que MotionCor239. Appliquer un filtre de pondération de dose aux images corrigées (e-/image accumulée)40 et estimer la défocalisation de chaque image à l’aide d’un programme tel que CTFFIND441. Utilisez l’alignement sans fiducielle (suivi des patchs) dans un programme tel que etomo (IMOD)42 pour calculer l’alignement et la relation angulaire des images en série tilt. Entrez les informations d’alignement et de rotation, ainsi que les valeurs de défocalisation dans un programme qui peut appliquer une correction CTF tridimensionnelle, par exemple, NovaCTF43. Calculer un tomogramme corrigé pour obtenir des tomogrammes de sortie avec des facteurs de regroupement pertinents pour l’analyse en aval. Analysez les reconstructions et préparez-vous à tout traitement en aval, par exemple, le filtrage, la segmentation ou la moyenne des sous-tomogrammes.

Representative Results

Préparation des schizontes de P. falciparum pour la congélationLes inhibiteurs des composés 2 et E64 sont utilisés pour bloquer les schizontes à différents stades de sortie, générant une population enrichie de schizontes pour une étude ultérieure. Ceci est important car sans une technique corrélative complémentaire, le broyage de cibles sous-cellulaires ou de types de cellules spécifiques est difficile car le processus est essentiellement aveugle. Le composé 2 est un inhibiteur de la protéine kinase qui bloque la sortie avant la rupture de la vacuole. Les schizontes peuvent être synchronisés sur le composé 2 pendant 4 h, puis lavés avec un milieu exempt de composé 2 pour éliminer l’inhibiteur, après quoi les schizontes mûriront et sortiront après environ 30 minutes. Alternativement, les schizontes synchronisés composés 2 peuvent être lavés dans E64, un inhibiteur irréversible de la cystéine protéase à large spectre, et incubés pendant environ 1 h pour retarder la sortie après le point de rupture de la vacuole, mais avant la rupture de la cellule hôte. La morphologie et l’homogénéité des schizontes traités doivent être vérifiées par des frottis sanguins colorés par Giemsa avant la congélation (Figure 1). Les schizontes peuvent être congelés dans l’un ou l’autre de ces états en utilisant la méthode décrite dans cette publication. Figure 1 : Morphologie des schizontes de P. falciparum bloqués par le composé 2 et E64 par frottis sanguins colorés par Giemsa. (A) En présence du composé 2, la vacuole parasitophore (PV) est densément remplie de mérozoïtes (cercles violets) avec un seul groupe de cristaux d’hémozoïne (cercle brun foncé). La limite entre la PV et l’hémoglobine environnante dans le globule rouge hôte (hRBC) (bande grise) est bien définie, ainsi que la membrane hRB. (B) En présence de E64, la membrane PV est rompue et les mérozoïtes se répandent dans le hRBC. Chaque schizont contient encore un seul groupe de cristaux d’hémozoïne. La membrane de la cellule hôte fuit et s’effondre partiellement, par conséquent, aucune hémoglobine n’est visible à la périphérie de la cellule et la limite de la membrane hRBC n’est pas facilement visible. Barre d’échelle, 5 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Optimisation de la congélationUne gamme de grilles avec différentes tailles de trous a été testée lors de l’optimisation des conditions de buvard pour les globules rouges infectés par P. falciparum, y compris 2/2, 3/3, 3,5/1 et 5/2 (carré) carbone troué sur des grilles à mailles 200 d’or et de cuivre. Des grilles de recherche en cuivre à 200 mailles avec un film de carbone de 2/4 de trou fournissent une couche de cellules suffisamment épaisse pour broyer de longues lamelles vitreuses. Les trous plus grands ou plus petits donnaient généralement des couches cellulaires trop minces ou trop épaisses, respectivement (figure 2A-C). Avec 2/4 de trou de carbone, les schizontes sont tirés à travers les trous de 2 μm en épongeant la grille par l’arrière (côté non carboné), ce qui entraîne des cellules sortant au-dessus et au-dessous du film de carbone. L’étendue de carbone de 4 μm entre les trous donne une bande de carbone traversant le milieu de la plupart des lamelles résultantes, ce qui ajoute de la résistance. Les grilles de recherche sont les plus appropriées à des fins corrélatives et de criblage44, mais il faut veiller à ce que les chiffres / lettres dans la conception du maillage ne soient pas trop grands car cela bloquerait les zones de fraisage. Le temps de buvard sur un piston manuel est d’environ 20 s, mais le moment exact où arrêter le buvard a été jugé à l’œil nu lorsque la gouttelette de liquide tirée de la grille a cessé de se répandre sur le papier filtre. Un bord déchiré a été nécessaire pour briser la tension superficielle de la goutte afin de démarrer le processus de buvardage. Un congélateur automatique n’a pas été utilisé dans cette étude, mais un point de départ raisonnable pour cet échantillon serait d’utiliser le même volume de cellules et le même type de grille que pour un piston manuel, en veillant à éponger les grilles par l’arrière dans des conditions d’humidité élevée (~70%) et de température ambiante (~25 °C). Les temps et les conditions de transfert devraient être optimisés pour le système automatisé utilisé. Des grilles de schizontes de P. falciparum congelées ont été criblées par un microscope optique équipé d’un cryo-étage plutôt que par TEM, car l’échantillon n’était pas transmissible aux électrons. Pour les échantillons plus minces, les grilles peuvent être criblées par TEM (atlas de grille entière à un grossissement de ~150x) avant le transfert de l’échantillon dans le cryoFIB-SEM, ce qui peut être une condition préalable à l’accès à une installation nationale. Une attention particulière doit être accordée au gradient d’épaisseur de la glace à travers la grille et également à l’intérieur des carrés individuels de la grille. Les bons carrés de grille doivent avoir une épaisseur de cellule ou frapper le film de carbone en leur centre (Figure 2C). Cela évite le broyage dans la glace plus épaisse contre les barres de grille autour du bord du carré de grille et garantira que