使用双光束扫描电子显微镜从玻璃体生物样品制备薄片进行冷冻电子断层扫描

恶性疟原虫裂松的制备方法，用于 深度冷冻化合物 2 和 E64 抑制剂用于阻滞处于出口不同阶段的裂殖子，从而产生丰富的裂殖子群体以供后续研究。这很重要，因为如果没有互补的相关技术，铣削特定的亚细胞靶标或细胞类型具有挑战性，因为该过程基本上是盲目的。化合物 2 是一种蛋白激酶抑制剂，可在液泡破裂之前阻止出口。裂殖子可以在化合物2上同步4小时，然后用不含化合物2的培养基洗涤以去除抑制剂，此时裂殖子将在大约30分钟后成熟并排出。或者，可以将化合物2同步裂殖子洗涤到E64（一种不可逆的广谱半胱氨酸蛋白酶抑制剂）中，并在液泡破裂点后但在宿主细胞破裂之前孵育约1小时以阻止出口。在冷冻之前，应通过Giemsa染色的血涂片检查治疗裂子的形态和均匀性（图1）。可以使用本出版物中描述的方法在这两种状态下冷冻精神分裂症。 图 1：通过 Giemsa 染色的血涂片对化合物 2 和 E64 停滞的 恶性疟原虫 裂松的形态。 （A）在化合物2存在下，寄生液泡（PV）密密麻麻地堆积着具有单簇血红素晶体（深棕色圆圈）的裂殖子（紫色圆圈）。PV与宿主红细胞（hRBC）（灰带）中周围血红蛋白以及hRBC膜之间的边界已明确。（B）在E64存在下，PV膜破裂，裂殖子在hRBC内扩散。每个裂殖子仍然含有一簇血红素晶体。宿主细胞膜渗漏并部分塌陷，因此，细胞外周内不可见血红蛋白，hRBC膜的边界不容易看到。比例尺，5 μm。 请点击此处查看此图的大图。 小型冷冻优化在优化恶性疟原虫感染红细胞的印迹条件期间，试验了一系列不同孔径的网格，包括金和铜 200 目网格上的 2/2、3/3、3.5/1 和 5/2（方形）孔状碳。带有 2/4 孔碳膜的 200 目铜取景器网格提供适当厚的细胞层来研磨长玻璃体薄片。更大或更小的孔通常分别导致细胞层太薄或太厚（图2A-C）。对于 2/4 孔碳，通过从背面（非碳侧）吸干网格将裂殖子拉过 2 μm 孔，导致细胞在碳膜上方和下方弹出。孔之间的4μm碳拉伸导致一条碳条穿过大部分产生的薄片的中间，增加了强度。查找网格最适合相关和筛选目的44，但必须注意确保网格设计中的数字/字母不会太大，因为这会阻塞需要铣削的区域。 手动柱塞上的印迹时间约为20秒，但是当从网格中抽出的液滴停止在滤纸上扩散时，通过肉眼判断停止印迹的确切点。需要撕裂的边缘来破坏液滴的表面张力以开始印迹过程。本研究未使用自动跳入式冷冻机，但该样品的合理起点是使用与手动柱塞相同的细胞体积和网格类型，确保在高湿度（~70%）和环境温度（~25°C）的条件下从背面吸干网格。印迹时间和条件需要针对所使用的特定自动化系统进行优化。 恶 性疟原虫 裂松的切入式冷冻网格由配备冷冻台的光学显微镜而不是TEM筛选，因为样品不能传递到电子。对于较薄的样品，在将样品转移到cryoFIB-SEM之前，可以通过TEM（全网格图谱，在~150倍放大倍率下）筛选网格，这可能是进入国家设施的先决条件。应特别注意整个网格以及单个网格正方形内的冰厚度梯度。好的网格正方形应该是一个单元格厚或撞击其中心的碳膜（图2C）。这样可以避免在较厚的冰中对网格正方形边缘周围的网格条进行铣削，并确保离子束突破细胞层的上方和下方，产生自由薄片而不是楔形。一旦优化了可重现的印迹和切入冷冻条件，通常不再需要在FIB铣削之前进行筛选。 图2.通过冷冻光学显微镜分析冷冻恶 性疟原虫 裂松网格上的细胞分布。 （A）通过冷冻光学显微镜，冰在网格正方形上太厚，遮挡细胞和碳膜的例子。比例尺，10 μm。 （B）孔尺寸（300目铜网格和5/2方形孔碳膜）对于细胞来说太大的一个例子，导致一层非常薄的生物材料被没有冰的空区域包围。