皮膚修復を正確に評価するヒトEx vivo創傷モデルと全山染色法

人間の皮膚は、完全な情報、書面による患者の同意、制度的ガイドライン、倫理的承認(LRECs:17/SC/0220および19/NE/0150)の下でキャッスルヒル病院とハル王立保健室(ハル、英国)で再建手術を受けている患者から得られました。非糖尿病の皮膚は、定期的な手術を受けている患者から収集された(平均年齢=68)。糖尿病皮膚は、II型糖尿病および潰瘍の既往歴を確立したドナーから選択された(平均年齢=81歳)。手術からのサンプルは、保持媒体で輸送され、実験室に到着するとすぐに処理された。未固定のヒト組織を用いた実験ステップはすべて、クラスII層流バイオセーフティキャビネットにおいてバイオセーフティレベル2(BSL-2)で実施した。 1. 皮膚培養培地の製造と染色試薬 注: すべての試薬と消耗品の詳細は 、材料表に記載されています。人間の組織の処理と培養に使用されるすべての試薬と装置が滅菌されていることを確認してください。使用前に器具を殺菌し、組織と接触した後に消毒剤で除染する。廃棄処理前に1%消毒剤で廃棄物を除染します。 保持媒体:2 mM L-グルタミンと4%(v/v)抗生物質抗ミキサン酸溶液を含む高グルコースダルベックコの改変イーグル培地(DMEM)を補う。 抗生物質を含むハンクのバランス塩溶液(HBSS):HBSSに4%(v/v)抗生物質抗抗薬溶液を加える。使用するまで4°Cで保管してください。 Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS):蒸留水1リットル当たり9.6gのDPBS粉末を溶解してDPBSを調製(dH2O)。オートクレーブは滅菌し、使用するまで4°Cで保存します。 ヒト皮膚成長培地:2mM L-グルタミン、1%(v/v)抗生物質抗抗薬溶液、10%(v/v)胎児ウシ血清で高グルコースDMEMを補う。使用するまで4°Cで保管してください。 皮膚固定剤:450mLのdH2Oに、ホルムアルデヒド溶液40mL、氷酢酸10mL、塩化ナトリウム4.5g、臭化アルキルトリメチルアンモニウム0.25gを加える。室温(RT)で保存し、数日以内に使用してください。注意:固定性は危険です(刺激性および可燃性)。注意して取り扱い、適切なルートを介して処分します。 リン酸緩衝生理食塩水(PBS):6gの塩化ナトリウムをリン酸緩衝液100mL、dH2Oの900mLに加えて、全マウント染色用のPBSを準備します。 洗浄バッファーの染色: 0.5% (v/v) トリトン X-100 を PBS で溶解します。 ブロッキングバッファー:洗浄バッファーを染色するために0.2%(w/v)アジドナトリウムと2%(v/v)動物血清を加えます。4°Cで2週間まで保管してください。注:二次抗体宿主種の血清中のブロック。アジ化ナトリウムは、インキュベーション中の細菌の増殖を防ぎます。 DAPI作業溶液:ジメチルスルホキシドで4′,6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)の5mg/mLストックを準備します。汚れ洗浄バッファーでストック 1:1,000 を希釈して、5 μg/mL DAPI 動作溶液を提供します。 ペルオキシダーゼブロック:洗浄バッファーを染色するために0.3%(v/v)過酸化水素を加えます。使用するまで4°Cで保管してください。分解を防ぐために暗闇の中に保管してください。 ABC-HRPキット: HRP共役二次抗体:5 mLの染色緩衝液中のビオチン化ウサギ抗ヤギIgGの1滴。4°Cで2週間まで保管してください。注:使用されるキット/セカンダリは、一次抗体の宿主種によって異なります。 アビジンビオチン複合体(ABC)試薬:試薬A2滴及び5mLの洗浄緩衝液中の試薬B2滴。ABC試薬は、使用前に少なくとも30分を調製する必要があります。4°Cで2週間まで保管してください。 ペルオキシダーゼ基板:試薬1滴3滴、試薬2滴2、試薬3滴2滴、過酸化水素2滴を5mLのdH2O.ペルオキシダーゼ基板は、使用直前に新たに調製し、保存することができない。 2. 創傷のための皮膚の準備 注:これらのステップはクラスIIの層流バイオセーフティキャビネットで行われるべきです。 BSL-2キャビネットへのメディアと輸送を保持する皮膚を収集します。 90mmの滅菌ペトリ皿の中に皮膚真皮側を下に置き、滅菌はさみで脂肪組織を取り除きます。 