le faisceau d’ions perce au-dessus et au-dessous de la couche cellulaire, produisant une lamelle libre plutôt qu’un coin. Une fois que les conditions de transfert reproductible et de congélation ont été optimisées, le criblage n’est généralement plus nécessaire avant le fraisage FIB. Graphique 2. Analyse de la distribution cellulaire sur des grilles de schizontes de P. falciparum congelés par cryo-microscopie. (A) Un exemple de glace trop épaisse à travers un carré de grille par microscopie cryo-légère, obscurcissant les cellules et le film de carbone. Barre d’échelle, 10 μm. (B) Un exemple de la taille du trou (grille de cuivre à 300 mailles avec un film de carbone troué carré de 5/2) trop grande pour les cellules, ce qui entraîne une très fine couche de matériel biologique entourée de régions vides sans glace. Des grilles comme celle-ci produisent des lamelles très courtes et instables. Barre d’échelle, 10 μm. (C) Un exemple de bonne distribution de cellules sur une grille de cuivre à 200 mailles avec un film de carbone à 2/4 de trou. Ces schizontes ont été traités avec un inhibiteur E64. Les grandes cellules (boîte rouge, ~5 μm de diamètre) avec une périphérie bien définie sont des globules rouges infectés qui ont encore une membrane vacuole intacte. Les amas de petites cellules (boîte bleue, ~1 μm) sont les mérozoïtes individuels contenus dans un globule rouge hôte partiellement effondré. Chaque schizonte a une tache noire en son centre, indiquant la position des cristaux d’hémozoïne (voir la figure 1 pour plus de détails). La différence de morphologie cellulaire n’est pas aussi facile à voir une fois à l’intérieur du cryoFIB-SEM; Par conséquent, le prédépistage par cryo-microscopie optique est bénéfique jusqu’à ce que les conditions de transfert reproductibles aient été atteintes. La couverture des cellules autour des bords du carré de la grille à côté des barres de grille (zones pointillées de blanc) est trop épaisse pour le fraisage. La région plus mince au centre du carré de grille (zone pointillée jaune) est un endroit idéal pour fraiser, prolongeant la lamelle dans la couche environnante de cellules. Barre d’échelle, 6 μm. (D) Image d’un bord de grille automatique spécifique à cryoFIB avec deux marques noires, l’une dans la section coupée (crochet noir) et l’autre en face, à 12 heures et 6 heures. La flèche noire représente le sens de fraisage. (E) Lorsque les grilles sont chargées dans la cassette du chargeur automatique, les marques doivent être équidistantes de chaque côté de la pince à épiler de chargement, de sorte que les lamelles se trouvent perpendiculairement à l’axe d’inclinaison de la scène. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Marquage des jantes d’auto-grille spécifiques à la cryoFIB pour la tomographieEn règle générale, les grilles sont clipsées dans les jantes de la grille automatique avant le fraisage afin de faciliter la manipulation et de fournir une rigidité, ce qui protège les lamelles contre les dommages lors des étapes de transfert suivantes. Les jantes autogrid spécifiques à CryoFIB ont été conçues avec une fonction de découpe pour aider à accéder à une plus grande partie de la face de la grille pendant le fraisage. Il est important d’orienter la direction de broyage perpendiculairement à l’axe d’inclinaison du TEM afin que l’acquisition en série d’inclinaison se fasse en faisant tourner la lamelle sur toute sa longueur. Cela garantit que les hauts murs de la tranchée entourant la lamelle ne masquent pas l’information biologique lorsque la grille est inclinée. En règle générale, le bord de la grille automatique est marqué pour faciliter l’alignement visuel dans la navette cryoFIB-SEM et plus tard lors du chargement du TEM. Pour ces échantillons, deux marques ont été apposées à 12 heures et à 6 heures avec un marqueur indélébile (voir le tableau des matériaux), l’une au centre de la section coupée de l’anneau de clip et l’autre directement en face (figure 2D). Lors du chargement dans le TEM (voir le tableau des matières), les deux marques doivent être visibles de part et d’autre de la pince à épiler et alignées à 90° par rapport au bord de la pince à épiler (figure 2E). Il convient de noter que le fabricant recommande d’aligner les grilles à l’aide des points gravés sur les jantes de la grille automatique, car certaines encres à proximité du faisceau d’ions peuvent interférer avec le fraisage. Les grilles écrêtées peuvent être criblées par microscopie optique avec une cassette modifiée pour une cryo-étape, ce qui peut être bénéfique pour vérifier que le processus d’écrêtage n’a pas détruit le film de carbone de la grille. Selon la cassette de l’échantillon, des grilles non clipsées peuvent également être fraisées, mais il faut prendre grand soin lors du transfert du cryoFIB-SEM au TEM pour limiter toute flexion de la grille car cela briserait les lamelles. Les grilles non clipsées peuvent être chargées dans le TEM par des porte-cryo à entrée latérale, mais il y a de fortes chances que les lamelles se cassent si l’écrêtage est effectué après le broyage. Revêtement organoplatineLe revêtement organoplatine est effectué sur une ou les deux grilles une fois qu’elles ont été chargées dans le cryoFIB-SEM. L’aiguille du système d’injection de gaz (SIG) est insérée dans la chambre au-dessus de l’échantillon pour diriger un flux de vapeur organoplatine à travers la surface de la grille à partir d’une source chauffée pendant un temps défini. La vapeur se condense sur les surfaces froides et forme une couche solide (~2 μm d’épaisseur). L’intégrité de ce manteau est essentielle pour permettre le broyage de lamelles uniformément minces. Les conditions optimales d’application de la couche organoplatine sont généralement prédéterminées par le fabricant de l’instrument, mais une certaine optimisation peut encore être nécessaire. La plupart des systèmes alignent l’aiguille SIG près de la direction de fraisage ou perpendiculairement à la direction de fraisage, en fonction de la géométrie des orifices sur la chambre et des limites