像这样的网格会产生非常短、不稳定的薄片。比例尺，10 μm。 （C）具有2/4孔碳膜的200目铜网格上良好细胞分布的示例。这些裂殖子用E64抑制剂处理。具有明确外围的大细胞（红盒，~5μm直径）是感染的红细胞，其仍然具有完整的液泡膜。小细胞簇（蓝框，~1μm）是包含在部分塌陷的宿主红细胞内的单个裂殖子。每个裂殖子的中心都有一个黑点，指示血红素晶体的位置（有关更多详细信息，请参见 图1 ）。一旦进入冷冻FIB-SEM，细胞形态的差异就不那么容易看到;因此，在达到可重现的印迹条件之前，通过冷冻光学显微镜进行预筛选是有益的。网格条旁边的网格正方形边缘周围的单元格覆盖率（白色虚线区域）太厚，无法铣削。网格正方形中心的较薄区域（黄色虚线区域）是铣削的理想位置，将薄片延伸到周围的细胞层中。比例尺，6 μm。 （D） 冷冻FIB专用自动网格边缘的图像，带有两个黑色标记，一个在切割部分（黑色支架）内，另一个相对，位于12点钟和6点钟位置。黑色箭头表示铣削方向。（E）当网格加载到自动加载盒中时，标记需要与加载镊子的两侧等距，导致薄片垂直于载物台的倾斜轴。 请点击此处查看此图的大图。 标记用于断层扫描的 cryoFIB 专用自动网格轮辋通常，在铣削之前，网格被夹在自动网格轮辋中，以便于操作并提供刚性，从而保护薄片在随后的传输步骤中免受损坏。CryoFIB 专用自动网格轮辋经过精心设计，具有剖面功能，有助于在铣削过程中接触到更多的网格面。重要的是将铣削方向垂直于TEM的倾斜轴定向，以便通过沿其长度旋转薄片来进行倾斜串联采集。这确保了薄片周围沟槽的高壁不会在网格倾斜时遮挡生物信息。 通常，自动网格轮辋被标记以帮助在cryoFIB-SEM穿梭车内以及稍后装载TEM时进行视觉对齐。对于这些样品，在12点钟和6点钟位置用不可磨灭的标记施加了两个标记（见 材料表），一个在夹环切割部分的中心，另一个正对（图2D）。加载到TEM中时（参见 材料表），两个标记都应在加载镊子的两侧可见，并与镊子边缘成90°对齐（图2E）。应该注意的是，制造商建议使用自动网格边缘上的雕刻点对齐网格，因为靠近离子束的某些油墨会干扰铣削。 可以通过光学显微镜对剪裁的网格进行筛选，并带有改进的盒进行冷冻台，这对于检查剪切过程是否没有破坏网格的碳膜是有益的。根据样品盒的不同，也可以铣削未夹紧的网格，但在从cryoFIB-SEM转移到TEM的过程中必须格外小心，以限制网格的任何弯曲，因为这会破坏薄片。未夹紧的网格可以通过侧入式冷冻支架加载到TEM中，但如果在铣削后进行夹紧，薄片很有可能会破裂。 有机铂涂层有机铂涂层在加载到cryoFIB-SEM后，在一个或两个网格上进行。气体注入系统（GIS）的针头插入样品上方的腔室中，以引导有机铂蒸汽从加热源流过网格表面，持续设定的时间。蒸汽在冷表面上凝结并形成固体层（~2μm厚）。这种涂层的完整性对于能够均匀地研磨薄薄的薄片至关重要。有机铂涂层的最佳应用条件通常由仪器制造商预先确定，但仍可能需要进行一些优化。大多数系统要么将 GIS 指针靠近铣削方向对齐，要么垂直于铣削方向，具体取决于腔室上端口的几何形状和载物台的旋转极限。可以通过涂覆网格、铣削小区域、倾斜载物台以及通过 SEM 测量涂层厚度来试用不同的设置。 除了冷冻FIB-SEM本身的设置外，许多其他因素也会影响有机铂涂层的应用，包括1）样品的形貌，2）网格上的表面污染和3）来自GIS针的蒸汽流的可重复性。由于 GIS 流是定向的，因此不均匀的地形会导致像元阴影或表面污染的区域未涂覆或涂层较薄。这可能导致抛光过程中有机铂层塌陷（图3）。