Lamellen bereiden van glasvochtbiologische monsters met behulp van een dual-beam scanning elektronenmicroscoop voor cryo-elektronentomografie

P . falciparum schizonts voorbereiden op het ondervriezenSamengestelde 2- en E64-remmers worden gebruikt om schizonts in verschillende stadia van uitgang te blokkeren, waardoor een verrijkte populatie van schizonts wordt gegenereerd voor vervolgonderzoek. Dit is belangrijk omdat zonder een complementaire correlatieve techniek het frezen van specifieke subcellulaire doelen of celtypen een uitdaging is, omdat het proces in wezen blind is. Verbinding 2 is een eiwitkinaseremmer die de uitgang blokkeert voorafgaand aan vacuoleruptuur. Schizonts kunnen gedurende 4 uur op verbinding 2 worden gesynchroniseerd en vervolgens worden gewassen met verbinding 2-vrije media om de remmer te verwijderen, waarna schizonten na ongeveer 30 minuten rijpen en uitstappen. Als alternatief kunnen verbinding 2 gesynchroniseerde schizonten worden gewassen in E64, een onomkeerbare breedspectrum cysteïneproteaseremmer, en gedurende ongeveer 1 uur worden geïncubeerd om de uitgang te vertragen na het punt van vacuoleruptuur, maar vóór het scheuren van de gastheercel. De morfologie en homogeniteit van behandelde schizonten moeten worden gecontroleerd met Giemsa-gekleurde bloeduitstrijkjes voordat ze worden ingevroren (figuur 1). Schizonts kunnen in elk van deze toestanden worden ondergevroren met behulp van de methode die in deze publicatie wordt beschreven. Figuur 1: De morfologie van verbinding 2 en E64-vastgelopen P. falciparum schizonts door Giemsa-gekleurde bloeduitstrijkjes. (A) In aanwezigheid van verbinding 2 is de parasitofore vacuole (PV) dicht opeengepakt met merozoïeten (paarse cirkels) met een enkele cluster van hemozoïnekristallen (donkerbruine cirkel). De grens tussen de PV en het omringende hemoglobine in de rode bloedcel (hRBC) (grijze band) van de gastheer is goed gedefinieerd, evenals het hRBC-membraan. (B) In aanwezigheid van E64 wordt het PV-membraan gescheurd en verspreiden de merozoïeten zich binnen de hRBC. Elke schizont bevat nog steeds een enkele cluster van hemozoïnekristallen. Het membraan van de gastheercel is lek en gedeeltelijk ingestort, daarom is er geen hemoglobine zichtbaar in de periferie van de cel en is de grens van het hRBC-membraan niet gemakkelijk zichtbaar. Schaalbalk, 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Optimalisatie van plunge freezingEen reeks roosters met verschillende gatgroottes werden getest tijdens de optimalisatie van de blottingcondities voor met P. falciparum geïnfecteerde rode bloedcellen, waaronder 2/2, 3/3, 3,5/1 en 5/2 (vierkante) gatkoolstof op gouden en koperen 200 mesh-roosters. 200 mesh koperen vindroosters met 2/4 gatachtige koolstoffilm zorgen voor een voldoende dikke laag cellen om lange glasvochtlamellen te frezen. Grotere of kleinere gaten resulteerden over het algemeen in te dunne of te dikke cellagen (figuur 2A-C). Met 2/4 gatkoolstof worden schizonten door de gaten van 2 μm getrokken door het rooster van de achterkant (niet-koolstofzijde) te vegen, wat resulteert in cellen die boven en onder de koolstoffilm uitsteken. De 4 μm strook koolstof tussen de gaten resulteert in een strook koolstof die door het midden van de meeste van de resulterende lamellen loopt, wat kracht toevoegt. Vinderroosters zijn het meest geschikt voor correlatie- en zeefdoeleinden44, maar er moet voor worden gezorgd dat de cijfers / letters in het gaasontwerp niet te groot zijn, omdat dit gebieden voor frezen blokkeert. De vlektijd op een handmatige zuiger is ongeveer 20 s, maar het exacte punt waarop moet worden gestopt met vlekken werd met het oog beoordeeld toen de druppel vloeistof die uit het rooster werd getrokken, stopte met zich uit te spreiden op het filterpapier. Een gescheurde rand was nodig om de oppervlaktespanning van de druppel te breken om het blottingproces te starten. Een geautomatiseerde duikvriezer werd niet gebruikt in deze studie, maar een redelijk uitgangspunt voor dit monster zou zijn om hetzelfde volume cellen en roostertype te gebruiken als gebruikt voor een handmatige zuiger, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de roosters van achteren worden afgeveegd in omstandigheden met een hoge luchtvochtigheid (~ 70%) en omgevingstemperatuur (~ 25 ° C). De blottingtijden en -omstandigheden zouden moeten worden geoptimaliseerd voor het specifieke geautomatiseerde systeem dat wordt gebruikt. Diepgevroren roosters van P. falciparum schizonts werden gescreend door een lichtmicroscoop uitgerust met een cryo-stadium in plaats van door TEM, omdat het monster niet overdraagbaar was op elektronen. Voor dunnere monsters kunnen rasters worden gescreend door TEM (hele rasteratlas bij ~ 150x vergroting) voorafgaand aan de overdracht van het monster naar de cryoFIB-SEM, wat een voorwaarde kan zijn voor toegang tot een nationale faciliteit. Speciale aandacht moet worden besteed aan de gradiënt van ijsdikte over het raster en ook binnen individuele rastervierkanten. Goede rastervierkanten moeten één cel dik zijn of de koolstoffilm in het midden raken (figuur 2C). Dit voorkomt frezen in het dikkere ijs tegen de roosterstaven rond de rand van het rastervierkant en zorgt ervoor dat de ionenbundel boven en onder de cellaag doorbreekt, waardoor een vrije lamellen ontstaan in plaats van een wig. Zodra reproduceerbare blotting- en dompelvriesomstandigheden zijn geoptimaliseerd, is zeven meestal niet langer nodig voorafgaand aan FIB-frezen. Figuur 2. Analyse van de celverdeling op roosters van bevroren P. falciparum schizonts door cryo-lichtmicroscopie. (A) Een voorbeeld van ijs dat te dik is over een rastervierkant door cryo-lichtmicroscopie, waardoor de cellen en de koolstoffilm worden verduisterd. Schaalbalk, 10 μm. (B) Een voorbeeld van de gatgrootte (300 mazen koperen rooster met 5/2 vierkante gatkoolstoffilm) die te groot is voor de cellen, wat resulteert in een zeer dunne laag biologisch materiaal omgeven door lege gebieden zonder ijs. Roosters zoals deze produceren zeer korte, onstabiele lamellen. Schaalbalk, 10 μm. (C) Een voorbeeld van een goede celverdeling op een koperen rooster met 200 mazen met 2/4 gatkoolstoffilm. Deze schizonten werden behandeld met E64-remmer. De grote cellen (rode doos, ~5 μm diameter) met een goed gedefinieerde periferie zijn geïnfecteerde rode bloedcellen die nog steeds een intact vacuole membraan hebben. De clusters van kleine cellen (blauwe doos, ~ 1 μm) zijn de individuele merozoites in een gedeeltelijk ingeklapte rode bloedcel van de gastheer. Elke schizont heeft een zwarte vlek in het midden, wat de positie van de hemozoïnekristallen aangeeft (zie figuur 1 voor aanvullende details). Het verschil in celmorfologie is niet zo gemakkelijk te zien als het eenmaal in de cryoFIB-SEM zit; Daarom is pre-screening door cryo-lichtmicroscopie gunstig totdat reproduceerbare blottingcondities zijn bereikt. De celbedekking rond de randen van het rastervierkant naast de rasterbalken (wit-gestreepte gebieden) is te dik om te frezen. Het dunnere gebied in het midden van het rastervierkant (geel onderbroken gebied) is een ideale plek om van te frezen, waardoor de lamellen worden uitgebreid naar de omliggende laag cellen. Schaalbalk, 6 μm. (D) Afbeelding van een cryoFIB-specifieke autogrid-velg met twee zwarte vlekken, één binnen het weggesneden gedeelte (zwarte beugel) en de andere tegenover, om 12 uur en 6 uur. De zwarte pijl geeft de freesrichting aan. (E) Wanneer de roosters in de autoloadercassette worden geladen, moeten de markeringen aan weerszijden van het laadpincet op gelijke afstand staan, waardoor de lamellen loodrecht op de kantelas van het podium liggen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Markering van cryoFIB-specifieke autogrid-velgen voor tomografieMeestal worden roosters voorafgaand aan het frezen in autogrid-velgen geknipt om de hantering te vergemakkelijken en stijfheid te bieden, waardoor de lamellen worden beschermd tegen schade tijdens de volgende overdrachtsstappen. CryoFIB-specifieke autogrid-velgen zijn ontworpen met een cutaway-functie om toegang te krijgen tot meer van het rastervlak tijdens het frezen. Het is belangrijk om de freesrichting loodrecht op de kantelas van de TEM te oriënteren, zodat de verwerving van de kantelserie verloopt door de lamellen over de lengte te draaien. Dit zorgt ervoor dat de hoge wanden van de geul rond de lamellen de biologische informatie niet verdoezelen omdat het rooster wordt gekanteld. Meestal wordt de autogrid-velg gemarkeerd om te helpen bij de visuele uitlijning binnen de cryoFIB-SEM-shuttle en later bij het laden