de rotation de l’étage. Différents réglages peuvent être testés en recouvrant la grille, en fraisant une petite région, en inclinant la scène et en mesurant l’épaisseur de la couche par MEB. En plus de la configuration du cryoFIB-SEM lui-même, un certain nombre d’autres facteurs peuvent affecter l’application de la couche organoplatine, notamment 1) la topographie de l’échantillon, 2) la contamination de surface sur la grille et 3) la reproductibilité du flux de vapeur de l’aiguille SIG. Comme le flux SIG est directionnel, une topographie inégale peut faire en sorte que les régions à l’ombre des cellules ou la contamination de surface soient non revêtues ou aient une couche plus mince. Cela peut entraîner un affaissement de la couche organoplatine lors du polissage (Figure 3). Lors de la sélection d’une zone à usiner, il est nécessaire de tenir compte de la topographie environnante, par exemple, une grande contamination de surface, des amas de cellules ou du carbone brisé qui se projettent de la surface de la grille jusqu’à quelques carrés de grille, peuvent bloquer le flux de vapeur, créant une ombre d’organoplatine plus mince qui peut affaiblir une lamelle. De plus, les très petites particules de contamination de surface près du bord avant de la lamelle doivent également être évitées car elles peuvent se détacher pendant le broyage, laissant une tache affaiblie de glace nue qui peut entraîner la formation d’un trou dans la lamelle pendant le polissage. Enfin, si le broyage a commencé et que la couche organoplatine semble instable, enduisez à nouveau, plus longtemps, ou échangez-la sur une grille de secours. Figure 3 : Un revêtement organoplatine de bonne qualité est essentiel pour obtenir des lamelles minces et uniformément broyées. (A) Micrographie du bord antérieur d’une lamelle où le revêtement organoplatine (OP, jaune) a été appliqué trop finement, ce qui a entraîné un trou dans le bord antérieur de la lamelle qui s’est développé pendant le polissage (cercle vert) et un broyage inégal sur toute la largeur de la lamelle (stries). La surface organoplatine a été cisaillée par le faisceau d’ions, ce qui a entraîné une pulvérisation de matériau derrière le bord avant du revêtement (ligne pointillée jaune). (B) La couche organoplatine (OP) a été appliquée plus épaissement, ce qui a donné une lamelle plus uniformément amincie. L’intégrité du pelage est préservée sur toute la largeur de la lamelle et l’interface entre la couche organoplatine et la matière biologique vitrifiée est bien définie (ligne pointillée jaune). La couche de carbone peut être vue à travers l’arrière de la lamelle (orange). Barres d’échelle, 1 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Évaluation de la qualité de la grille dans le cryoFIB-SEM et le processus de broyageUne fois les grilles transférées dans le cryoFIB-SEM, l’intégrité du film de carbone et la distribution des cellules sur les grilles peuvent être criblées par MEB (Figure 4A-C). Les gradients de glace, la position des barres de grille et l’emplacement des numéros de grille sur les grilles de recherche peuvent être vérifiés par MEB à faible grossissement à 30 kV (figure 4B), mais la tension doit être ramenée à 5 kV tout en localisant les positions de fraisage à fort grossissement et en surveillant le processus de fraisage pour augmenter le contraste par rapport à la topographie de surface. Figure 4 : Évaluation de la qualité du réseau et localisation des zones à broyer dans le cryoFIB-SEM. (A) Vue d’ensemble à faible grossissement d’une grille à 5 kV via le SEM. La section en coupe du bord de la grille automatique est visible au bas de l’image. Barre d’échelle, 0,5 mm. (B) La même grille à 30 kV par MEB, montrant des zones de glace plus épaisse (carrés de grille plus foncés) et de glace plus mince (carrés de grille plus clairs). L’encart montre la région dans la boîte, avec des flèches indiquant la numérotation sur la grille du localisateur, qui est visible à 30 kV. Barre d’échelle, 0,5 mm. (C) Vue d’ensemble à grossissement moyen de deux carrés de grille évaluant la distribution des cellules sur le film de carbone et l’emplacement des barres de grille. Barre d’échelle, 50 μm. (D) La disposition des modèles de fraisage pour la première coupe à fort grossissement (vue du faisceau d’ions à 1,5 pA et 30 kV). La région rouge (3 μm d’épaisseur) est protégée, tandis que les régions jaunes seront ablées par le faisceau d’ions. La ligne pointillée blanche indique la position de la lamelle finale. Barre d’échelle, 10 μm. (E) Vue à fort grossissement à 3 kV via le MEB d’une lamelle polie de 200 nm d’épaisseur (10 μm de large x 15 μm de long). La perte de contraste au sein de la lamelle à 3 kV indique qu’une épaisseur appropriée a été atteinte. Le bord avant blanc vif est la couche organoplatine restante qui est appliquée à la grille via le SIG avant le fraisage. Barre d’échelle, 5 μm. (F) La même lamelle de (E) vue en utilisant le faisceau d’ions à 30 kV et 1,5 pA. La fine ligne blanche à travers le carré noir (flèche blanche) est le manteau organoplatine restant sur le bord antérieur de la lamelle. Barre d’échelle, 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Une région à fraiser est sélectionnée en disposant une paire de motifs rectangulaires de chaque côté d’une région protégée à fort grossissement (~7 000x pour les schizontes) dans la vue du faisceau d’ions (Figure 4D). Il est essentiel qu’aucune particule de contamination de surface ne soit fixée près de la zone de broyage, car elle peut avoir masqué l’application de la couche organoplatine protectrice. Il est également important que la topographie de la région soit adaptée pour supporter les côtés de la lamelle une fois son épaisseur finale atteinte. Pour les schizontes paludéens (taille des cellules: ~5 μm de diamètre x 2 μm d’épaisseur, forme de disque), des lamelles de 7 à 20 μm de large peuvent être broyées. Si la couche cellulaire est suffisamment épaisse, les lamelles finiront généralement par atteindre ~10-15 μm de longueur, capturant plusieurs cellules au-dessus