Humanes Ex-vivo-Wundmodell und Whole-Mount-Färbeansatz zur genauen Bewertung der Hautreparatur
Summary
Hier demonstrieren wir eine optimierte Technik zur Beurteilung der Wundreparatur mit ex vivo menschlicher Haut in Kombination mit einem Whole-Mount-Färbeansatz. Diese Methodik bietet eine präklinische Plattform für die Bewertung potenzieller Wundtherapien.
Abstract
Chronische nicht heilende Wunden, die vor allem ältere Menschen und Diabetiker betreffen, sind ein bedeutender Bereich des klinisch ungedeckten Bedarfs. Leider sind die derzeitigen chronischen Wundbehandlungen unzureichend, während die verfügbaren präklinischen Modelle die klinische Wirksamkeit neuer Therapien schlecht vorhersagen. Hier beschreiben wir ein präklines Modell mit hohem Durchsatz, um mehrere Aspekte der menschlichen Hautreparaturreaktion zu bewerten. Wunden mit partieller Dicke wurden in der menschlichen Ex-vivo-Haut erzeugt und über einen Heilungszeitverlauf kultiviert. Hautwundbiopsien wurden als Fixiermittel für das Ganzfärbeverfahren gesammelt. Fixierte Proben wurden blockiert und in primären Antikörpern inkubiert, wobei der Nachweis über fluoreszierend konjugierte sekundäre Antikörper erfolgen sollte. Die Wunden wurden gegengefärbt und mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet, bevor der prozentuale Wundverschluss (Reepithelisierung) in jeder Biopsie berechnet wurde. Unter Anwendung dieses Protokolls zeigen wir, dass 2 mm Exzisionswunden, die in gesunder Spenderhaut entstehen, bis zum Tag 4-5 nach der Verwundung vollständig reepithelialisiert werden. Im Gegenteil, die Verschlussraten von diabetischen Hautwunden sind signifikant reduziert, begleitet von einer gestörten Barrierereformation. Die Kombination von menschlichen Hautwunden mit einem neuartigen Whole-Mount-Färbeansatz ermöglicht eine schnelle und reproduzierbare Methode zur Quantifizierung der Ex-vivo-Wundreparatur. Insgesamt bietet dieses Protokoll eine wertvolle menschliche Plattform, um die Wirksamkeit potenzieller Wundtherapien zu bewerten und präklinische Tests und Validierungen zu transformieren.
Introduction
Chronische, nicht heilende Wunden, die bei älteren Menschen und Diabetikern weit verbreitet sind, sind ein stark ungeschätzter Bereich des klinischen ungedeckten Bedarfs. Diese Wunden stellen eine große physische und psychische Belastung für die Patienten dar und kosten Gesundheitsdienstleister jedes Jahr Milliarden, um1zu behandeln. Trotz eines verbesserten Verständnisses der Wundbiologie und Fortschritten in der Technologie können bis zu 40% der chronischen Wunden nach bester Standardversorgung immer noch nicht heilen2. So benötigen 14-26% der Patienten mit diabetischen Fußgeschwüren anschließend eine Amputation3,während die 5-Jahres-Sterblichkeitsrate nach der Amputation bei etwa 70%liegt 4. Infolgedessen besteht ein dringender Bedarf an der Entwicklung wirksamer neuer Therapien, um die Lebensqualität der Patienten zu verbessern und gleichzeitig die erhebliche Gesundheitsbelastung durch schlecht heilende Wunden zu reduzieren. Schlecht prädiktive präklinische Modelle bleiben eine erhebliche Hürde für die Entwicklung wirksamer neuer Therapien.