van de TEM. Voor deze monsters werden twee markeringen aangebracht op 12 uur en 6 uur met een onuitwisbare marker (zie materiaaltabel), één in het midden van het weggesneden gedeelte van de clipring en de tweede recht tegenover (figuur 2D). Bij het laden in de TEM (zie materiaaltabel) moeten beide markeringen zichtbaar zijn aan weerszijden van het laadpincet en 90° zijn uitgelijnd op de rand van het pincet (figuur 2E). Opgemerkt moet worden dat de fabrikant aanbeveelt om roosters uit te lijnen met behulp van de gegraveerde stippen op de autogrid-velgen, omdat bepaalde inkten in de buurt van de ionenbundel het frezen kunnen verstoren. Geknipte rasters kunnen worden gescreend door lichtmicroscopie met een aangepaste cassette voor een cryotrap, wat nuttig kan zijn om te controleren of het knipproces de koolstoffilm van het raster niet heeft vernietigd. Afhankelijk van de monstercassette kunnen ook niet-geclipte roosters worden gefreesd, maar tijdens de overdracht van de cryoFIB-SEM naar de TEM moet grote zorg worden besteed aan het beperken van het buigen van het rooster, omdat dit de lamellen zal breken. Niet-geclipte roosters kunnen in de TEM worden geladen door cryohouders aan de zijkant, maar de kans is groot dat de lamellen breken als het knippen na het frezen wordt uitgevoerd. Organoplatinum coatingOrganoplatinum coating wordt uitgevoerd op een of beide roosters zodra ze in de cryoFIB-SEM zijn geladen. De naald van het gasinjectiesysteem (GIS) wordt in de kamer boven het monster gestoken om gedurende een bepaalde tijd een stroom organoplatinumdamp over het oppervlak van het rooster van een verwarmde bron te leiden. De damp condenseert op koude oppervlakken en vormt een vaste laag (~2 μm dik). De integriteit van deze laag is van cruciaal belang om gelijkmatig dunne lamellen te kunnen frezen. De optimale toepassingsomstandigheden voor de organoplatinum-laag worden meestal vooraf bepaald door de fabrikant van het instrument, maar enige optimalisatie kan nog steeds nodig zijn. De meeste systemen richten de GIS-naald dicht bij de freesrichting of loodrecht op de freesrichting, afhankelijk van de geometrie van poorten op de kamer en de rotatiegrenzen van het podium. Verschillende instellingen kunnen worden getest door het rooster te coaten, een klein gebied te frezen, het podium te kantelen en de dikte van de laag door SEM te meten. Naast de opstelling van de cryoFIB-SEM zelf, kunnen een aantal andere factoren van invloed zijn op de toepassing van de organoplatinum-laag, waaronder 1) de topografie van het monster, 2) oppervlakteverontreiniging op het rooster en 3) de reproduceerbaarheid van de dampstroom uit de GIS-naald. Omdat de GIS-stroom directioneel is, kan ongelijke topografie ervoor zorgen dat gebieden in de schaduw van cellen of oppervlakteverontreiniging ongecoat zijn of een dunnere laag hebben. Dit kan leiden tot een instorting van de organoplatinumlaag tijdens het polijsten (figuur 3). Bij het selecteren van een gebied om te frezen, is het noodzakelijk om rekening te houden met de omringende topografie, bijvoorbeeld grote oppervlakteverontreiniging, klonten cellen of gebroken koolstof die uit het oppervlak van het raster steken tot een paar rastervierkanten verderop, kunnen de dampstroom blokkeren, waardoor een schaduw van dunner organoplatinum ontstaat die een lamellen kan verzwakken. Bovendien moeten zeer kleine deeltjes oppervlakteverontreiniging in de buurt van de voorrand van de lamellen ook worden vermeden, omdat ze tijdens het frezen kunnen losbarsten, waardoor een verzwakt stuk kaal ijs achterblijft dat kan resulteren in het ontwikkelen van een gat in de lamellen tijdens het polijsten. Ten slotte, als het frezen is begonnen en de organoplatinum-laag er onstabiel uitziet, coatt u opnieuw, langer of wisselt u op een back-uprooster. Figuur 3: Een organoplatinumcoating van goede kwaliteit is van cruciaal belang om dunne, gelijkmatig gefreesde lamellen te verkrijgen. (A) Een microfoto van de voorrand van een lamellen waarbij de organoplatinum-coating (OP, geel) te dun is aangebracht, wat leidt tot een gat in de voorrand van de lamellen dat zich ontwikkelde tijdens het polijsten (groene cirkel) en ongelijkmatig frezen over de gehele breedte van de lamellen (strepen). Het organoplatinum-oppervlak is afgeschoren door de ionenbundel, wat