et au-dessous de la couche de carbone (Figure 4E-F). On peut s’attendre à ce qu’il moule 5 à 10 lamelles en une séance de 8 heures (6 à 7 h de broyage et 1 à 2 h de polissage). Cela variera en fonction de l’épaisseur de l’échantillon et de la largeur des lamelles, les échantillons plus épais et les lamelles plus larges prenant plus de temps à moudre. Même les grilles endommagées peuvent être broyées car il suffit d’une poignée de bons carrés de grille pour générer un ensemble de lamelles (Figure 5A). De plus, si l’échantillon est plus mince que prévu, par exemple en raison d’un trop grand buvardage ou d’une variation de l’hématocrite de la culture, des lamelles plus courtes peuvent être broyées relativement rapidement; toutefois, leur longueur plus courte limitera la superficie disponible pour la collecte de données dans le TEM (figure 5B). Figure 5 : Détermination du moment où l’épaisseur finale des lamelles a été atteinte pendant le broyage. (A) Vue d’ensemble à faible grossissement d’une grille par MEB à 5 kV montrant les dommages causés par le carbone lors de l’écrêtage. Les zones intactes contenaient un échantillon très mince en raison d’un trop grand buvardage; cependant, il était encore possible de broyer six lamelles sur cette grille (la région à l’intérieur du contour en pointillés blancs) lors d’une session d’une journée complète sur le cryoFIBSEM. Barre d’échelle, 0,5 mm. (B) Lamelle courte (~10 μm de large x 3 μm de long, sans compter la couche organoplatine) produite à partir de cette grille (MEB à 3 kV), qui fournissait encore deux régions à partir desquelles recueillir des séries d’inclinaison. Barre d’échelle, 25 μm. (C) Une série d’images MEB (3 kV) d’une lamelle pendant la dernière étape de polissage montrant comment le contraste est perdu dans la lamelle lorsqu’elle est amincie (déplacement de gauche à droite). La ligne noire foncée au milieu de la lamelle dans toutes les images est une bande de film de carbone de la grille. Les cellules devant cette région ont été vitrifiées au-dessus du film de carbone et les cellules derrière cette région ont été vitrifiées sous le film de carbone. Le broyage a été arrêté lorsque la couche organoplatine du côté gauche du bord avant de la lamelle était sur le point de perdre son intégrité structurelle. Ce point d’arrêt était avant que la lamelle entière ne soit amenée à une épaisseur uniforme, c’est pourquoi il y a encore un matériau plus contrasté à l’arrière de la lamelle. (D) Un exemple de voie de polissage basée sur les lamelles broyées sur la grille représentée en (A). Une voie de polissage devrait commencer aux lamelles plus proches de la source FIB, en s’éloignant de la source FIB pour limiter le redépôt de matériau broyé sur la surface des lamelles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Pendant le polissage, l’épaisseur finale d’une lamelle dépendra de la structure de l’échantillon dans la région à fraiser, de l’intégrité de la couche organoplatine et du temps disponible. Idéalement, l’échantillon devrait être aminci jusqu’à ce que le contraste soit perdu sur toute la surface de la lamelle par MEB à 3 kV, ce qui suggère qu’elle est uniformément transparente aux électrons et d’environ 150-200 nm d’épaisseur (Figure 5C). Cependant, il peut être nécessaire d’arrêter le broyage avant ce point si la couche organoplatine développe un trou ou si la lamelle commence à se plier. Dans ce cas, la lamelle peut encore être assez mince à l’avant et rester utile pour la tomographie. Inversement, il est possible d’amincir au-delà du stade de perte de contraste si la lamelle semble stable, ce qui la rend encore plus mince en rapprochant les motifs de fraisage (~100 nm ou moins). Cela dépendra de l’épaisseur requise pour le flux de travail en aval. Une image MEB à faible grossissement est nécessaire pour planifier un itinéraire de polissage, en commençant plus près de la source du faisceau d’ions et en travaillant loin (Figure 5D). La direction de la voie de polissage est importante pour empêcher la redéposition de matériaux enlevés sur des lamelles déjà terminées. Collecte et traitement des données de série d’inclinaisonUne fois chargé dans le TEM, un montage à grille complète à faible grossissement (~150x) identifiera les positions des lamelles, qui peuvent être corrélées à l’image SEM à faible grossissement prise à la fin du fraisage. Pour les schizontes congelés, la majeure partie de la grille n’est pas transparente aux électrons, de sorte que les positions des lamelles apparaissent sous forme d’encoches blanches sur un fond noir (Figure 6A). L’angle des lamelles par rapport à l’axe d’inclinaison du microscope doit être noté, car plus de ~10° de la perpendiculaire pourrait rendre difficile l’acquisition en série d’inclinaison. Un montage à grossissement moyen (~1 500x) à l’emplacement de chaque lamelle donnera un aperçu du contenu biologique et vérifiera les dommages de transfert, la glace cristalline ou la contamination excessive de la surface (Figure 6B-D). Cela doit également être vérifié à forte inclinaison pour s’assurer qu’aucune contamination de surface n’obscurcit l’acquisition ou la zone de concentration. Le choix d’une région d’acquisition dépendra non seulement des caractéristiques biologiques, mais aussi de l’intégrité structurelle de la glace dans la région environnante, par exemple, en évitant les fissures, car ces régions vont dériver, ou les zones avec un rideau excessif, où une lamelle aura une épaisseur variable. Avant d’acquérir une série d’inclinaison, une pré-inclinaison de ±10° est appliquée à la grille pour rendre le plan des lamelles (pas la grille) perpendiculaire à l’axe optique. La direction de la pré-inclinaison peut être déterminée par la position du bord avant des lamelles (à la recherche de la couche organoplatine restante) dans le montage à grossissement moyen. Pour le TEM utilisé ici (300 kV Titan Krios), si les bords avant des lamelles pointaient vers le haut sur la carte, cela nécessitait une pré-inclinaison de +10° et si elles pointaient vers le bas, cela