هنا نقدم اثنين من البروتوكولات التي تسمح النمذجة من التفاعلات المعوية apical محددة. تسهل الطبقات الأحادية المعوية المشتقة من الجهاز وثقافات واجهة الهواء السائل (ALI) توليد الظهارة المتباينة بشكل جيد والتي يمكن الوصول إليها من كلا الجانبين الإنارة والباسولاتيري ، في حين أن الأجهزة المعوية المقلوبة القطبية تعرض جانبها العضي وقابلة للمقاسات عالية الإنتاجية.
تتكون بطانة ظهارة الأمعاء من طبقة بسيطة من الخلايا الظهارية المتخصصة التي تعرض جانبها القرد للتشحيم وتستجيب للإشارات الخارجية. التحسين الأخير لظروف الثقافة في المختبر يسمح لإعادة إنشاء مكانة الخلايا الجذعية المعوية وتطوير النظم المتقدمة 3 الأبعاد (3D) الثقافة التي تلخص تكوين الخلية وتنظيم الظهارة. يمكن الحفاظ على الأجهزة العضوية المعوية المضمنة في مصفوفة خارج الخلية (ECM) على المدى الطويل والتنظيم الذاتي لتوليد ظهارة مستقطبة محددة جيدا تشمل تجويفا داخليا وجانبا بازليا خارجيا مكشوفا. هذه الطبيعة التقييدية للأجهزة المعوية تطرح تحديات في الوصول إلى السطح apical من الظهارة في المختبر ويحد من التحقيق في الآليات البيولوجية مثل امتصاص المغذيات والتفاعلات المضيفة الميكروبيوتا / المضيف الممرض. هنا، ونحن نصف طريقتين التي تسهل الوصول إلى الجانب apical من ظهارة organoid ودعم التفريق بين أنواع محددة من الخلايا المعوية. أولا، نظهر كيف أن إزالة ECM تحفز على عكس قطبية الخلايا الظهارية وتسمح بتوليد الأجهزة العضوية ثلاثية الأبعاد. ثانيا، نحن نصف كيفية توليد أحاديات ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) من تعليق الخلايا المفردة المشتقة من الأعضاء المعوية، والتي تتألف من أنواع خلايا ناضجة ومتمايزة. توفر هذه التقنيات أدوات جديدة لدراسة التفاعلات الخاصة بالظهارة مع الإشارات الخارجية في المختبر وتعزيز استخدام الأجهزة العضوية كمنصة لتسهيل الطب الدقيق.
الظهارة المعوية هي ثاني أكبر ظهارة في جسم الإنسان وتتكون من طبقة خلايا مستقطبة تسهل امتصاص المغذيات وتعمل كحاجز ضد الإهانات البيئية1. يسمح هذا التمييز بين الجانبين القاعدي والباسولاتيري لخلايا الظهارة بتنفيذ وظائفها المتنوعة. تتعرض المقصورة apical للتجويف وتتوسط التفاعلات الظهارية مع المحفزات البيئية والكائنات الحية الدقيقة ، مع تسهيل امتصاص العناصر الغذائية. سطح basolateral يضم تقاطعات بين الخلايا والالتصاقات مصفوفة الخلية، في حين أن التفاعل مع خلايا الجهاز المناعي والأنسجة الأخرى2. هذه التقاطعات توليد أحادية الطبقة منيعة تعلق على غشاء الطابق السفلي، الذي يعمل كحاجز ويسلم المواد الغذائية الممتصة إلى أنسجة الجسم المحيطة بها.
إنشاء نظم الثقافة التي هي قادرة على تلخيص هذه الوظائف المعوية في المختبر كان تحديا3. تستخدم النماذج التقليدية في المختبر خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم البشرية المتحولة ، مثل Caco-2 ، لتوليد ثقافات أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد. على الرغم من كونها قادرة على نمذجة وظائف متعددة من المقصورة absorptive، وهذه النماذج لا يمكن تلخيصها تماما تكوين ظهارة الأمعاء ووظيفة، والتي تحد من الخصائص الوظيفية الرئيسية والتطبيقات4،5.