leidt tot een spray van materiaal achter de voorrand van de coating (geel-gestreepte lijn). (B) De organoplatinum coat (OP) is dikker aangebracht, wat resulteert in een gelijkmatiger verdunde lamellen. De integriteit van de vacht blijft over de gehele breedte van de lamellen behouden en het raakvlak tussen de organoplatinum vacht en het verglaasde biologische materiaal is goed gedefinieerd (geel-stippellijn). De koolstoflaag loopt door de achterkant van de lamellen (oranje). Schaalstaven, 1 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Beoordeling van de netkwaliteit in de cryoFIB-SEM en het freesprocesZodra roosters zijn overgebracht naar de cryoFIB-SEM, kan de integriteit van de koolstoffilm en de verdeling van de cellen op de roosters worden gescreend door SEM (figuur 4A-C). IJsgradiënten, de posities van rasterstaven en de locatie van rasternummers op zoekerroosters kunnen worden gecontroleerd door SEM met lage vergroting bij 30 kV (figuur 4B), maar de spanning moet worden teruggebracht tot 5 kV terwijl de freesposities bij hoge vergroting worden gelokaliseerd en het freesproces wordt bewaakt om het contrast met de oppervlaktetopografie te vergroten. Figuur 4: Beoordeling van de netkwaliteit en lokaliseren van te frezen gebieden in de cryoFIB-SEM . (A) Een overzicht van lage vergroting van een rooster bij 5 kV via de SEM. Het uitgesneden gedeelte van de autogrid-velg is zichtbaar aan de onderkant van de afbeelding. Schaalbalk, 0,5 mm. (B) Hetzelfde raster bij 30 kV door SEM, met gebieden van dikker ijs (donkerdere rastervierkanten) en dunner ijs (lichtere rastervierkanten). De inzet toont het gebied in het vak, met pijlen die de nummering op het zoekerraster aangeven, dat zichtbaar is bij 30 kV. Schaalbalk, 0,5 mm. (C) Een middelgroot vergrotingsoverzicht van twee rastervierkanten die de verdeling van de cellen op de koolstoffilm en de locatie van de rasterbalken beoordelen. Schaalbalk, 50 μm. (D) De opstelling van freespatronen voor de eerste snede bij hoge vergroting (ionenbundelweergave bij 1,5 pA en 30 kV). Het rode gebied (3 μm dik) wordt beschermd, terwijl de gele gebieden worden geblurd door de ionenbundel. De witgestreepte lijn geeft de positie van de laatste lamellen aan. Schaalbalk, 10 μm. (E) Een weergave met hoge vergroting bij 3 kV via de SEM van een gepolijste lamellen van 200 nm dik (10 μm breed x 15 μm lang). Het verlies van contrast binnen de lamellen bij 3 kV geeft aan dat een geschikte dikte is bereikt. De helderwitte voorrand is de resterende organoplatinumlaag die voorafgaand aan het frezen via het GIS op het rooster wordt aangebracht. Schaalbalk, 5 μm. (F) Dezelfde lamellen van (E) bekeken met behulp van de ionenbundel bij 30 kV en 1,5 pA. De dunne witte lijn over het zwarte vierkant (witte pijl) is de resterende organoplatinum vacht aan de voorrand van de lamellen. Schaalbalk, 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Een te frezen gebied wordt geselecteerd door een paar rechthoekige patronen aan weerszijden van een beschermd gebied met een hoge vergroting (~ 7.000x voor schizonts) in de ionenbundelweergave te leggen (figuur 4D). Het is van cruciaal belang dat er geen deeltjes van oppervlakteverontreiniging in de buurt van het maalgebied worden bevestigd, omdat deze de toepassing van de beschermende organoplatinumlaag kunnen hebben verduisterd. Het is ook belangrijk dat de topografie van het gebied geschikt is om de zijkanten van de lamellen te ondersteunen zodra de uiteindelijke dikte is bereikt. Voor malaria schizonts (celgrootte: ~5 μm diameter x 2 μm dik, schijfvorm) kunnen lamellen tussen 7-20 μm breed worden gefreesd. Als de cellaag voldoende dik is, zullen de lamellen meestal ~ 10-15 μm lang worden en meerdere cellen boven en onder de koolstoflaag vangen (figuur 4E-F). Er kan worden verwacht dat het 5-10 lamellen frezen in een sessie van 8 uur (6-7 uur frezen en 1-2 uur polijsten). Dit zal variëren afhankelijk van de dikte van het monster en de breedte van de lamellen, waarbij dikkere monsters en bredere lamellen er langer over doen om te frezen. Zelfs beschadigde roosters kunnen worden gefreesd omdat er slechts een handvol goede rastervierkanten nodig zijn om een set lamellen te genereren (figuur 5A). Bovendien, als het monster dunner is dan verwacht, bijvoorbeeld als gevolg van over-blotting of