nécessitait une pré-inclinaison de -10°. Chaque grille peut être différente en raison de l’orientation dans laquelle ils ont été ramassés dans les pincettes et insérés dans le chargeur automatique (section de coupe orientée vers la gauche ou la droite, produit une rotation de 180°). Une dernière considération est la taille des pixels. Régulièrement, les séries d’inclinaison sont collectées autour de 2,5-7 Å/pixel, en tenant compte de la taille de la caractéristique d’intérêt, de la résolution cible des données tomographiques résultantes et de la surface de la lamelle, ce qui peut limiter la taille de la zone d’acquisition. Il est possible d’utiliser une taille de pixel plus petite pour obtenir des informations haute résolution et la plus petite que nous avons utilisée avec succès sur ces échantillons est de 1,4 Å/pixel (données non présentées). La dérive sera plus apparente à une taille de pixel plus petite et ne convient vraiment qu’aux lamelles minces (<100 nm) où la maximisation de la résolution est importante dans l’étude. Figure 6 : Choix des régions d’intérêt accessibles à partir desquelles acquérir des séries d’inclinaison (A) Une section d’une carte TEM à faible grossissement montrant une région contenant des lamelles, apparaissant comme six encoches blanches sur fond noir (flèches rouges). Les carrés blancs sont un film de carbone brisé. (B) Une carte à grossissement moyen d’une lamelle endommagée et dévitrifiée. Sur le bord antérieur de la lamelle (FE), le pelage organoplatine s’est détaché (1). Il y a une tache claire de glace cristalline au centre de la lamelle (2). Le faisceau d’ions n’a pas réussi à percer au bord arrière de la lamelle (BE) parce que la glace est trop épaisse à côté des barres de la grille. Seule une petite partie de la lamelle est exempte de la glace environnante au niveau du BE (3), créant un coin. L’épaisseur a également entraîné la découpe d’étagères au-dessus de la lamelle (4), ce qui bloquera très probablement la vue des cellules à forte inclinaison dans le TEM. C) Montage à grossissement moyen d’une lamelle entière visualisée dans le TEM. Les problèmes typiques ou les régions à éviter lors de la collecte de séries inclinées de lamelles sont les zones: couvertes de contamination de surface (SC), recouvertes par la couche organoplatine (OP, jaune), près des fissures (CR et flèches noires), avec des rideaux dus aux changements de densité du matériel biologique (UC et région entre parenthèses bleues), et zones affaiblies par des cassures dans la couche organoplatine (cercle vert). Les seules régions accessibles pour l’acquisition en série inclinable sont les zones à l’intérieur des deux boîtes en pointillés noirs (étiquetées 1 et 2). La vue doit être vérifiée à forte inclinaison pour s’assurer que la contamination de surface n’obscurcit pas la région d’intérêt ou la zone de mise au point. (D) Un montage à grossissement moyen d’une lamelle beaucoup plus propre, mais qui présente encore des fissures (CR) causées par l’amincissement de la couche organoplatine (cercle vert) pendant le polissage. Ici, la région d’intérêt est mise en évidence par le type de cellule observé dans la lamelle, qui dans ce cas sont les mérozoïtes individuels, positionnés derrière la couche de carbone (orange) vers l’arrière de la lamelle (boîte pointillée de noir). Barres d’échelle, 3 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 7 : Acquisition de données cryo-ET à partir de lamelles broyées FIB. (A) Micrographie d’une région d’une lamelle contenant un globule rouge qui a récemment été envahi par un mérozoïte de P. falciparum. En (B), la même image est annotée pour montrer la limite du globule rouge (rouge), un certain nombre de vésicules intracellulaires à double paroi (violet et bleu pour les membranes interne et externe, respectivement) et le mérozoïte (vert) entourés d’une deuxième membrane dérivée de la cellule hôte (jaune). Une boîte noire indique la zone où une série d’inclinaison a été acquise. Barre d’échelle, 500 nm. (C) Une moyenne de 20 tranches centrales vues dans le plan XY à partir d’un tomogramme 8x (2,4 Å/pixel) acquis à l’extrémité apicale du mérozoïte et en (D) son annotation, montrant les deux membranes entourant la cellule (vert et jaune) et quatre membranes empilées dans le sommet du mérozoïte (bleu) qui sont associées à une caractéristique dense en électron en forme de champignon (violet). Une flèche rouge indique la jonction des empilements de membranes dans l’apex et la caractéristique en forme de champignon (également représentée dans la partie F, i). Une flèche noire indique un événement de fusion entre la membrane plasmique du mérozoïte et l’une des vésicules multicouches du parasite (également illustrée dans la partie F, ii). La membrane des globules rouges de l’hôte est représentée (rouge) et une ligne pointillée noire montre la position d’une coupe transversale vue dans le plan XZ, illustrée en (E). Les caractéristiques de la section transversale (E) sont colorées et étiquetées de la même manière que dans la partie (D), avec des flèches colorées pointant vers les membranes. Une flèche noire indique la position d’une couche de pulvérisation appliquée sur la lamelle après broyage et l’épaisseur de la lamelle est indiquée. Pour les pièces (C-E), barre d’échelle, 500 nm. (F) Une vue plus détaillée des caractéristiques indiquées par les pointes de flèches rouges et noires dans la partie (C), montrant la définition dans les bicouches lipidiques de l’empilement membranaire à l’apex du mérozoïte (i) et l’événement de fusion entre la vésicule multicouche et la membrane plasmique mérozoïte. Barre d’échelle, 75 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. L’objectif principal du travail est de disséquer la voie d’évacuation des mérozoïtes dans P. falciparum Mais étant donné que la population de cellules utilisées dans l’étude ne peut jamais être complètement homogène, souvent d’autres stades de développement cellulaire dans les lamelles ont été observés. L’exemple présenté ici (Graphique 7) contient un globule rouge qui