ظهور organoids كنظام متقدم ثقافة 3D ولدت من الخلايا الجذعية التي يمكن تنظيم نفسها وتفرق لأنواع الخلايا الخاصة بالأعضاء، وكان اختراقا في الدراسة المختبرية للظهارة المعوية6. يتم تضمين الأجهزة العضوية المعوية في مصفوفة خارج الخلية (ECM) تشبه الصفيحة القاعدية وتشكل تقاطعات مصفوفة الخلية التي تسمح لهذه الثقافات بالاحتفاظ بالقطبية اللابيكوبازالية للظهارة. تظهر الأجهزة العضوية بنية مغلقة يتعرض فيها الجانب القردي للمقصورة الإنارة ، وبالتالي تحاكي بنية الأمعاء. على الرغم من أن هذه المنظمة المغلقة توفر الفرصة لدراسة وظائف محددة التوجيه، فإنه يحد من التحقيقات التي تتطلب الوصول إلى الجانب apical من الظهارة. وقد اتخذت نهج مختلفة للتغلب على هذه القيود في كل من 2D و 3D، بما في ذلك تجزئة organoid، microinjection organoid، وتوليد الثقافات أحادية الطبقة7. يسبب تجزئة الجهاز فقدان التنظيم الهيكلي وتدمير تقاطعات الخلايا ، مما يسمح بتعرض السطح الظهاري للظهارة إلى الوسط. هذه التقنية يستفيد من القدرة التجديدية للشظايا لإصلاح organoids عندما بذر في مصفوفة خارج الخلية، وقد استخدمت لنموذج الأمراض المعدية والتفاعلات المضيفةالممرضة 8،9. ومع ذلك، فإن الوصول المتزامن إلى كل من السطح القاعدي والبسالي قد يؤدي أيضا إلى استجابات غير محددة للعدوى.
ويمثل النهج البديل الذي يسمح بالوصول إلى السطح apical ويحافظ على كل من العمارة الهيكلية وتقاطعات الخلايا من خلال التنميق الدقيق للعوامل في تجويف organoids. وقد استخدمت هذه الطريقة على نطاق واسع لدراسة التفاعلات المضيفة الممرضة ونموذج آثار Cryptosporidium10، H. بيلوري11، و C. difficile12 على ظهارة الجهاز الهضمي في المختبر. باستخدام تقنيات مماثلة، تم تحديد إمكانات المطفرة من pks+ سلالة من القولونية E. على ظهارة الأمعاء13. على الرغم من فعالية، microinjection organoid مهمة شاقة وغير فعالة بالنظر إلى العدد الكبير من organoids التي يلزم حقنها للحصول على آثار قابلة للقياس، وبالتالي يحد من تطبيقه على المقايسات الإنتاجية العالية.
كما وفرت التطورات الأخيرة مع organoids المعوية أساليب لإنشاء 2D أحادي الطبقة الثقافات organoid، وبالتالي فضح سطحها apical14،15،16،17. هذه الطبقات الأحادية المشتقة من الجهازية تلخص المفتاح في خصائص الجسم الحي للظهارة المعوية. وهي تظهر تكوين خلايا ذات صلة من الناحية الفسيولوجية ، تحتوي على مجموعات الخلايا المتمايزة والخلايا الجذعية على حد سواء ونموذج التنوع عبر محور سرداب فيلوس. كما يتم الاحتفاظ القطبية apicobasal، خصائص أحادية الطبقة المتأصلة تسمح لسهولة الوصول إلى كل من الجانبين apical وbasolateral والتبادلات وسائل الإعلام يمكن أن تحاكي تدفق الأمعاء وإزالة النفايات مما يسمح للثقافة على المدى الطويل. هذه الميزات تجعل أحاديات أحادية مشتقة من الجهاز قابلة للدراسات التي تركز على التفاعلات الإنارة وتوفر نموذجا متفوقا لسلامة الحاجز الظهاري وال نفاذية18،19.