在选择要研磨的区域时，有必要注意周围的地形，例如，大的表面污染，细胞团块或破碎的碳从网格表面突出到几个网格正方形，可能会阻塞蒸汽流，产生更薄的有机铂的阴影，这可能会削弱薄片。此外，还应避免在薄片前缘附近出现非常小的表面污染颗粒，因为它们会在铣削过程中弹出，留下一块弱化的裸冰块，这可能导致在抛光过程中薄片上形成孔洞。最后，如果研磨已经开始并且有机铂涂层看起来不稳定，请再次涂层，更长时间，或交换到备用网格上。 图 3：优质的有机铂涂层对于获得薄而均匀研磨的薄片至关重要。 （A） 薄片前缘的显微照片，其中有机铂涂层（OP，黄色）涂得太薄，导致在抛光过程中在薄片前缘形成孔（绿色圆圈）和在薄片的整个宽度上不均匀地铣削（条纹）。有机铂表面已被离子束剪切掉，导致涂层前缘后面的材料喷洒（黄色虚线）。（B）有机铂涂层（OP）涂得更厚，导致薄片更均匀。涂层的完整性在薄片的整个宽度上得以保持，并且有机铂涂层与玻璃化生物材料之间的界面清晰（黄色虚线）。可以看到碳层穿过薄片（橙色）的后部。比例尺，1 μm。 请点击此处查看此图的大图。 评估冷冻FIB-SEM中的网格质量和铣削过程一旦网格被转移到cryoFIB-SEM，碳膜的完整性和网格上细胞的分布就可以通过SEM进行筛选（图4A-C）。冰梯度、网格条的位置和网格编号在取景器网格上的位置可以通过低放大倍率 SEM 在 30 kV 下检查（图 4B），但电压应降低到 5 kV，同时以高倍率定位铣削位置并监控铣削过程以增加与表面形貌的对比度。 图 4：评估网格质量并定位要在 cryoFIB-SEM 中铣削的区域 。 （A） 通过 SEM 对 5 kV 电网进行低放大倍率概览。自动网格边缘的剖面部分在图像底部可见。比例尺，0.5毫米。 （B） 通过 SEM 在 30 kV 下显示同一网格，显示较厚的冰（较深的网格方块）和较薄的冰（较浅的网格方块）的区域。插图显示了框中的区域，箭头指示查找器网格上的编号，在 30 kV 时可见。比例尺，0.5 mm。 （C） 两个网格正方形的中等放大率概述，评估碳膜上细胞的分布和网格条的位置。比例尺，50 μm。 （D） 在高放大倍率下进行第一次切割的铣削图案排列（1.5 pA 和 30 kV 下的离子束视图）。红色区域（3μm厚）受到保护，而黄色区域将被离子束烧蚀。白色虚线表示最终薄片的位置。比例尺，10 μm。 （E） 通过抛光的 200 nm 厚薄片（10 μm 宽 x 15 μm 长）的 SEM 在 3 kV 下获得高放大倍率视图。在3 kV时薄片内的对比度损失表明已达到合适的厚度。亮白色前边缘是剩余的有机铂层，在铣削之前通过GIS施加到网格上。比例尺，5 μm。 （F） 使用离子束在 30 kV 和 1.5 pA 下观察来自 （E） 的相同薄片。穿过黑色方块（白色箭头）的细白线是薄片前缘剩余的有机铂涂层。比例尺，10 μm。 请点击此处查看此图的大图。 通过在离子束视图中以高倍率（裂子~7,000倍）在受保护区域的两侧布置一对矩形图案来选择要铣削的区域（图4D）。至关重要的是，在研磨区域附近不要附着任何表面污染颗粒，因为这些颗粒可能会掩盖有机铂金保护涂层的应用。同样重要的是，一旦达到最终厚度，该地区的地形适合支撑薄片的侧面。 对于疟疾裂殖子（细胞大小：~5 μm 直径 x 2 μm 厚，圆盘形），可以铣削 7-20 μm 宽的薄片。如果细胞层厚度合适，薄片通常会达到~10-15μm的长度，捕获碳层上方和下方的多个细胞（图4E-F）。可以预期在8小时（6-7小时的研磨和1-2小时的抛光）中研磨5-10片。这将根据样品的厚度和薄片的宽度而变化，较厚的样品和较宽的薄片需要更长的时间来研磨。