variatie in de hematocriet van de cultuur, kunnen kortere lamellen relatief snel worden gemalen; hun kortere lengte zal echter het gebied beperken dat beschikbaar is voor gegevensverzameling in de TEM (figuur 5B). Figuur 5: Bepalen wanneer de uiteindelijke lamellendikte is bereikt tijdens het frezen. (A) Overzicht van lage vergroting van een rooster door SEM bij 5 kV met koolstofschade tijdens het knippen. De onbeschadigde gebieden bevatten zeer dun monster als gevolg van over-blotting; het was echter nog steeds mogelijk om zes lamellen op dit rooster (het gebied binnen de witgestreepte omtrek) te frezen in een volledige dagsessie op de cryoFIBSEM. Schaalbalk, 0,5 mm. (B) Een korte lamellen (~10 μm breed x 3 μm lang, exclusief organoplatinumlaag) geproduceerd uit dit rooster (SEM bij 3 kV), dat nog steeds twee gebieden bood om tilt-series te verzamelen. Schaalbalk, 25 μm. (C) Een reeks SEM-beelden (3 kV) van een lamellen tijdens de laatste polijststap die laten zien hoe het contrast verloren gaat in de lamellen als deze wordt verdund (van links naar rechts bewegen). De donkere zwarte lijn over het midden van de lamellen in alle afbeeldingen is een strook koolstoffilm van het raster. Cellen voor dit gebied werden verglaasd boven de koolstoffilm en cellen achter dit gebied werden verglaasd onder de koolstoffilm. Het frezen werd gestopt toen de organoplatinumlaag aan de linkerkant van de voorrand van de lamellen bijna de structurele integriteit verloor. Dit stoppunt was voordat de hele lamellen op een gelijkmatige dikte werden gebracht, daarom zit er nog wat contrastrijker materiaal in de achterkant van de lamellen. D) Een voorbeeld van een polijstroute op basis van de lamellen die op het onder A) afgebeelde rooster zijn gefreesd. Een polijstroute moet beginnen bij lamellen dichter bij de FIB-bron, weg van de FIB-bron om herplaatsing van gefreesd materiaal op het oppervlak van de lamellen te beperken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Tijdens het polijsten hangt de uiteindelijke dikte van een lamellen af van de structuur van het monster in het gebied dat wordt gefreesd, de integriteit van de organoplatinum-laag en de beschikbare tijd. Idealiter moet het monster worden verdund totdat het contrast over het hele oppervlak van de lamellen verloren gaat door SEM bij 3 kV, wat suggereert dat het gelijkmatig elektronentransparant is en ongeveer 150-200 nm dik (figuur 5C). Het kan echter nodig zijn om vóór dit punt te stoppen met frezen als de organoplatinumlaag een gat ontwikkelt of de lamellen begint te buigen. In dit geval kunnen de lamellen aan de voorkant nog dun genoeg zijn en nuttig blijven voor tomografie. Omgekeerd is het mogelijk om voorbij het verlies van contrastfase te dunnen als de lamellen er stabiel uitzien, waardoor deze nog dunner wordt door de freespatronen dichter bij elkaar te plaatsen (~ 100 nm of minder). Dit is afhankelijk van de dikte indien nodig voor de downstream-workflow. Een SEM-beeld met lage vergroting is vereist om een polijstroute te plannen, dichter bij de ionenbundelbron te beginnen en weg te werken (figuur 5D). De richting van de polijstroute is belangrijk om te voorkomen dat het geableerde materiaal opnieuw wordt geplaatst op lamellen die al zijn afgewerkt. Verzamelen en verwerken van tilt-serie dataEenmaal geladen in de TEM, zal een volledige rastermontage met lage vergroting (~ 150x) de posities van de lamellen identificeren, die kunnen worden gecorreleerd aan de SEM-afbeelding met lage vergroting die aan het einde van het frezen is gemaakt. Voor diepgevroren schizonten is het grootste deel van het raster niet transparant voor elektronen, dus de lamellenposities verschijnen als witte inkepingen op een zwarte achtergrond (figuur 6A). De hoek van de lamellen ten opzichte van de kantelas van de microscoop moet worden opgemerkt, omdat meer dan ~ 10 ° verwijderd van de loodlijn de verwerving van kantelseries moeilijk zou kunnen maken. Een mediumvergrotingsmontage (~ 1.500x) ter plaatse van elke lamellen geeft een overzicht van de biologische inhoud en controleert op overdrachtsschade, kristallijn ijs of overmatige oppervlakteverontreiniging (figuur 6B-D). Dit moet ook worden gecontroleerd bij hoge kanteling om ervoor te zorgen dat geen oppervlakteverontreiniging het verwervings- of focusgebied verduistert. Het