وقد أظهرت الدراسات أن القطبية الخلايا الظهارية وينظم بإحكام من قبل البروتينات ECM في كرويدات MDCK20،21 ومؤخرا في organoids الأمعاء البشرية22. إزالة مكونات ECM أو تثبيط مستقبلات integrin التي تتوسط تقاطعات مصفوفة الخلية يؤدي إلى انعكاس قطبية من الأجهزة المعوية والتعرض للجانب apical من الظهارة إلى المتوسط22. وقد اجتذب هذا النهج اهتمام الباحثين العاملين على الأمراض المعدية لأنه يسمح بسهولة الوصول إلى الجانب apical في 3D ويجعلها قابلة ل المقايسات الإنتاجية العالية. هنا، ونحن نصف بروتوكول تعديل استنادا إلى العمل الأخير من قبل مختبر أميفا22،الذي يسهل توليد الأجهزة المعوية 3D التي تكشف بسهولة جانبهم apical. كما نحدد البروتوكول الذي يمكن أن يولد بكفاءة واستنساخ أحاديات الأبعاد المعوية المشتقة من الأجهزة العضوية المعوية.
أصبحت نماذج الجهازية الظهارية منصات قوية التي يمكن استخدامها لنموذج تنظيم الأنسجة، وتطور المرض، وتحديد العلاجات23،28،29. وقد أضاف الميكرويات العضوية قيمة لقدرة الأجهزة العضوية على نمذجة الأمراض المعدية لأنها تسمح بالتفاعل الممرض مع الجانب apical من الظهارة المضيفة. وقد أدى التقدم الأخير في تقنيات الحقن الدقيق إلى تحسين سرعة الحقن في الأجهزة العضوية وحققت معدلا يصل إلى 90 عضوا عن طريق الحقن في الساعة. تم الحفاظ على وظيفة الحاجز في organoids حقنها ، وتركيز الأكسجين المنخفض داخل التجويف يسمح للبقاء على قيد الحياة من البكتيريا حقن إلزامية اللاهوائية30. ومع ذلك، فقد لاحظت الدراسات وجود التغايرية في السكان organoid داخل نفس البئر. وقد لوحظت هذه الاختلافات في حجم وشكل31، ومستويات التعبير عن الجينات الرئيسية32، فضلا عن معدلات الانتشار33. الاستجابات التفاضلية داخل نفس السكان organoid لمركبات مثل فورسكولين وPGE2، أو لسم الكوليرا، كما وصفت28،33. تسلط هذه النتائج الضوء على الحاجة إلى أعداد كبيرة من الأعضاء العضوية في الدراسات وتحد من استخدام الحقن الإنارة.
تقوم الثقافة العضوية التقليدية على تغليف وانتشار الأجهزة العضوية في الهيدروجيل. ومع ذلك، يمكن أن تشكل الهيدروجيلات قيودا على الانتشار وإدخال تدرجات التركيز، والتي يمكن أن تزيد من التغايرية34. وعلاوة على ذلك، تم توثيق تباين كبير، ليس فقط بين الثقافات والمانحين ولكن أيضا في إطار ظروف تجريبية فردية. مصدر المانحة، والخصائص الكيميائية الحيوية للهيدروجيل، والتغايرية الجوهرية للعضوية كنظام ثقافة هي عوامل هامة يمكن أن تزيد من التباين التجريبي وتحد من استنساخ النتائج التي تم الحصول عليها في تطبيقات المصب. توفر كلتا الطريقتين الموصوفتين هنا وسيلة بسيطة لكشف الجانب الظهاري ، مما يسمح بنمذجة المركبات ومسببات الأمراض ذات الاهتمام عن طريق إضافتها مباشرة إلى وسيط الثقافة. ويمكن أن يحد الانخفاض في استخدام الهيدروجيل من التباين التجريبي من المصادر التقنية للخطأ.
تحتفظ الأجهزة العضوية المعوية apical-out بالخصائص الرئيسية لنظام النموذج العضوي وقابليتها للتوسع تجعلها أكثر قابلية للمقاايسات عالية الإنتاجية ، مقارنة بالصفة الأحادية 2D. ومع ذلك ، حيث تحتفظ الأجهزة العضوية بهيكلها ثلاثي الأبعاد ، فإن إمكانية الوصول إلى الجانب القاعدي محدودة وقد تعيق الدراسات التي تتطلب الوصول إلى كلا الجانبين في وقت واحد.