即使是损坏的网格也可以铣削，因为它只需要少数几个好的网格方块即可生成一组薄片（图 5A）。此外，如果样品比预期薄，例如，由于过度印迹或培养物血细胞比容的变化，则可以相对较快地研磨较短的薄片;然而，它们的较短长度将限制TEM中可用于数据收集的区域（图5B）。 图 5：确定在铣削过程中何时达到最终薄片厚度。 （A） SEM 在 5 kV 下对网格的低放大倍率概览，显示削波期间的碳损伤。由于过度印迹，未损坏的区域含有非常薄的样品;然而，仍然有可能在这个网格（白色虚线轮廓内的区域）上铣削六个薄片，在一整天的冷冻FIBSEM上。比例尺，0.5毫米。 （B）从该网格（3 kV时的SEM）产生的短薄片（~10μm宽x 3μm长，不包括有机铂层），它仍然提供了两个区域来收集倾斜系列。比例尺，25 μm。 （C） 在最后抛光步骤中薄片的一系列 SEM 图像 （3 kV），显示了薄片变薄（从左向右移动）时对比度如何丧失。在所有图像中，横跨薄片中间的深黑色线是网格中的碳膜条。该区域前面的细胞在碳膜上方玻璃化，该区域后面的细胞在碳膜下方玻璃化。当薄片前缘左侧的有机铂涂层接近失去结构完整性时，铣削停止。这个停止点是在整个薄片被均匀厚度之前，这就是为什么薄片后部仍然有一些对比度更高的材料。（D）基于在（A）所示网格上铣削的薄片的抛光路线示例。抛光路线应从靠近FIB源的薄片开始，远离FIB源，以限制铣削材料在薄片表面上的再沉积。请点击此处查看此图的大图。 在抛光过程中，薄片的最终厚度将取决于被研磨区域中样品的结构、有机铂涂层的完整性以及可用时间。理想情况下，应将样品变薄，直到在 3 kV 下通过 SEM 在整个薄片表面上失去对比度，这表明它是均匀的电子透明且厚度约为 150-200 nm（图 5C）。但是，如果有机铂层形成孔或薄片开始弯曲，则可能需要在此点之前停止铣削。在这种情况下，薄片在前面可能仍然足够薄，并且仍然可用于断层扫描。相反，如果薄片看起来稳定，则可以薄过对比度损失阶段，通过将铣削图案移近（~100 nm或更小），使其更薄。这将取决于下游工作流程所需的厚度。需要低放大倍率的SEM图像来规划抛光路线，从靠近离子束源开始并逐渐消失（图5D）。抛光路线的方向对于防止烧蚀材料重新沉积到已经完成的薄片上非常重要。 收集和处理倾斜系列数据一旦加载到TEM中，低放大倍率全网格蒙太奇（~150x）将识别薄片的位置，这可以与铣削结束时拍摄的低放大倍率SEM图像相关联。对于跳入冷冻裂子，大部分网格对电子不透明，因此薄片位置在黑色背景上显示为白色凹口（图6A）。应注意薄片相对于显微镜倾斜轴的角度，因为与垂直方向超过~10°会使倾斜系列采集变得困难。在每个薄片位置的中等放大蒙太奇（~1,500x）将概述生物含量，并检查转移损坏，结晶冰或过度的表面污染（图6B-D）。还应在高倾斜度下进行检查，以确保没有表面污染遮挡采集或聚焦区域。选择采集区域不仅取决于生物特征，还取决于周围区域冰的结构完整性，例如，避免裂缝，因为这些区域会漂移，或者过度遮挡的区域，其中薄片的厚度会有所不同。在获取倾斜系列之前，对网格施加±10°预倾斜，以使薄片（而不是网格）的平面垂直于光轴。预倾斜的方向可以通过中放大蒙太奇中薄片前缘的位置（寻找残留的有机铂涂层）来确定。对于这里使用的TEM（300 kV Titan Krios），如果薄片的前边缘在地图上指向上方，则需要+10°预倾斜，如果它们指向下方，则需要-10°预倾斜。每个网格可能由于它们在镊子中拾取并插入自动加载器的方向而不同（面向左侧或右侧的剖面部分产生 180° 旋转）。最后一个考虑因素是像素大小。