kiezen van een acquisitiegebied hangt niet alleen af van de biologische kenmerken, maar ook van de structurele integriteit van het ijs in de omliggende regio, bijvoorbeeld het vermijden van scheuren, omdat deze regio’s zullen afdrijven, of gebieden met overmatige gordijnvorming, waar een lamellen een variabele dikte zullen hebben. Voordat een tilt-serie wordt aangeschaft, wordt een ±10° pre-tilt op het rooster aangebracht om het vlak van de lamellen (niet het raster) loodrecht op de optische as te maken. De richting van de voorkanteling kan worden bepaald door de positie van de voorrand van de lamellen (op zoek naar de overgebleven organoplatinum-laag) in de mediumvergrotingsmontage. Voor de hier gebruikte TEM (300 kV Titan Krios), als de voorranden van de lamellen omhoog wezen in de kaart, vereiste dit een +10° pre-tilt en als ze naar beneden wezen, vereiste dit een -10° pre-tilt. Elk raster kan anders zijn vanwege de oriëntatie waarin ze in het pincet zijn opgepakt en in de autoloader zijn geplaatst (uitsparingsgedeelte naar links of rechts gericht, produceert een rotatie van 180 °). Een laatste overweging is de pixelgrootte. Routinematig worden tilt-series verzameld rond 2,5-7 Å / pixel, rekening houdend met de grootte van het interessekenmerk, de doelresolutie van de resulterende tomografische gegevens en het oppervlak van de lamellen, wat de grootte van het acquisitiegebied kan beperken. Het is mogelijk om een kleinere pixelgrootte te gebruiken om informatie met een hoge resolutie te verkrijgen en de kleinste die we met succes op deze voorbeelden hebben gebruikt, is 1,4 Å / pixel (gegevens worden niet weergegeven). Drift zal duidelijker zijn bij een kleinere pixelgrootte en is alleen echt geschikt voor dunne (<100 nm) lamellen waar het maximaliseren van de resolutie van belang is in het onderzoek. Figuur 6: Toegankelijke gebieden van belang kiezen waaruit de tilt-serie kan worden verkregen (A) Een gedeelte van een TEM-kaart met lage vergroting met een gebied dat lamellen bevat, weergegeven als zes witte inkepingen op een zwarte achtergrond (rode pijlen). De witte vierkanten zijn gebroken koolstoffilm. (B) Een middelgrote kaart van een beschadigde en afwijkende lamellen. Aan de voorrand van de lamellen (FE) is de organoplatinum vacht afgeknapt (1). Er is een duidelijk stukje kristallijn ijs in het midden van de lamellen (2). De ionenbundel is aan de achterrand van de lamellen (BE) niet doorgebroken omdat het ijs te dik is naast de roosterbalken. Slechts een klein deel van de lamellen is vrij van het omringende ijs bij de BE (3), waardoor een wig ontstaat. De dikte heeft er ook voor gezorgd dat planken boven de lamellen (4) zijn gesneden, wat hoogstwaarschijnlijk het zicht op de cellen bij hoge kanteling in de TEM zal blokkeren. (C) Mediumvergrotingsmontage van een hele lamellen bekeken in de TEM. Typische problemen of gebieden die moeten worden vermeden bij het verzamelen van kantelseries van lamellen zijn gebieden: bedekt met oppervlakteverontreiniging (SC), bedekt met de organoplatinumlaag (OP, geel), in de buurt van scheuren (CR en zwarte pijlen), met gordijnen als gevolg van dichtheidsveranderingen in biologisch materiaal (CU en gebied binnen blauwe haakjes), en gebieden verzwakt door breuken in de organoplatinumlaag (groene cirkel). De enige gebieden die toegankelijk zijn voor tilt-series acquisitie zijn de gebieden binnen de twee zwart-onderbroken dozen (gelabeld 1 en 2). Het zicht moet bij hoge kanteling worden gecontroleerd om ervoor te zorgen dat oppervlakteverontreiniging het interessegebied of het focusgebied niet verduistert. (D) Een mediumvergrotingsmontage van een veel schonere lamellen, maar die nog steeds scheuren (CR) vertoont die worden veroorzaakt door het dunner worden van de organoplatinumlaag (groene cirkel) tijdens het polijsten. Hier wordt het interessegebied gemarkeerd door het celtype dat in de lamellen wordt waargenomen, in dit geval de individuele merozoïeten, gepositioneerd achter de koolstoflaag (oranje) naar de achterkant van de lamellen (zwart gestreepte doos). Schaalbalken, 3 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 7: Verkrijgen van cryo-ET-gegevens van FIB-gefreesde lamellen. (A) Een microfoto van een gebied van een lamellen met een rode bloedcel die onlangs is binnengedrongen door een P. falciparum