لقد أثبتنا أن انعكاس القطبية من الأجهزة العضوية المعوية يعتمد على إزالة فعالة ومطلقة من ECM، مع الحفاظ أيضا على هيكل سليمة من organoids. ساهم كل من استخدام حل التفكك لإزالة ECM والحل المضاد للتمسك لمنع الأجهزة العضوية في الالتزام بالأدوات البلاستيكية في تحسين الكفاءة الإجمالية للبروتوكول الذي نشرته Co و J. Y.وزملاؤها 22، خاصة فيما يتعلق بعدد الأجهزة العضوية التي يتم إنتاجها لتطبيقات المصب.
وعلاوة على ذلك، لاحظنا أن بروتوكولنا يدعم عكس أكثر كفاءة من organoids أصغر من 250 ميكرومتر واستخدام الأجهزة العضوية أكبر قد يؤدي إلى انخفاض الناتج organoid، وذلك بسبب التجزئة الناجمة عن pipetting. نصائح واسعة تتحمل، مثل تلك المشار إليها في جدول المواد،قد تسمح باستخدام الأجهزة العضوية أكبر. ومع ذلك، نصائح واسعة تتحمل أقل فعالية في تفكك ECM بالمقارنة مع نصائح القياسية بسبب انخفاض القوة الميكانيكية المطبقة. لذلك، قد يلزم تكرار الخطوات 1.2.9-1.2.11 لتعطيل كاف وإزالة كاملة لجميع بقايا تخطيط القلب عند العمل مع الأجهزة العضوية الكبيرة.
يمكن Organoids في تعليق البقاء على قيد الحياة لمدة 2 أسابيع على الأقل. بعد هذه الفترة الزمنية، لاحظنا تغيرات مورفولوجيا وعدد متزايد من موت الخلايا. وجود الخلايا المنتشرة في organoids apical التدريجي22 يسمح لإعادة تأسيس الثقافات العضوية المعوية في apical. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق فصل الأجهزة العضوية apical التدريجي لخلايا واحدة وتضمينها في ECM مع الأمعاء Organoid توسيع المتوسطة.
وهناك قيود كثيرا ما تواجه في بروتوكولات تصف إنشاء الأجهزة المعوية في الثقافات تعليق هو توليد المجاميع الكبيرة. وهذا يؤثر على عدة متغيرات مثل الكفاءة، وإعادة إنتاج السمات المورفولوجية، وال نفاذية المركبات، وإشارات الباراكورين. على غرار البروتوكول الذي نشرته شركة، J. Y. وزملاؤه، وهنا نؤكد أن حصلت على انعكاس القطبية من ما لا يقل عن 97٪ من جميع organoids المعلقة دون القص بعد 3 أيام في التعليق. ومع ذلك ، على النقيض من المنشور ، قدمنا خطوة تفكك ميكانيكية من أجل تقليل تكوين المجاميع الكبيرة وزيادة الغلة. وبما أن هذا الإجراء قد يضر ظهارة organoids، ونحن تمديد فترة حضانة organoids لمدة 2 أيام إضافية للسماح الانتعاش ظهارة كاملة وضمان ثقافات ذات جودة عالية لتطبيقات المصب. إدخال التحريض المستمر مع استخدام شاكر حاضنة أو قارورة الدوار يمكن أن تقلل من أحداث الانصهار، والحد من التجزئة، وزيادة الأوكسجين. قد تحافظ هذه النهج البديلة على الثقافات لفترات أطول ، وتقلل من موت الخلايا ، وتسمح بمزيد من التفريق بين الأعضاء المعوية.
