腸オルガノイドモデルを用いたアプリカル特異的相互作用を研究する培養法

オルガノイドは、先に説明したプロトコルに 従って生検サンプルから生成され、腸管オルガノイド拡張培地用PIS( 材料表を参照) 図1Aは、左パネル、腸器官拡張培地を用いたドームで培養した腸器官の表現型を示す。これらの培養条件において、オルガノイドは、内腔を囲む薄い(10〜25 μm)上皮によって定義される嚢胞形態を示す(図1A、右パネル)。この段階では、腸上皮の有端側が内腔に面し、バソラテラル側が周囲の細胞外マトリックスに接触する。オルガノイドの大部分が所望の大きさに達すると、細胞外マトリックスを除去し、次いでオルガノイドを懸濁液で培養した。細胞外マトリックスへの細胞結合の喪失は、オルガノイドの反転プロセスを引き起こし、オルガノイド上皮の極性の逆転をもたらし、上皮の上端を成長培地に露出させ、バソラターレ側を内在化させる。 一部の培養では、懸濁物凝集およびヒューズ中のオルガノイドは、最初の3日間でより深い効果である(図1B、左パネル)。剪断技術の適用は、オルガノイドの剥離と最小限の再凝集で数日間の培養の継続を可能にする(図1B、右パネル)。 ECMドームで培養された腸管オルガノイドは拡大し続け(図1C、左パネル)、内腔を取り囲む上皮の側に、小さな納骨堂に似た二次出芽構造の自発的な形成を示す(図1C、右パネル)。同時に、細胞外マトリックスの存在しない場合に5日間維持されるオルガノイドは、懸濁液中で発症し続けている(図1D、左パネル)。極性の反転は、オルガノイドの核を取り囲む上皮の肥厚(30〜40μm)と様々な形態の出現によって特徴付けられる:伸びる(図1D、右パネル および 補助図1A)、嚢胞性(補足 図1B)、および不規則な(補足 図1C)。これは、オルガノイド内の発光空間の縮小と組み合わされることが多く、全体的な大きさに影響を与えます。 腸特異的極性マーカーの発現を解析することによって、効率的な反転を確認することもできる。アピカルアウト腸器官は、4′,6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)シグナルで示されるように、オルガノイドの内腔に向かって核の明確な局在を示す。この媒体に露出している上皮の外側で、VILLIN(図2A)やZO-1(図2B)などの有端マーカーの発現が検出される。この局在化は、ECMで培養された腸オルガノイドで観察されたものとは全く対照的である。細胞外マトリックス埋め込みオルガノイドは、核(DAPI)、VILLIN(図2C)、およびZO-1(図2D)に対して、アペカル側がオルガノイドの内腔に向いているアピコ基底極性を示す。 腸オルガノイドの有効な極性反転を得るためには、ECMの完全な除去が必要です。時折、ECM残基に囲まれた懸濁液培養物に見られるオルガノイドの一部は、上皮の極性反転の失敗を示唆する嚢胞形態を示す(補助図2A)。これらのオルガノイドに対して行われる免疫蛍光染色の解析は、上皮に沿った核のバソラショナル位置(DAPI)と、オルガノイドの内腔に面した頭先側のZO−1の発現の証拠を提供し、不完全なECMがECM埋め込み性の除去を引き起こすことを確認する。 腸単層培養の確立のためのプロトコルは、播種の7日以内にコンフルエント単層培養をもたらし、培養は、多くの場合、わずか2〜3日以内に合流に達する。成功の主要な決定要因の1つは、単層を播種するために使用される細胞の数と品質です。 図3A、左パネル は、6.5mm細胞培養膜挿入物中の約15万個の細胞の理想的な播種密度の例を示す。この数は固定されておらず、ドナーとソースオルガノイド培養の質に基づいて非常に可変することができます。したがって、セル番号は、これらの変数に基づいて最適化する必要があります。播種密度が低すぎる場合、または品質が悪い場合(図3A、右パネル)、コンフルエント単層培養を形成するのに十分なアタッチメントがない可能性があります。 単層が確立されると (図 3B)、細胞は緊密な接合を形成し、石畳の外観を作り出す(図3B、左パネル)。コンフルエント単層(図3B、右パネル)を形成できない場合、単層の外観は、良質の細胞の付着領域を持つ「パッチリ」であることが多く、これらの領域間のギャップが大きくなります。これらの培養物は、基底部と尖体の区画間に機能的な障壁を設けておらず、記載されたアッセイには適さない。