הריג טבעי (NK) ושיטת הרחבת תאי CAR-NK באמצעות קו תאי B מאוגד-IL-21-שונה

רקמות אנושיות ועבודה הקשורה לדם בפרוטוקול זה עוקבות אחר ההנחיות של מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת ראטגרס (IRB) 1. התפשטות תאי NK מרקמות הכבד (יום 0), כפי שניתן לראות באיור 1. הערה: מספר התא הראשוני והכדאיות נמצאים בקורלציה חזקה עם הזמן שחלף מאז הסרת האיברים ועם כמות דגימת הרקמה הראשונית. עם זאת, אם הרקמות ממוקמות ב-30 מ”ל של תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) ונשמרות על קרח או במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, עדיין ניתן להרחיב את תאי ה-NK בטוהר גבוה ובחיוניות גבוהה עד 24 שעות מאוחר יותר. זהה אזורי רקמה קיימא כדי להשיג לימפוציטים מרקמות ומקטעים באמצעות ציוד כירורגי סטרילי. יש להניח רקמות ב-30 מ”ל של HBSS (ללא סידן או מגנזיום) ולשמור על הקרח עד שיהיה מוכן להתכונן לבידוד. טחנו את הרקמה לקוביות של <0.5 ס"מ באמצעות סכיני גילוח סטריליים או מספריים ומלקחיים בתוך ארון בטיחות ביולוגית. הכינו תמיסת קולגן IV 1x (1 מ”ג/מ”ל) על ידי דילול מלאי של 10x ב-HBSS (10x Collagenase IV: 10 מ”ג/מ”ל או ~200 U/mL). מניחים את חתיכות הרקמה הטחונה בצינורות הדיסוציאציה של הרקמה. מלא את הצינורות עם לא יותר מ 4 גרם של רקמה לטבול את חתיכות הרקמה ~ 10 מ”ל של 1x collagenase IV.הערה: שימוש ב- DNase I אינו מומלץ מכיוון שהוא עשוי להפחית מעט את הכדאיות והתפוקה של NK. אנא עיין בטבלת החומרים עבור צינורות הדיסוציאציה הספציפיים לרקמות שבהן נעשה שימוש. הכניסו את צינורות הדיסוציאציה של הרקמה לתוך דיסוציאטור של רקמה וערבבו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לטחון את הרקמה ביסודיות.הערה: עבור רקמת כבד, פעולה זו עשויה להימשך יותר מ-30 דקות. עבור רקמות פריכות יותר, כ-15 דקות עשויות להספיק. אנא עיין בטבלת החומרים עבור צינורות דיסוציאציה ספציפיים לרקמות ודיסוציאטור הרקמות שבו נעשה שימוש. הסירו את צינורות הדיסוציאציה של הרקמה וטרטורט דרך מסננת תאי ניילון בקוטר 40 מיקרומטר באמצעות הקצה האחורי של מזרק 5 מ”ל. לאסוף את eluent ולהשליך את השברים הגדולים מעוכלים. סובבו את ה-eluent ב-400 x g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את הסופר-נטנט. החזירו את כדוריות התאים בסיליקה מצופה 30% פוליוויניל פירולידון (PVP) כדי להסיר תאי שומן שאחרת יזהמו את חלק הלימפוציטים הסופי.כדי להכין סיליקה אחת מצופה PVP, השתמש בדילול 9:1 של סיליקה מצופה PVP ב-10x PBS.הערה: עיין בטבלת החומרים עבור הסיליקה המצופה PVP הספציפית שבה נעשה שימוש. כדי להכין 30% סיליקה מצופה PVP, יש לדלל סיליקה אחת בציפוי PVP עם PBS/HBSS. סובבו את כדור התא ב-400 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את הסופר-נטנט. השהה את כדור התא ב 9 מ”ל של מדיה R-10.