merozoiet. In (B) is dezelfde afbeelding geannoteerd om de grens van de rode bloedcel (rood), een aantal dubbelwandige intracellulaire blaasjes (paars en blauw voor respectievelijk de binnenste en buitenste membranen) en het merozoiet (groen) te tonen, omringd door een tweede membraan afgeleid van de gastheercel (geel). Een zwarte doos toont het gebied waar een tilt-serie is verkregen. Schaalbalk, 500 nm. (C) Gemiddeld 20 centrale plakjes bekeken in het XY-vlak van een 8x binned tomogram (2,4 Å/pixel) verkregen aan het apicale uiteinde van het merozoiet en in (D) de annotatie, met de twee membranen rond de cel (groen en geel) en vier membranen gestapeld in de top van het merozoiet (blauw) die geassocieerd zijn met een elektronendicht paddestoelvormig kenmerk (paars). Een rode pijl geeft de kruising aan van de membraanstapels in de apex en het paddestoelvormige kenmerk (ook weergegeven in deel F, i). Een zwarte pijl duidt op een fusiegebeurtenis tussen het merozoietplasmamembraan en een van de meerlagige blaasjes in de parasiet (ook weergegeven in deel F, ii). Het rode bloedcelmembraan van de gastheer wordt weergegeven (rood) en een zwart onderbroken lijn toont de positie van een doorsnede bekeken in het XZ-vlak, weergegeven in (E). De kenmerken in de doorsnede (E) zijn gekleurd en gelabeld als in deel (D), met gekleurde pijlen die naar de membranen wijzen. Een zwarte pijl geeft de positie aan van een sputterlaag die na het frezen op de lamellen is aangebracht en de dikte van de lamellen is aangegeven. Voor onderdelen (C-E), schaalbalk, 500 nm. (F) Een meer gedetailleerd overzicht van de kenmerken die worden aangegeven door de rode en zwarte pijlpunten in deel (C), met de definitie in de lipide bi-lagen van de membraanstapel in de top van het merozoiet (i) en de fusiegebeurtenis tussen het meerlagige blaasje met het merozoietplasmamembraan. Schaalbalk, 75 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. De primaire focus van het werk is om het pad van merozoietuitgang in P. falciparum Maar aangezien de populatie van cellen die in de studie worden gebruikt nooit volledig homogeen kan zijn, werden vaak andere stadia van celontwikkeling binnen de lamellen waargenomen. Het hier getoonde voorbeeld (Figuur 7) bevat een rode bloedcel die onlangs is binnengedrongen door een P. falciparum parasiet (merozoiet). De gebruikte lamellen waren 240 nm dik en het rooster was licht gesputterd met platina in een argonatmosfeer voordat het in de TEM werd ingebracht, wat resulteerde in iets minder contrast dan normaal zou worden verwacht. Het membraan van de rode bloedcellen kon in zijn geheel rond de cel worden getraceerd. In de rode bloedcel bevonden zich drie ingesloten membraangebonden structuren, twee blaasjes, elk omgeven door een dubbel membraan en een gloeilampvormig kenmerk (1,2 μm x 0,9 μm op de breedste delen), wat overeenkomt met het feit dat het een merozoiet is (Figuur 7A-B). De inhoud van de twee blaasjes leek vergelijkbaar te zijn in tegenstelling tot die van de inhoud van de rode bloedcel, wat suggereert dat deze blaasjes hemoglobine kunnen bevatten. De aanwezigheid van blaasjes in de rode bloedcel van de gastheer na invasie is eerder waargenomen45. Men denkt dat ze voortkomen uit de afscheiding van lipiden en andere virulentiefactoren van secretoire organellen genaamd rhoptries in de merozoiet, die tijdens de invasie in de rode cel van de gastheer ontladen. Het merozoiet is omgeven door twee nauw verwante membranen, waarvan de binnenste vermoedelijk het inheemse plasmamembraan van het merozoiet is, waarop zich geen zichtbare oppervlaktelaag bevindt, en de buitenste moet afkomstig zijn van het rode celmembraan van de gastheer dat het merozoiet omhult terwijl het binnendringt. Het cytoplasma van het merozoliet bevat veel meerlagige blaasjes en een elektronendicht paddestoelvormig kenmerk naast een stapel membranen aan de top. Een over dit gebied verkregen kantelreeks (2,4 Å/pixel) laat zien dat het een stapeling van vier membranen bevat, die verbonden lijken te zijn met het paddestoelvormige kenmerk (Figuur 7C-E). Opvallend is dat deze morfologie heel anders is dan de normale rangschikking van organellen en cellulaire structuren in het apicale uiteinde van een volwassen merozoiet. Om dit te beoordelen, werd een vergelijkende kantelreeks (2,74 