コンフルエント単層は、そのビリン含有ブラシ境界を上皮の上端側に向け、その核を細胞のバソラテラの極に向けて配置する(図4B)。細胞間では、ZO-1を含むマルチタンパク質複合体からなる細胞間接合が形成される(図4B)。彼らの存在は、上皮文化のバリア機能を提供するための鍵です。 コンフルエント化すると、ALI文化への移行は、培養物のさらなる分化を誘発する(図3C)。小さな丸いゴブレット細胞が現れ、単層自体がより折り畳まれた外観を取ります。ゴブレット細胞は、水没培養の上皮内に存在するが(図4A)、それらはALI分化後に顕著である。上皮内に存在するゴブレット細胞は粘液を分泌し、上皮の上面にかすんだ外観を導く。このゴブレット細胞および分泌粘液は、分泌されたムチンタンパク質、MUC2(図4A、CおよびD)の染色により可視化され、かつ、ゴブレット細胞集団の増加はMUC2発現の増加によって測定することができる(補足図3A)。このゲル状粘液層を除去する必要はないし、上皮の表面に付着し、繰り返しの開く後も残る。除去が必要な場合は、10 mM N-アセチルシステインや50 μg/mL DTTなどの粘液分解化合物で培養液を洗浄すると、余分な粘液が除去されます。また、ゴブレット細胞集団の増加に加えて、ALIインターフェースは、腸内分泌細胞(CHGA発現で示される)(補足図3B)および成熟した腸球(KRT20発現で示される)の存在を増加させる(補足図3C)。 図1:アパイカルアウト腸器官の発生の段階(A) 4日目に所望の大きさのオルガノイドを持つドームの代表的な画像(左パネル、スケールバー= 500 μm)。オルガノイドは、開いた照明コンパートメント(右パネル、スケールバー= 100 μm)で、薄い壁です。(B)サスペンションで3日後に大規模な凝集を有するウェルの代表的な画像(左パネル、スケールバー=200μm)。せん断直後の塊片の画像(右パネル、スケールバー=200μm)。(C) 7日目のドームにおける腸内オルガノイドの代表的な画像。オルガノイドは、上皮のバソラテラル側に小さな芽の形成を伴う拡張された内腔を表示します(左20倍倍、マークされた領域の右100倍倍、スケールバー= 200μm)。(D) ECM除去後の腸内オルガノイドの代表的な画像を5日間の後の懸濁液培養。オルガノイドは肥厚した上皮を有する緻密な形態を得て、その上端を培地に露出させる。(左20倍倍、マークされた領域の右100倍の倍率、スケールバー=200μm)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図2:腸管オルガノイドにおける細胞極性マーカーの免疫蛍光染色アプリカルアウト(A,B)およびアピカルイン(C,D)指向腸オルガノイドは、座尖マーカーZO-1とVILLIN、および上皮マーカーE-CADHERIN(赤)で染色された。核を可視化するためにDAPI(青)を用いた。左パネルは25倍の倍率で撮影した画像を表示し、右パネルは63倍の倍率で異なるオルガノイドの画像を表示します(パネルCのみが同じオルガノイドの25倍と63倍の倍率を表示します)。(A)アペカルアウト腸器官は、VILLIN(緑色)およびE-CADHERIN(赤色)で染色され、その培地へのアペジカル側の暴露を示す。(B)ZO-1(緑色)とE-CADHERIN(赤)で染色されたアピカルアウト腸器官は、狭い接合部の存在とアピコ基底極性の復帰を示す。(C)マトリゲル埋め込み腸オルガノイドは、ビリン(緑色)とE-CADHERIN(赤)で染色され、アピカル側をオルガノイド内腔に向けて示す。(D)MAtrigel組み込み腸オルガノイドは、オルガノイドの内腔に向いている有端なタイトな接合部の存在を示すZO-1(緑色)およびE-CADHERIN(赤)で染色された。(スケールバー= 100 μm)。オルガノイドは免疫蛍光によって染色され、以前に公開されたプロトコル24,25を用いて画像化した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図3: 腸単層培養の確立( A) 0.05%トリプシン-EDTAによる治療後の3Dオルガノイドの代表的な画像オルガノイドは、単層培養物の播種に備えて単細胞または小さな細胞塊に解化される。