25 mLのHBSSを含む50 mLチューブに、抗生物質を10分間RTで入れ、残った血液と脂肪組織を除去するために断続的に振ります。 新しい50 mLチューブを使用して、ステップ2.3を繰り返します。 25 mLのHBSSを含む新鮮な50 mLチューブに皮膚を入れ、今度はステップ2.3のようにRTで10分間抗生物質を使わずに皮膚を入れます。 DPBS 25 mLの新しいチューブに皮膚を入れることで、最終的な皮膚リンスを行います。皮膚は今傷つける準備ができています。 3. エキビボヒト皮膚創傷の作成 注:これらのステップはクラスIIの層流バイオセーフティキャビネットで行われるべきです。 傷つく前に皮の文化料理を準備してください。60 mm のペトリ皿に、2 つの無菌吸収パッドを積み重ね、皿の側面を介して 4 mL の人間の皮膚培地を加えます。無菌ナイロンフィルター膜を吸収パッドスタックに配置します。注:皮膚メディアは、必要な治療条件に応じて変更することができます。各スタック上で最大3つの創傷外植を培養することができる。 90mmペトリ皿で滅菌ガーゼの皮膚の真皮側を乾燥させて、残留DPBSを除去します。注:これは、傷のときに皮膚が滑り回るのを防ぎます。 きれいな90mmのペトリ皿の蓋の上に皮膚真皮側を下に置き、新鮮な滅菌ガーゼで乾燥した表皮を手に入れます。注:ペトリ皿の蓋の皮膚は、ベースよりも簡単に傷つきます。その後の作業は、皮膚が乾燥するのを防ぐために迅速に行われるべきです。 皮膚を引き締め、2mmの生検パンチを皮膚に押し付け、そっとねじります。皮膚を完全にパンチしないでください。注:部分的な厚さの傷は、表皮を通って部分的に真皮にパンチするように設計されています。部分的な厚さの創傷を作成するために必要な力にドナーからドナーへの変動および部位間の変動があるかもしれない。 湾曲した歯付き組織鉗子を使用して2mmの傷口の両側を拾い、2mmの傷口の下に湾曲した虹彩はさみを引き締め、均一に切り取ります。 中央2mmの創傷の周りの生検は、6mm生検パンチを使用して、中央に部分的な厚さ2mmの傷を有する6mmの外植を作り出す。注:6 mm生検パンチは、各2mmの傷が必要な場所をマークするために皮膚をスコアリングするために使用することができます。組織全体に突き刺さらないで注意してください。脱毛を減らすためにハニカムパターンで創傷の外植を作成します。 ナイロンフィルター膜スタック上に表皮を上に巻き出しを置く(ステップ3.1で作成)。注意:創傷の外植を扱うときは、中央の傷を傷つけないように注意してください。小さな鉗子を使用し、反対側の各外植を拾う。 加湿雰囲気(90~95%)で32~37°C、CO25%で創傷を1~7日間インキュベートする。2~3日ごとにメディアを交換してください。 4. エキビボ創傷の全マウント染色 注:このセクションでは、免疫蛍光および免疫ペルオキシダーゼ染色法について説明します。使用前に試薬を十分に混合してください。 蛍光染色法 500 μLの皮膚固定液を含む1.5 mLマイクロ遠心分離チューブで創傷外植を回収し、一晩4°Cでインキュベートします。注: このプロトコルで使用される固定剤は、記載されている抗体に対して適切に機能します。他の抗体には最適化が必要です。24時間を超える組織固定は、過剰固定につながる可能性があります。 翌日は固定液を取り除き、1 mLの洗浄バッファーを染色して交換します。生検は、染色前に2週間まで4°Cで洗浄緩衝液を染色して保存することができます。注:すべての洗浄バッファーのステップのために、傷を傷つけないように注意して、血清ピペットまたはピペットチップを使用してください。 洗浄バッファーを吸引し、1 mLの洗浄バッファーでもう 1 回リンスを行います。 ステップ 4.1.5~4.1.6(サンプル数 x 300 μL = μL のブロッキングバッファの量)に必要なブロッキングバッファの量を計算します。必要に応じて、追加のバッファを作成します。 各サンプルに150μLのブロッキングバッファーを加え、RTで1時間インキュベートします。すべての染色手順について、各サンプルが十分に覆われており、生検創傷表面を覆う気泡がないことを確認してください。注:このステップは1.5 mLのマイクロ遠心分離管または48の井戸板で行うことができる。48ウェルプレートを使用する場合は、各ウェルで下に傷をインキュベートします。 残りのブロッキングバッファーで一次抗体を希釈します。