a récemment été envahi par un P. falciparum parasite (mérozoïte). La lamelle utilisée avait une épaisseur de 240 nm et la grille avait été légèrement pulvérisée de platine dans une atmosphère d’argon avant d’être insérée dans le TEM, ce qui avait donné un contraste légèrement inférieur à ce à quoi on s’attendrait normalement. La membrane des globules rouges a pu être tracée dans son intégralité entourant la cellule. À l’intérieur du globule rouge se trouvaient trois structures enfermées liées à la membrane, deux vésicules, chacune entourée d’une double membrane et d’une caractéristique en forme d’ampoule (1,2 μm x 0,9 μm dans ses parties les plus larges), ce qui correspond au fait qu’il s’agit d’un mérozoïte (Graphique 7A-B). Le contenu des deux vésicules semblait être similaire à celui du contenu des globules rouges, ce qui suggère que ces vésicules peuvent contenir de l’hémoglobine. La présence de vésicules dans le globule rouge de l’hôte après l’invasion a été observée précédemment45. On pense qu’ils proviennent de la sécrétion de lipides et d’autres facteurs de virulence d’organites sécrétoires appelés rhoptries dans le mérozoïte, qui se déchargent dans les globules rouges de l’hôte lors de l’invasion. Le mérozoïte est entouré de deux membranes étroitement associées, dont la plus interne est probablement la membrane plasmique native du mérozoïte, sur laquelle il n’y a pas de couche superficielle visible, et la plus externe doit provenir de la membrane des globules rouges de l’hôte qui enveloppe le mérozoïte lorsqu’il envahit. Le cytoplasme du mérozoïte contient de nombreuses vésicules multicouches et une caractéristique dense en forme de champignon dense en électrons adjacente à un empilement de membranes à l’apex. Une série d’inclinaison acquise sur cette région (2,4 Å/pixel) montre qu’elle contient un empilement de quatre membranes, qui semblent être reliées à l’élément en forme de champignon (Graphique 7C-E). Il est frappant de constater que cette morphologie est très différente de la disposition normale des organites et des structures cellulaires à l’extrémité apicale d’un mérozoïte mature. Pour évaluer cela, une série d’inclinaison comparative (2,74 Å/pixel) sur l’extrémité apicale d’un mérozoïte mature a été obtenue à partir d’un schizona qui avait été traité avec E64 avant la congélation et le broyage (Graphique 8). Cela montre que l’extrémité apicale d’un mérozoïte contient deux organites sécrétoires proéminents en forme de massue appelés rhoptries nichés dans un ensemble de trois anneaux polaires à l’extrémité apicale de la cellule et entourés d’un certain nombre d’organites sécrétoires plus petits appelés micronèmes. L’anneau polaire le plus interne est attaché à une structure à double membrane qui sous-tend la membrane plasmique mérozoïte, appelée complexe de membrane interne, qui contient des protéines motrices qui entraînent l’invasion. Il a été démontré que pendant l’invasion, le contenu des organites sécrétoires est déchargé sur la surface du mérozoïte et dans le globule rouge hôte, facilitant la fixation des mérozoïtes aux globules rouges hôtes et initiant le complexe moteur qui entraîne l’invasion.45. Les données ici montrent qu’après l’invasion, le mérozoïte ne contient aucune structure observable qui ressemble à des rhoptries, des micronèmes ou des anneaux polaires, ce qui suggère que la morphologie de l’extrémité apicale du mérozoïte change radicalement. La fusion des rhoptries avant l’invasion a été démontrée précédemment par TEM de sections fixes à température ambiante46, ce qui est cohérent avec la production de la caractéristique en forme de champignon que nous observons dans notre mérozoïte d’état post-invasion. Les empilements de membranes connectés à cette caractéristique n’ont pas été observés auparavant et comme il n’y a aucune indication d’un IMC présent dans le mérozoïte nouvellement envahi, nous émettons l’hypothèse que les empilements de membranes peuvent être les restes de la machinerie IMC laissée après l’invasion, mais cela reste à confirmer. Figure 8 : L’extrémité apicale des mérozoïtes matures par cryo-ET d’une lamelle broyée FIB et TEM de sections plastiques. (A) Une moyenne de 20 tranches centrales d’un tomogramme 8x (2,74 Å/pixel) d’une lamelle de 230 nm d’épaisseur montrant la morphologie typique de l’extrémité apicale d’un mérozoïte mature. Les schizontes ont été traités avec E64 avant la congélation plongeante, ainsi la membrane PV s’est rompue et les mérozoïtes sont contenus dans le globule rouge hôte. (B) montre la même chose que dans (A), mais avec des annotations pour indiquer la membrane des globules rouges de l’hôte (RCM, rouge), la membrane plasmique mérozoïte (vert), le complexe de membrane interne (IMC, violet), les anneaux polaires (PR, noir), les micronèmes (M, jaune), les rhoptries (R, gris) et l’enveloppe nucléaire (NE, bleu). Un mérozoïte voisin, qui est hors plan dans cette région de tomogramme est indiqué par un triangle vert. Barre d’échelle, 200 nm. (C) Les caractéristiques cellulaires observées par cryoET sont compatibles avec celles de la TEM des schizontes conservés dans des coupes plastiques. Des caractéristiques cellulaires similaires sont indiquées dans un mérozoïte mature d’un schizona qui a été traité avec le composé 2, bloquant la sortie avant la rupture de la membrane PV. Barre d’échelle, 500 nm. (D) Schéma annoté d’un mérozoïte montrant les caractéristiques cellulaires en parties (A-C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Épaisseur de la région protégée entre les motifs de fraisage rectangulaires (μm) Courant nomique de faisceau d’ions (pA) à 30 kV 3 300 1.5 100 0.75 50 0.3 30 0,2 – 0,06 (polissage final) 30* Tableau 1 : Stratégie de broyage pour produire des lamelles minces. Le broyage par étapes est effectué en réduisant le courant du faisceau d’ions correspondant à l’épaisseur de la région protégée. Cela limite le chauffage des échantillons, empêchant la dévitrification. * Le polissage doit être effectué en parallèle pour appliquer uniformément de la chaleur sur les lamelles des deux côtés, réduisant ainsi le risque qu’elles se plient ou s’inclinent lorsqu’elles atteignent leur épaisseur finale. D’autres étapes peuvent être effectuées séquentiellement, en fraisant le motif au-dessus de la lamelle, puis au-dessous de la lamelle, avant de passer au courant de faisceau suivant. L’arpentage de la grille pour localiser les positions de fraisage doit être effectué à un courant de faisceau de 1,5 pA afin de minimiser l’échauffement de l’échantillon. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