左パネル:6.5mmの細胞培養膜挿入物に100μLあたり約150,000細胞、単層培養のための最適な播種密度の例。右パネル:6.5mm細胞培養膜挿入物で100μL当たり <50,000個の細胞で最適でない播種密度の例。(B) 水没した単層文化の代表的な明視野画像。左パネル:特徴的な石畳の外観を持つ100%コンフルエント層。右パネル:約50%コンフルエント単層。腸幹細胞の増殖が続いているため、単層(破線で示される)に見られる隙間は時間の経過とともに閉じます。(C) 7日で区別されたALI培養の代表的な明視野画像。(スケールバー= 200 μm)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図4:単層培養における分化細胞マーカーに対する免疫蛍光染色法(A)MUC2の水没単層培養の免疫蛍光染色のZスタック画像は、単層培養中のゴブレット細胞の存在を示す(緑色=MUC2、青=DAPI)。(B)水没単層の免疫蛍光染色のZスタック画像。上皮の尖端に沿ったシリン染色(緑色)は、ブラシ境界の存在を示し、ZO-1染色(赤)は細胞間の緊密な接合(青=DAPI)の存在を示す。(C)MUC2のMUC2に対するALI分化単層培養物の免疫蛍光染色のZスタック画像は、ALI単層培養中に有意に多くのゴブレット細胞が存在することを示す(緑色=MUC2、青色=DAPI)。(D)ALI分化単層培養のクライオセクションは、上皮中のゴブレット細胞の存在と単層培養のアプリカル側に沿った粘液の分泌を示すMUC2(緑色)およびE-CADHERIN(赤)の存在のために染色される。(スケールバー= 200 μm)。単層培養物は、免疫蛍光によって染色され、以前に公開されたプロトコル26,27を用いて画像化した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 補足図1:培養懸濁液中の有端外腸オルガノイドのフェノタイプのスペクトル (A,B,C)ECM除去後5日目に懸濁液中に維持された腸器官形態の追加の代表的な画像。オルガノイド極性が反転している。オルガノイドは肥厚した上皮でより密になり、オルガノイドの上端側は外側に向いている。オルガノイドは、様々な形態を示すことができます:細長い(A)、嚢胞(B)、および不規則な(C)。(スケールバー= 100 μm)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図2:腸管オルガノイドは、懸濁培養中の残基膜マトリックス培地の存在下で極性を反転することができない。 (A) 不完全なECM除去とオルガノイドの極性を反転させなかった場合の代表的な画像。マトリゲル残骸はオルガノイドの周りに存在し、上皮極性指向のアプリカルインを維持することに寄与する。オルガノイドは、内腔を取り囲む薄い上皮を有する嚢胞形態を示す(スケールバー=200μm)。(B)懸濁培養条件で見られる非反転オルガノイドの代表的な画像。核(青=DAPI)及びE-CADHERIN(赤色)はバソラテラ側に位置し、ZO−1(緑色)はオルガノイドの内腔に面した有端側に発現する。(スケールバー= 100 μm)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足図3:単層培養における分化細胞マーカーの遺伝子発現(A,B,C)qPCRを介して確立された腸オルガノイド拡張培地で成長した3Dオルガノイド培養物に対して、腸オルガノイド分化培地で生成される水没およびALI分化単層培養におけるMUC2、CHGA、およびKRT20の発現。 水没単層培養の確立は、各分化された細胞マーカーの発現を増加させます。ただし、ALI カルチャとしての分化は、各マーカーの発現を指数関数的に増加させます。エラーバー = +/- SEM.このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 単層文化製品 収穫する腸器官のウェルの数(50 μLドームから/播種する井戸あたり) 6.5 mm トランスウェル挿入 1 – 2ウェル 12 mm トランスウェル挿入 3 – 4ウェル 6ウェルプレート 6 – 8ウェル 24ウェルプレート 3 – 4ウェル 96ウェルプレート 1 – 2ウェル 表1:様々な培養物に収穫する腸オルガノイドの井戸の数