إنشاء أحادية أحادية الأبعاد مشتقة من الجهازية يوفر العديد من المزايا والعيوب مقارنة بالأعضاء القطبية المقلوبة. يسمح البروتوكول الموصوف هنا بإنشاء ثقافة أحادية الطبقة التقاء بسرعة ، عادة ، في أقل من 7 أيام وخيار الحفاظ على الثقافات على المدى الطويل لفترة طويلة من الزمن (تصل إلى 10 أسابيع). البروتوكول والوسائط المستخدمة هنا تسمح أيضا للتمايز كفاءة من أعداد كبيرة من الخلايا، وليس دائما وجدت في غيرها من الثقافات أحادية الطبقة المستمدة من الجهاز16. إنشاء طبقة واحدة على غشاء إدراج ثقافة الخلية يسمح بالوصول المتزامن إلى كلا الجانبين apical وbasolateral من الظهارة مما يجعلها مثالية للدراسات في سلامة الحاجز والنقل الظهاري. وهذا الوصول المبسط يجعلهم أكثر قابلية لدراسات العدوى والعلاج من المخدرات. وعلاوة على ذلك، تحافظ هذه الثقافات على العديد من الخصائص الفريدة للمتبرع، مع الحفاظ على أهميتها للدراسات الخاصة بالمرضى. تسهل طريقة ثقافة ALI أيضا التفريق بين ظهارة أكثر وظيفية تتكون من أنواع الخلايا الإفرارية والابترازية على حد سواء ، مما يجعلها أكثر تمثيلا لظهارة الأمعاء البشرية. كما أن الاستقرار النسبي لهذه الثقافات يسمح بالحفاظ عليها لفترة طويلة من الزمن، مما يتيح إمكانية إجراء دراسات طويلة الأجل. ومع ذلك، فإن القيود المفروضة على هذا النهج هي العدد الكبير من الخلايا المطلوبة لإنشاء طبقة أحادية التقاء والحاجة إلى الحفاظ على التقاء كامل ليكون فصل وظيفي بين الدوائر apical و basolateral. كما يتم فقدان بنية سرداب مميزة ، والتي يمكن أن تكون على غرار الثقافات العضوية ثلاثية الأبعاد عند إنشاء ثقافة أحادية الطبقة. ومع ذلك ، فإن الشكل الصديق تجريبيا للثقافة وسهولة الوصول إلى الجانبين apical وbasolateral من الظهارة ، يجعلها أداة قوية لدراسة فسيولوجيا الأمعاء.
The authors have nothing to disclose.
تم تمويل هذا البحث من خلال منحة أفق 2020 OrganoVIR 812673 على مشروع Organoids لأبحاث الفيروسات – وهو برنامج مبتكر للتدريب و ITN.
Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies Inc. | 7010 | For coating cultureware. Referred as anti-adherent solution into the main text. |
Conical tubes, 15 mL | STEMCELL Technologies Inc. | 38009 | |
Corning Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-Free | Corning | 356231 | Extracellular matrix (ECM) for maintenance and establishment of organoid lines. |
Costar 6.5 mm or 12 mm Transwell inserts | STEMCELL Technologies Inc. | 38023/38024 | For 2D Monolayer culture. |
Costar 24 Well Flat-Bottom, Tissue culture-treated plate | STEMCELL Technologies Inc. | 38017 | For maintenance and establishment of organoid lines. |
D-PBS (Without Ca++ and Mg++) | STEMCELL Technologies Inc. | 37350 | For washing |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | D2650 | Reconstitution of small molecules |
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | STEMCELL Technologies Inc. | 36254 | For washing |
Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR) | STEMCELL Technologies Inc. | 7174 | For Matrigel removal. Referred as dissociation reagent into the main text. |
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies Inc. | 6010 | For expansion of organoid lines prior to differentiation. Referred as Intestinal Organoid Expansion Medium into the main text. |
IntestiCult Organoid Differentiation Medium (Human) | STEMCELL Technologies Inc. | 100-0214 | For establishment of monolayers and 3D differentiation. Referred as Intestinal Organoid Differentiation Medium into the main text. |
Trypsin-EDTA (0.05%) | STEMCELL Technologies Inc. | 7910 | For 2D Monolayer establishment. |
Y-27632 | STEMCELL Technologies Inc. | 72302 | RHO/ROCK pathway inhibitor, Inhibits ROCK1 and ROCK2. Used for 2D monolayer establishment. |
Wide bore tips | Corning | #TF-1005-WB-R-S | Organoids handling |