注:アンチマウスケラチン14(K14)は、ブロッキングバッファで1:1,000を希釈してうまく機能します。他の抗体または複数のプローブで使用するために、このステップを最適化します。 ブロッキングバッファーを吸引し、ウェル/マイクロ遠心分離チューブあたり 150 μL の一次抗体を加えます。創傷外植を一晩4°Cで一次抗体にインキュベートする。 翌日、一次抗体を吸引し、RTで1時間0.2%アジ化ナトリウムを含む洗浄バッファーを洗浄液に吸い込む(1サンプルあたり500μL)。 洗浄バッファー(洗浄1回30分、サンプルあたり500 μL)を使用して、さらに3つの洗浄工程を実行します。 洗浄バッファーを染色する蛍光結合二次抗体を希釈する(例えば、1:400希釈時にヤギ抗マウス488)。 必要な二次抗体の量(サンプル数 x 150 μL = μLの量)を計算します。 各ウェル/マイクロ遠心分離チューブに150 μLの二次抗体を加えます。RTで1時間インキュベートする. 二次抗体が光感受性であるため、暗闇の中でインキュベーションステップ4.1.10~4.1.16を行います。注:このステップは、必要に応じて一晩4°Cで実行することができます。十分なシグナルと限られたバックグラウンド染色に必要な二次抗体の濃度を最適化します。 二次抗体を取り出し、洗浄バッファー(サンプルあたり500 μL)で3 x 30分のリンスを行います。 残った洗浄バッファーを破棄し、必要な DAPI の作業ソリューションの量を計算します (ステップ 4.1.11 に従って)。 RTで10分間のDAPI作業ソリューションの150 μLを備えた各外植物に対抗します。注:DAPIは細胞核を青色に染色します。Hoechst染料は、DAPIの代替として使用することができます。 洗浄バッファー(サンプルあたり500 μL)で2回の最終30分洗浄を行います。生検は、画像化の2週間前まで暗闇の中で4°Cの洗浄緩衝液を染色して保存することができる。 ブライトフィールド染色法。 ステップ 4.1.1 ~ 4.1.3 を実行します。 ペルオキシダーゼブロックを一晩4°Cで焼入れ内因性ペルオキシダーゼ活性。注:このステップは、組織からの非特異的なバックグラウンド染色を減らすためにHRP結合抗体を使用する場合に重要です。高度に血管化された組織は、より内因性ペルオキシダーゼ活性を含む。 ペルオキシダーゼブロックを捨て、洗浄バッファーを染色して30分間2回洗い流します。 ステップ 4.1.4 ~ 4.1.8 を実行します。注:ステップ4.1.7の後のワッシュは、サンプルからアジ化ナトリウムを除去するために特に重要です。アジドナトリウムが十分に除去されない場合、HRPを不活性化し、染色検出を妨げる。 各ウェル/マイクロ遠心分離チューブに150 μLのHRP共役二次抗体を加え、RTで一晩4°Cまたは1時間でインキュベートします。 二次抗体を取り除き、洗浄バッファーを染色する際に3 x 30分洗浄を行います。 各ウェル/マイクロ遠心分離チューブに150 μLのABC試薬を加え、RTで4°Cまたは1時間で一晩インキュベートします。 ABC試薬を吸引し、洗浄バッファーを染色して3 x 30分洗浄を行う。 1つの外植体に150 μLペルオキシダーゼ基板を加え、顕著な色の変化を検出するのに必要な時間を決定します。注: 強い染色が予想されるサンプルを選択します。この場合、赤い環は、移行する表皮を示す(K14)。3,3′-ジアミノベンジジン-4、または任意の他の適切な発癌基質は、このペルオキシダーゼ基質の代替として使用され得る。 色の変化が観察されたら、ペルオキシダーゼ基板を取り除き、1 mLのdH2Oと交換します。 他の外植者に対するペルオキシダーゼ基板検出を繰り返し、ステップ4.2.11で決定した時間に対してインキュベートする。 1 mLのdH2Oで全ての外植物をすすいで、残留ペルオキシダーゼ基板を除去します。外植はイメージングの前に4°Cで1週間まで貯蔵することができるが、パーオキシダーゼ基板が時間の経過とともにdH2Oに浸出するのを防ぐためにできるだけ早くそれらをイメージする方が良い。 5. イメージングと定量 蛍光イメージング注意:蛍光イメージングは、共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して行われます。しかし、反転蛍光顕微鏡は、創傷閉鎖率を定量化するために2D画像を取得するのに十分な場合があります。