Alors que le cryoFIB-broyage devient de plus en plus courant, la préparation d’échantillons optimaux pour le broyage ne l’a pas fait; par conséquent, la plupart des étapes critiques de ce protocole se produisent avant que l’échantillon n’atteigne le cryoFIB-SEM. L’optimisation de l’échantillon par plusieurs cycles de préparation cellulaire, la congélation et le criblage par microscopie optique et électronique sont nécessaires pour produire le meilleur échantillon possible avant de tenter le broyage. Avoir le meilleur échantillon possible augmente non seulement les chances de succès, mais optimise également l’utilisation de l’équipement. Pour cette raison, la plupart des installations nationales exigent la preuve qu’une optimisation suffisante a été effectuée avant d’accorder du temps sur leurs machines. Une fois à l’intérieur du cryoFIB-SEM, il est essentiel de maximiser l’efficacité de la couche organoplatine afin de produire des lamelles uniformément minces. Enfin, la patience et une bonne manipulation des échantillons sont des compétences préalables de l’utilisateur, qui devra rester assis pendant plusieurs jours pour produire puis transférer des grilles contenant des lamelles délicates. Cela pourrait changer avec l’introduction de stratégies de fraisage automatisées^47,48, mais jusqu’à présent^, l’ensemble du processus de fraisage est encore largement manuel dans la plupart des installations.

Bien que les travaux se soient concentrés uniquement sur les schizontes de P. falciparum , la méthode présentée ici pourrait être facilement modifiée pour optimiser la préparation et le broyage de la grille pour d’autres types de cellules. Les facteurs importants à considérer sont la densité des cellules appliquées à la grille, le type de grille (le cuivre est toxique pour certaines cellules), la taille et l’espacement des trous dans le film de carbone, le temps de buvard et la méthode de buvard (simple / double face, manuel ou automatisé). De plus, si les cellules sont cultivées sur les grilles (généralement des grilles d’or avec un film de carbone troué), la confluence peut être vérifiée par microscopie optique avant le buvard et la congélation. La stratégie de broyage dépend de la façon dont les cellules sont déposées sur la grille. Pour les globules rouges infectés par le paludisme, la grille est essentiellement recouverte d’une couche ininterrompue de cellules, plus épaisse dans certaines zones et plus mince dans d’autres. Le broyage est effectué en plusieurs points dans une région le long de ce gradient où l’épaisseur de la glace génère des lamelles de taille appropriée pour la tomographie. Cette approche fonctionne bien pour les cellules plus petites car vous pouvez produire des lamelles contenant une tranche à travers plusieurs cellules. Pour les cellules plus grandes ou les amas de cellules, il se peut qu’une cellule ou un amas cellulaire produise une lamelle.

La gestion de la grille et le transfert d’échantillons restent l’un des principaux défis de ce flux de travail. Les lamelles peuvent être perdues en raison de bris ou de fissures, d’artefacts de rideaux obscurcissant la biologie, d’une contamination excessive de la surface, ainsi que de problèmes d’orientation de la grille dans le TEM, nécessitant une étape de manipulation supplémentaire pour repositionner la grille. Le degré de pertes varie d’un jour à l’autre et d’un réseau à l’autre, mais il est amélioré par la pratique et l’expérience de manipulation au fil du temps. Dans cette étude, il a été constaté que les grilles peuvent être soigneusement réorientées dans le chargeur automatique plusieurs fois sans détruire les lamelles, ce qui a parfois l’avantage de laver la glace de surface. Une autre limitation majeure de ce flux de travail est le temps nécessaire pour produire des lamelles. Comme la production est lente, il est essentiel de disposer d’un échantillon correctement optimisé, ce qui rend le fraisage aussi efficace que possible.

Un certain nombre d’adaptations au broyage FIB d’échantillons biologiques vitreux ont récemment été introduites. La mise en œuvre d’outils de levage refroidis cryogéniquement dans la chambre cryoFIB-SEM qui permettent de fraiser de plus gros blocs de matériau à partir d’échantillons congelés à haute pression change la donne. Les blocs peuvent être attachés à une tige métallique ou ramassés dans une pince et déplacés vers une deuxième position d’échantillonnage, contenant une grille EM spécialement modifiée. Les blocs peuvent ensuite être recouverts d’organoplatine et broyés pour générer des lamelles. La capacité de broyer des lamelles à partir de matériaux congelés à haute pression signifie que des cellules et des tissus beaucoup plus grands peuvent être traités, ciblant spécifiquement des zones par microscopie à fluorescence corrélative¹². D’autres adaptations récentes de la méthode de fraisage FIB comprennent la réduction des artefacts de rideau par pré-broyage en coin de l’échantillon¹⁶, la cryofixation microfluidique⁴⁹ et la photo-microstructuration des grilles de microscopie électronique pour améliorer la distribution cellulaire⁵⁰. En outre, il a été démontré que le broyage des espaces de micro-expansion de chaque côté d’une lamelle peut atténuer la compression de l’échantillon environnant lorsqu’il atteint sa minceur finale⁵¹. Cela peut être particulièrement utile lors du broyage de couches cellulaires continues, comme l’échantillon de cette étude, où la flexion des lamelles est parfois observée lors de l’étape finale de polissage.