通常，倾斜系列收集大约 2.5-7 Å/像素，同时考虑到感兴趣特征的大小、生成的断层扫描数据的目标分辨率和薄片的表面积，这可能会限制采集区域的大小。可以使用较小的像素尺寸来获得高分辨率信息，我们在这些样品上成功使用的最小像素尺寸为1.4 Å /像素（数据未显示）。漂移在较小的像素尺寸下会更明显，并且只真正适用于薄（<100 nm）薄片，其中最大化分辨率在研究中很重要。 图 6：选择要从中获取倾斜序列的可访问感兴趣区域 （A） 低放大倍率 TEM 图的一部分，显示包含薄片的区域，在黑色背景上显示为六个白色凹口（红色箭头）。白色方块是破碎的碳膜。（B） 受损和脱光薄片的中等放大倍率图。在薄片（FE）的前缘，有机铂涂层已折断（1）。薄片中心有一块清晰的结晶冰块（2）。离子束未能在薄片（BE）的后边缘突破，因为网格棒旁边的冰太厚。只有一小部分薄片不受BE（3）周围冰的影响，形成楔形。厚度还导致搁板在薄片上方被切割（4），这很可能会阻挡TEM中高倾斜细胞的视野。（C） 在TEM中查看的整个薄片的中放大蒙太奇。从薄片收集倾斜系列时要避免的典型问题或区域是：表面污染覆盖（SC），被有机铂涂层覆盖（OP，黄色），近裂缝（CR和黑色箭头），由于生物材料的密度变化而有帘子（CU和蓝色括号内的区域），以及因有机铂涂层断裂而减弱的区域（绿色圆圈）。唯一可用于倾斜系列采集的区域是两个黑色虚线框（标记为 1 和 2）内的区域。必须在高倾斜度下检查视图，以确保表面污染不会遮挡感兴趣区域或焦点区域。（D）更干净的薄片的中等放大蒙太奇，但在抛光过程中由于有机铂涂层变薄（绿色圆圈）仍然有裂缝（CR）。在这里，感兴趣的区域由薄片内观察到的细胞类型突出显示，在这种情况下，这些细胞类型是单个裂殖子，位于碳层（橙色）后面，朝向薄片（黑色虚线框）的后部。比例尺，3 μm。 请点击此处查看此图的大图。 图 7：从 FIB 铣削的薄片中获取冷冻电子断层扫描数据。 （A） 含有最近被恶性疟原虫裂殖子侵入的红细胞的薄片区域的显微照片。在（B）中，注释相同的图像以显示红细胞（红色），许多双壁细胞内囊泡（分别为内膜和外膜的紫色和蓝色）和被来自宿主细胞的第二层膜包围的裂殖子（绿色）的边界（黄色）。黑匣子显示获取倾斜系列的区域。比例尺，500 nm。（C） 在 XY 平面中从分离殖子顶端获取的 8 倍分档断层图（2.4 Å/像素）和 （D） 其注释中平均观察 20 个中心切片，显示围绕细胞的两层膜（绿色和黄色）和堆叠在裂殖子顶端的四层膜（蓝色）与电子致密蘑菇形特征（紫色）相关。红色箭头表示顶端膜堆和蘑菇形特征的连接处（也显示在F，i部分中）。 黑色箭头表示裂殖子质膜与寄生虫内多层囊泡之一之间的融合事件（也显示在F，ii部分中）。 显示宿主红细胞膜（红色），黑色虚线显示XZ平面中观察到的横截面的位置，如（E）所示。横截面（E）中的特征着色和标记与部分（D）相同，彩色箭头指向膜。黑色箭头表示铣削后涂在薄片上的溅射涂层的位置以及所示薄片的厚度。对于零件 （C-E），比例尺，500 nm。（F）部分（C）中红色和黑色箭头指示的特征的更详细视图，显示了裂殖子顶端膜堆脂质双层中的定义（i）以及多层囊泡与裂殖子质膜之间的融合事件。比例尺，75 nm。请点击此处查看此图的大图。 这项工作的主要重点是剖析裂殖子出口的途径 P. falciparum 但鉴于研究中使用的细胞群永远不可能完全同质，通常观察到薄片内细胞发育的其他阶段。此处显示的示例 （图7） 含有最近被 P. falciparum 寄生虫（裂殖子）。所使用的薄片厚度为240 nm，并且在插入TEM之前，网格在氩气气氛中轻轻溅射镀有铂，导致对比度略低于通常预期。