Å/pixel) over het apicale uiteinde op een volwassen merozoiet verkregen uit een schizont die met E64 was behandeld voordat het werd ingevroren en gemalen (Figuur 8). Dit toont aan dat het apicale uiteinde van een merozoiet twee prominente knotsvormige secretoire organellen bevat, rhoptries genaamd, genesteld in een set van drie polaire ringen aan de apicale punt van de cel en omringd door een aantal kleinere secretoire organellen die micronemen worden genoemd. De binnenste polaire ring is bevestigd aan een dubbele membraanstructuur die ten grondslag ligt aan het merozoietplasmamembraan, het binnenmembraancomplex genoemd, dat motoreiwitten bevat die invasie aandrijven. Het is aangetoond dat tijdens invasie de inhoud van de secretoire organellen wordt geloosd op het merozoietoppervlak en in de rode bloedcel van de gastheer, waardoor de hechting van merozoites aan rode bloedcellen van de gastheer wordt vergemakkelijkt en het motorische complex wordt geïnitieerd dat de invasie aandrijft45. De gegevens hier tonen aan dat na invasie het merozoiet geen waarneembare structuren bevat die lijken op roptries, micronemen of polaire ringen, wat suggereert dat de morfologie van het apicale uiteinde van de merozoiet dramatisch verandert. Fusie van rhoptries voorafgaand aan invasie is eerder aangetoond door TEM van vaste secties op kamertemperatuur46, wat consistent is met de productie van het paddestoelvormige kenmerk dat we waarnemen in onze post-invasietoestand merozoiet. De stapels membranen die met deze functie zijn verbonden, zijn niet eerder waargenomen en aangezien er geen aanwijzingen zijn voor een IMC die aanwezig is in het nieuw binnengedrongen merozoiet, veronderstellen we dat de membraanstapels de overblijfselen kunnen zijn van de IMC-machinerie die overblijft nadat de invasie is voltooid, maar dit moet nog worden bevestigd. Figuur 8: Het apicale uiteinde van volwassen merozoites door cryo-ET van een FIB-gefreesde lamellen en TEM van kunststof secties. (A) Gemiddeld 20 centrale plakjes van een 8x binned tomogram (2,74 Å/pixel) van een 230 nm dikke lamellen die de typische morfologie van het apicale uiteinde van een volwassen merozoiet laten zien. De schizonten werden behandeld met E64 voordat ze werden ondergedompeld, dus het PV-membraan is gescheurd en de merozoïeten bevinden zich in de rode bloedcel van de gastheer. (B) toont hetzelfde als in (A), maar met annotaties om het rode bloedcelmembraan van de gastheer (RCM, rood), het membraan van merozietplasma (groen), het binnenmembraancomplex (IMC, paars), polaire ringen (PR, zwart), micronemen (M, geel), rhoptries (R, grijs) en de nucleaire envelop (NE, blauw) aan te geven. Een naburige merozoiet, die buiten het vlak is in dit gebied van tomogram, wordt aangegeven door een groene driehoek. Schaalbalk, 200 nm. (C) De cellulaire kenmerken waargenomen door cryoET zijn consistent met die van TEM van schizonten bewaard in plastic secties. Vergelijkbare cellulaire kenmerken worden aangegeven in een volwassen merozoiet van een schizont dat is behandeld met verbinding 2, waarbij de uitgang vóór de PV-membraanbreuk vastloopt. Schaalbalk, 500 nm. (D) Een geannoteerd schema van een merozoiet met de cellulaire kenmerken in delen (A-C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Dikte van het beschermde gebied tussen de rechthoekige freespatronen (μm) Nominale ionenbundelstroom (pA) bij 30 kV 3 300 1.5 100 0.75 50 0.3 30 0,2 – 0,06 (laatste polijsten) 30* Tabel 1: Freesstrategie voor de productie van dunne lamellen. Stapsgewijs frezen wordt uitgevoerd door de ionenbundelstroom te verminderen die overeenkomt met de dikte van het beschermde gebied. Dit beperkt de verhitting van het monster, waardoor afwijkingen worden voorkomen. * Polijsten moet parallel worden uitgevoerd om de lamellen van beide kanten gelijkmatig te verwarmen, waardoor het risico dat ze buigen of buigen als ze hun uiteindelijke dikte bereiken, wordt verminderd. Andere stappen kunnen sequentieel worden uitgevoerd, waarbij het patroon boven de lamellen en vervolgens onder de lamellen wordt gefreesd, voordat u naar de volgende straalstroom gaat. Het meten van het rooster om freesposities te lokaliseren moet worden uitgevoerd met een straalstroom van 1,5 pA om de opwarming van het monster te minimaliseren. Klik hier om deze tabel te downloaden.