L’avenir de la microscopie électronique sera probablement la détermination des structures moléculaires in situ par moyenne sous-tomogramme et le broyage FIB est un outil important qui facilitera la production d’échantillons biologiques vitreux pour ces types de flux de travail. Alors que le broyage FIB en est encore à ses balbutiements pour les applications biologiques, le développement de méthodes se fait à un rythme rapide grâce au travail acharné des chercheurs, tant universitaires que nationaux, ainsi qu’à des investissements commerciaux dans le développement de la technologie cryoFIB-SEM pour soutenir la recherche.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette recherche a été financée en tout ou en partie par le Wellcome Trust (212916/Z/18/Z). Aux fins du libre accès, l’auteur a appliqué une licence de droit d’auteur public CC BY à toute version manuscrite acceptée par l’auteur découlant de cette soumission.

Ce projet pour lequel cette méthode a été développée a été financé par une subvention MR/P010288/1 du Conseil de recherches médicales accordée à Helen R. Saibil, Roland A. Fleck et Michael J. Blackman. Les cultures de P. falciparum ont été cultivées à l’Institut Francis Crick, avec le soutien des membres du groupe de Michael J. Blackman. Les auteurs aimeraient remercier le Dr Ser Ying (Michele) Tan d’avoir fourni les images des schizontes traités par composé 2 et E64 dans des frottis sanguins minces. La plupart des lamelles ont été produites avec le soutien du personnel d’eBIC et nous sommes reconnaissants d’avoir accès au cryoFIB-SEM à double faisceau Scios sur proposition de recherche NT21004. Les auteurs reconnaissent également le soutien du programme de bourses de l’industrie de la Royal Society (INF\R2\202061) dans la poursuite du développement de la technique de fraisage FIB au sein de la CUI. Les auteurs aimeraient également remercier Helen R. Saibil pour les discussions utiles concernant ce document sur les méthodes et la supervision du projet.

Materials

c-clips	Thermo Fisher Scientific	1036171
Clipping station	Thermo Fisher Scientific	n/a	Direct quote from Thermo
Clipping station	Sub-angstrom	CSA-01
Compound 2	n/a	n/a	Synthesised by Dr Simon A. Osborne, LifeArc
Cryo-FIB specific autogrid rims	Thermo Fisher Scientific	1205101
E64	Sigma	E3132
Emitech K100X glow discharge unit	Quorum	n/a
Gibco RPMI 1640 media	Thermo Fisher Scientific	12633012	Formulation used for culturing is custom made (REF 041-91762 A) and includes Albumax, glutamine, HEPES and hypoxanthine supplements
Giemsa Stain	VWR International	350864X
Glass slides	Thermo Fisher Scientific	11562203
Grid boxes	Sub-angstrom	PB	For clipped grids
Grid boxes	Thermo Fisher Scientific	n/a	For clipped grids – direct quote from Thermo Fisher Scientific
Grid boxes	Agar Scientific	AGG3727
Home-made manual plunge freezing rig	n/a	n/a	With an insulated ethane pot (high-density foam) and liquid nitrogen bath (polystyrene) on a bench top in a containment facility.
Human blood	n/a	n/a	UK National Blood and Transplant service
JEOL 4700F Z JSM with a Leica VCT500 stage cooling system	JEOL	n/a	FIB-SEM
Leica EM ACE600 with a VCT500 cryostage	Leica	n/a	sputter coater
Leica EM ACE900	Leica	n/a	e-beam rotary coater. In a humidity controlled room.
Linkam cryo-stage for light microscope	Linkam	Model No. CMS196	Cassettes for clipped and un-clipped grids. In a humidity controlled room.
Methanol	Sigma	179957
Nikon Eclipse E200 light microscope	Nikon	n/a	with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.
Percoll	VWR International	17-0891-01	Solution for percoll cushion is 35 ml 10x PBS, 150 ml RPMI 1640 media and 315 ml Percoll
Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM Finder grids	Quantifoil	N1-C17nCuH2-01	100 pack
Quantifoil copper 200 mesh 2/4 holey carbon EM grids	Quantifoil	N1-C17nCu20-01	100 pack
Quorum PP3010 prep-chamber	Quorum	n/a	sputter coater
Scios dual beam equipped with a Quorum PP3010 transfer stage.	FEI	n/a	FIB-SEM
Staedtler Lumocolor fine black permanent marker pen	Viking Direct	ND538522
TFS Titan Krios 300 kV TEM	Thermo Fisher Scientific	n/a	TEM equipped with a K2 or K3 camera.
Whatmann grade 1 filter paper	Sigma	WHA1001150
Zeiss Axio Scope A1 light microscope	Zeiss	n/a	with Linkam cryo-stage in a humidity controlled room.

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Bisson, C., Hecksel, C. W., Gilchrist, J. B., Carbajal, M. A., Fleck, R. A. Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography. J. Vis. Exp. (174), e62350, doi:10.3791/62350 (2021).

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Préparation de lamelles à partir d’échantillons biologiques vitreux à l’aide d’un microscope électronique à balayage à double faisceau pour la cryotomographie électronique

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