红细胞膜可以在整个细胞周围追踪。红细胞内有三个封闭的膜结合结构，两个囊泡，每个囊泡被一个双层膜和一个灯泡形特征（最宽处为1.2μm x 0.9μm）包围，这与它是裂殖子（图7A-B).两个囊泡的内容物似乎与红细胞的内容物相似，这表明这些囊泡可能含有血红蛋白。先前已观察到入侵后宿主红细胞内存在囊泡45.它们被认为是由裂殖子中称为rhoptry的分泌细胞器分泌的脂质和其他毒力因子引起的，这些细胞器在入侵期间排放到宿主红细胞中。裂殖子被两个紧密相连的膜包围，其中最内层可能是裂殖子的天然质膜，其上没有可见的表面涂层，最外层必须来自宿主红细胞膜，该红细胞膜在入侵时包裹着裂殖子。裂殖子的细胞质包含许多多层囊泡和电子致密蘑菇形特征，与顶端的膜堆相邻。在该区域（2.4 Å/像素）上获得的倾斜系列表明它包含一堆四个膜，这些膜似乎与蘑菇形特征（图7C-E).引人注目的是，这种形态与成熟裂殖子顶端细胞器和细胞结构的正常排列完全不同。为了评估这一点，从在切入冷冻和研磨（图8).这表明裂殖子的顶端包含两个突出的棒状分泌细胞器，称为rhoptry，它们位于细胞顶端的一组三个极环内，并被许多称为微克星的较小分泌细胞器包围。最内侧的极环附着在裂殖子质膜下方的双膜结构上，称为内膜复合物，其中包含驱动入侵的运动蛋白。已经表明，在侵袭期间，分泌细胞器的内容物被排放到裂殖子表面并进入宿主红细胞，促进裂殖子附着到宿主红细胞并启动驱动侵袭的运动复合物45.这里的数据显示，在入侵后，裂殖子不包含类似于罗氏体、微缩子或极环的可观察到结构，这表明裂殖子顶端的形态发生了显着变化。先前已通过固定室温切片的TEM显示入侵前的Rhoptry融合46，这与我们在入侵后状态的裂殖子中观察到的蘑菇形特征的产生一致。以前没有观察到与该特征相连的膜堆，并且由于新入侵的裂殖子中不存在IMC的迹象，我们假设膜堆可能是入侵完成后残留的IMC机制的残余物，但这仍有待证实。 图 8：通过 FIB 铣削薄片的冷冻 ET 和塑料切片的 TEM 确定成熟裂殖子的顶端。 （A） 来自 230 nm 厚薄片的 8 倍分档断层扫描（2.74 Å/像素）的平均 20 个中心切片，显示了成熟裂殖子顶端的典型形态。裂殖子在低速冷冻前用E64处理，因此PV膜已经破裂，裂殖子包含在宿主红细胞内。（B）显示与（A）相同，但带有注释以指示宿主红细胞膜（RCM，红色），裂殖子质膜（绿色），内膜复合物（IMC，紫色），极环（PR，黑色），微粒（M，黄色），rhoptry（R，灰色）和核包膜（NE，蓝色）。在这个断层图区域中不在平面外的相邻裂殖子由绿色三角形表示。比例尺，200 nm。（C）冷冻电子断层扫描观察到的细胞特征与保存在塑料切片中的裂殖子的透射电镜特征一致。类似的细胞特征在经过化合物 2 处理的裂殖子的成熟裂殖子中也表现出来，在 PV 膜破裂之前阻止出口。比例尺，500 nm。（D）裂殖子的注释示意图，显示了部分（A-C）的细胞特征。请点击此处查看此图的大图。 矩形铣削图案之间的保护区域的厚度（μm） 30 kV 时的标称离子束电流 （pA） 3 300 1.5 100 0.75 50 0.3 30 0.2 – 0.06 （最终抛光） 30* 表 1：生产薄薄片的铣削策略。 通过减少与受保护区域厚度相对应的离子束电流来进行逐步铣削。这限制了样品加热，防止了失真。*抛光应平行进行，以从两侧均匀地将热量施加到薄片上，从而降低它们在达到最终厚度时弯曲或弯曲的风险。其他步骤可以按顺序完成，在移动到下一个光束电流之前，在薄片上方和薄片下方铣削图案。应在 1.5 pA 光束电流下测量网格以定位铣削位置，以尽量减少样品加热。 请按此下载此表格。