הערה: עיין בטבלת החומרים להרכבת מדיית R-10 שכבה בזהירות את תרחיף התאים מעל 4 מ”ל של פיקול או מדיה הפרדת לימפוציטים כדי להפריד לימפוציטים מתאי דם אדומים ותאים פולימורפונוקליאריים. הפרד את השכבות על ידי צנטריפוגה בגודל 400 x גרם למשך 23 דקות בטמפרטורת החדר כאשר התאוצה והבלמים כבויים או בהגדרה הנמוכה ביותר. בזהירות decant את השכבה העליונה-בינונית ולקצור את interphase המכיל לימפוציטים חודרים רקמות. שטפו את התאים ב-10 מ”ל של מדיה והמשיכו לספירת תאים, ציטומטריה זורמת, אליציטוט והקפאה של תאים, או פרוטוקול הרחבת NK ראשוני. 2. התפשטות ראשונית של תאי NK מ-PBMCs (או CB או רקמות איברים) (יום 0), כפי שמוצג באיור 2. הפשירו את ה-PBMC הקפוא ואת תאי ההזנה הקפואים המוקרנים באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. יש לשטוף את PBMC ו-100 תאים מוקרנים בגמא (Gy-מוקרן) 221-mIL-21 על-ידי צנטריפוגה ברזולוציה של 400 x g למשך 5 דקות עם 10 מ”ל של מדיית R-10 בנפרד. שמור 1 x 106 תאים של PBMC עבור ציטומטריה זרימה.הערה: טוהר תאי ה-NK הראשוני הוא גורם חשוב בחישוב קצב ההתרחבות של תאי NK. יש לתלות את התאים ב-1 מ”ל של מדיית R-10. ספרו את התאים באמצעות Trypan Blue. ערבבו 5x 106 תאים של PBMC עם 10 x 10 6 תאים של 100 תאים מוקרנים Gy 221-mIL-21 בלוח מיוחדשל 6 בארות (ראו טבלת חומרים). הוסף 30 מ”ל של מדיית R-10 בתוספת IL-2 אנושי (200 U/mL) ו- IL-15 אנושי (5 ננוגרם/מ”ל) (ראה טבלת חומרים). דגרו את צלחת 6 הבארות המיוחדת ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. החלף את המדיה במדיית R-10 בתוספת IL-2 אנושי (200 U/mL) ו- IL-15 אנושי (5 ננוגרם/מ”ל) כדי לשמור על תאי NK כל 3-4 ימים.הערה: שמור על פחות מ- 20 x 106 תאים לכל באר להרחבה נוספת בכל שינוי מדיה. לקבלת הכדאיות הטובה ביותר, ודא שמספר התא הכולל בכל באר אינו עולה על 100 x 106 תאים . תעד את מספר התא הכולל, את הכדאיות ובצע ציטומטריה של זרימה כל 3-4 ימים כדי לחשב את קצב ההתרחבות של תא NK. 3. חיבור של 293T תאים (יום 2), כפי שמוצג באיור 2. פיצול 1.8 x 106 תאי 293T ב-11 מ”ל של מדיית D-10 לכל צלחת 100 מ”מ מטופלת.הערה: עיין בטבלת החומרים להרכבת מדיית D-10 דגירה של 293T תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. 4. טרנספקציה רטרו-וירוס (יום 3) בצינור של 1.7 מ”ל, יש לערבב 470 μL של מדיית סרום מופחתת עם 30 μL של מגיב טרנספקציה.הערה: עיין בטבלת החומרים עבור המדיה המופחתת הספציפית של הסרום ומגיב הטרנספקציה שבהם נעשה שימוש. בצינור נפרד של 1.7 מ”ל, הוסף 2.5 מיקרוגרם של פלסמיד pRDF, 3.75 מיקרוגרם של פלסמיד Pegpam3, ו-2.5 מיקרוגרם של מבנה CAR בווקטור SFG לתוך מדיית הסרום המופחתת, כך שהנפח הסופי הוא 500 μL. ערבבו את הפתרונות בשלבים 4.1 ו-4.2. לדגור את הצינור בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. הוסיפו 1 מ”ל מהתערובת משלב 4.4 עד 293T צלחת תאים ביום הראשון בצורה טיפתית. דגרו את הצלחות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך 48-72 שעות. 5. ציפוי צלחת רטרונקטין (יום 3) דילול חלבון רטרונקטין עם פוספט תמיסת מלח (PBS) לריכוז סופי של 50-100 מיקרוגרם למ”ל. הוסף 500 μL של retronectin מדולל לתוך כל באר של צלחת 24 באר לא מטופלת (5 בארות לכל מבנה CAR). אוטמים את הצלחת באמצעות פרפילם ודוגרים את הצלחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. 