二次抗体を選択する際には、選択した蛍光色素が、利用可能な顕微鏡装置の励起および発光スペクトルと互換性があることを確認してください。 2.5倍、10倍、20倍の目的、x-y-z電動ステージ、デジタルカメラ、および取得ソフトウェアを搭載した共焦点レーザー走査顕微鏡を使用します。透過光検出器(TPMT)をオンにして、各生検を簡単に可視化し、全創傷閉鎖の測定を可能にします。あるいは、蛍光イメージングに続く明視野顕微鏡を介して各創傷を測定する。 イメージングプラットフォームに60mmのペトリ皿ベースを置き、DPBSの薄い層(約1mL)を追加します。注:DPBSが多すぎると、イメージング中に生検が動き回る。または、プレートホルダーが利用可能な場合は、48ウェルプレートを使用します。 小さな組織鉗子を使用して、傷ついた外植を井戸/マイクロ遠心チューブからDPBSを含むペトリ皿に移します。生検の傷口をペトリ皿に下に置きます。 接眼レンズと蛍光灯を使用して、傷口を見つけて焦点を当てます。気泡が視野のサンプルの下に閉じ込められている場合は、組織鉗子で創傷を拾い上げ、再配置します。 イメージングソフトウェアをセットアップし、チャンネル間のピンホールサイズを均等にして最適な共焦点性を確保します。この場合、各チャンネルの 1 つの風通しの良い単位の値を確認し、最大値を選択します。スキャン速度、画質、平均を選択します。注:共役二次抗体と選択されたカウンターステイン(例えば、DAPI)のフルオロクロムは、必要なチャネルを指示します。 ライブ取得ソフトウェアのスイッチをオンにし、レーザーパワーと各チャンネルのゲインを、染色を視覚化するために必要なレベルに調整します。デジタルオフセットを増やすことで、バックグラウンドノイズを低減します。 創傷を撮像平面の中央に配置します。注:傷が小さな目的を使用したり、より大きな創傷を作成したりするために画像全体を埋め尽くさない場合は、画像のパネルを取り、それらを一緒にステッチします(手動で、または関連するイメージングソフトウェアのタイリング機能を使用)。 創傷生検の画像を取得します。外植間で同じイメージング設定を使用します。注:高いパワー画像は、組織構造と細胞マーカーの発現と位置の評価を可能にします。 特にペトリ皿に対して組織が完全に平坦でない場合は、創傷を通してシリアルZスタックを収集します。解析ソフトウェアを使用して、Z スタックを単一の最大強度投影イメージに集約します。 ブライトフィールドイメージング注:免疫ペルオキシダーゼ染色生検の明視野イメージングは、複数の方法で行うことができます。 逆顕微鏡イメージング:ペトリ皿に入れ、手順5.1.2~5.1.3に記載の画像撮影用の創傷外植を準備します。デジタルカメラを搭載した反転顕微鏡で明視野照明下でデジタル画像を取得します。必要に応じて、複数の画像をつなぎ合わせます。 ワイヤレスデジタル顕微鏡イメージング: 携帯電話やラップトップに接続されたワイヤレスデジタル顕微鏡を使用して、費用対効果の高い方法で高品質の画像を取得します。外植をいくつかの組織に巻き上げ、残りのdH2O(または洗浄緩衝液を染色)をサンプル貯蔵から取り除きます。創傷外植を顕微鏡の視野の中央に置きます。接続されたカメラを使用して画像を取得します。 定量化注: フリーハンド形状を描画して測定できるソフトウェアでは、傷の閉鎖率を定量化できます。ImageJ は、次のように定量化に使用できます。 イメージ J ソフトウェアで、定量化するイメージを開きます。 フリーハンドの形状ツールを使用して、通常の皮膚と出会う再上皮化創傷の外側を描きます。 M (または 分析|を押す「外側」領域測定を取得する測定。注:再上皮化創傷組織の質感は正常な皮膚とは異なる。この種の解析の前に、画像を拡大縮小する必要はありません。 フリーハンドのシェイプツールを使用して、開いた巻き領域の周囲に描画します。これは、開いた創傷が再上皮組織の内側の端と出会う場所です。 M (または 分析|を押す「内側」領域測定を取得する測定。 次の式を使用して、創傷の再表皮化/閉鎖率を推測します。% クロージャー = (外巻面積 – 内創傷領域) / (外創面積) x 100注:抗体の割合面積の範囲は、同じ方法(例えば、K14)または全創傷面積の割合として推測することができます。パーセンテージ強度はまた、関心のあるマーカーの組織レベル発現に関する半定量的情報を提供することができ、一方、高出力イメージングは細胞レベルで発現データを提示する。