6. התמרה (יום 4) צנטריפוגה צלחת retronectin ב 2103 x גרם במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופר-נטנט. חסום כל באר של צלחת 24 באר עם 1 מ”ל של R-10 בינוני. לדגור את הצלחת ב 37 °C עם 5% CO2 במשך 1 שעות. מחממים מראש את הצנטריפוגה ל-32 מעלות צלזיוס בזמן שצלחת הרטרונקטין נחסמת. אסוף את הרטרו-וירוס על-ידי סינון תאי 293T שעברו טרנספקציה באמצעות מסנן של 0.45 מיקרומטר. Aliquot 2 מ”ל של supernatant רטרווירוס מסונן לתוך כל באר. צנטריפוגה צלחת 24 באר ב 2103 x גרם במשך 2 שעות ב 32 מעלות צלזיוס. במהלך צנטריפוגה של צלחת, אספו את תאי ה-PBNK המורחבים מיום 0 וספרו את התאים באמצעות Trypan Blue.הערה: המשך להרחיב את תאי ה-PBNK על-ידי הוספת מדיית R-10 בתוספת IL-2 (200 U/mL) ו-IL-15 (5 ננוגרם/מ”ל). דלל את תאי ה-PBNK המורחבים עם מדיית R-10 בתוספת IL-2 (200 U/mL) ו-IL-15 (5 ng/mL) ל-2.5 x 10 5-5 x 10 5 תאים/מ”ל (0.5x 10 6-10 6 תאים לכל באר).הערה: רשום את מספר התא הכולל, את הכדאיות ושמור 5 x 10 5 תאי PBNKמורחבים עבור ציטומטריה של זרימה מכיוון שערכים אלה חשובים בקביעת קצב התפשטות תאי NK. לאחר צנטריפוגה, שאפו באופן חלקי את הרטרו-וירוס סופרנאטנט מכל באר.הערה: אל תשאף לחלוטין, כלומר, להשאיר כ 100 μL של supernatant retrovirus לכל באר, כמו זה יקטין את יעילות ההתמרת. Aliquot 2 מ”ל של תאי PBNK מורחבים מדוללים משלב 6.8 לכל באר. צנטריפוגה את הצלחת ב 600 x גרם במשך 10 דקות ב 32 מעלות צלזיוס. לדגום את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 במשך 48-72 שעות.הערה: אין להשתמש בצלחת. 7. איסוף תאי CAR-NK (יום 6 או 7), כפי שמוצג באיור 2. לאסוף בעדינות את התאים מצלחת 24 באר ולהעביר את התאים לצינור צנטריפוגה של 50 מ”להערה: נסה לא ליצור בועות, מכיוון שהדבר יביא לירידה בכדאיות התא. צנטריפוגה את הצינור ב 400 x גרם במשך 5 דקות. השהה את הכדור עם 1 מ”ל של מדיה R-10 וספור את התאים באמצעות Trypan Blue.הערה: שמור 5 x 105 תאים עבור ציטומטריה של זרימה כדי לקבוע את יעילות ההתמרות. העבירו את התאים שעברו החייאה לצלחת מיוחדת בעלת 6 בארות המכילה 30 מ”ל של מדיית R-10 בתוספת IL-2 (200 U/mL) ו-IL-15 (5 ננוגרם/מ”ל). דגרו את צלחת 6 הבארות המיוחדת ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. החלף את מדיית R-10 בתוספת IL-2 (200 U/mL) ו- IL-15 (5 ננוגרם/מ”ל) כדי לשמור על תאי NK כל 3-4 ימים.הערה: שמור על פחות מ- 20 x 106 תאים לכל באר להרחבה נוספת בכל שינוי. לקבלת הכדאיות הטובה ביותר, ודא שמספר התא הכולל בכל באר אינו עולה על 100 x 106 תאים . רשום את מספר התא הכולל, את הכדאיות ובצע ציטומטריה של זרימה כל 3-4 ימים כדי לחשב את קצב ההתרחבות של תא NK. השתמש בתאים למבחני in vitro או in vivo מתאימים.הערה: ה- ex vivo הרחיב את ה- PBNK, ותאי CAR-NK ניתנים לתרבית באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס במשך כ- 4 שבועות. בדוק את מספר תא ה-NK ואת טוהר היום 7, יום 11, יום 14, יום 18 ויום 21 על ידי ציטומטריה של זרימה.