Die Wundreparatur ist ein dynamischer und facettenreicher Prozess, der eine Vielzahl von Zelltypen, unzählige Kommunikationsebenen und eine Gewebeumgebung umfasst, die zeitlich umgestaltet wird. Die Hautheilung wird durch vier haupt reparative Stadien untermauert: Hämostase, Entzündung, Proliferation und Matrixumbau. Diese Stadien wirken letztendlich, um Blutverlust und Infektionen zu verhindern, die Wundoberfläche zu schließen (ein Prozess, der als Reepithelisierung bezeichnet wird) und die Haut in einen unverletzten Zustandzurückvergeben 5. Chronische Wunden sind mit einer vielfältigen Ätiologie und einer weit verbreiteten Störung der Heilungsprozesse verbunden6, was die Identifizierung therapeutischer Ziele weiter erschwert. Dennoch wurde eine breite Palette von Modellen entwickelt, um sowohl die molekularen und zellulären Treiber der Wundpathologie aufzuklären als auch neue therapeutische Ansätze zu testen7.
Das am häufigsten verwendete Wundreparaturmodell ist die akute Wunde in der Maus. Mäuse sind für mechanistische Studien in hohem Maße beherrschbar und liefern validierte Modelle des Alterns und Diabetes8. Trotz der allgemeinen Ähnlichkeiten zwischen der Heilung von Maus und Mensch bleiben Unterschiede zwischen den Arten in der Hautstruktur und der Heilungsdynamik bestehen. Dies bedeutet, dass die meisten murinen Wunduntersuchungen nicht leicht auf die Klinik übertragen werdenkönnen 9. Folglich gab es einen Schub in Richtung menschlicher in vitro und ex vivo Systeme mit hoher Anwendbarkeit und Übersetzbarkeit10,11.
Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die Durchführung von Exzisionswunden mit teildicker Dicke in ex vivo menschlicher Haut. Wir skizzieren auch unseren Whole-Mount-Färbeansatz als eine hochgradig reproduzierbare Methode zur Bewertung der Ex-vivo-Heilung menschlicher Haut. Wir zeigen den Verlauf der epidermalen Reparatur (Re-Epithelisierung) und der anschließenden Barrierebildung und bewerten die Rate des Wundverschlusses bei gesunder und diabetischer menschlicher Haut. Schließlich zeigen wir, wie die Ganzkörperfärbung für die Verwendung mit einer Reihe von Antikörpern angepasst werden kann, um verschiedene Aspekte der Heilungsreaktion zu beurteilen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem experimentellen Protokoll beschreiben wir eine optimierte Methode zur Bewertung des Wundverschlusses in menschlicher Ex-vivo-Haut mittels Ganzkörpergewebefärbung. Dies ist eine wichtige Ressource, um eine kritische Bewertung potenzieller Wundbehandlungen zu ermöglichen und ein besseres Verständnis der menschlichen Wundreparaturreaktion zu ermöglichen. Wir haben eine Heilungsbewertung bei Ex-vivo-Hautwunden veröffentlicht, die zuvor12,13, aber in diesen Berichten wurde der Whole-Mount-Färbeansatz nicht zur Messung des Wundverschlusses verwendet. Die Färbung auf ganzer Montage ist viel einfacher und erfordert weniger technische Erfahrung als die Standardhistologie, bei der Paraffin oder OCT eingebettet und Proben zerschnitten werden. Das Whole-Mount-Verfahren reduziert auch die experimentelle Variabilität und ermöglicht die Quantifizierung der gesamten Wunde und nicht nur eines einzelnen Querabschnitts an einer definierten Position innerhalb des Gewebes (siehe Abbildung 4B zur vergleichenden Veranschaulichung). Wir unterstützen voll und ganz die Bedeutung der Quantifizierung der Heilung der gesamten nicht-symmetrischen Wundstruktur, wie von Rhea und Dunnwald für akutemurine Wundenklar umrissen 14 . Diese Autoren zeigten, wie wichtig die serielle Schnittung von In-vivo-Exzisionswunden für reproduzierbare und präzise Messungen der Wundmorphologie ist. Serielle Schnitte könnten auch auf menschliche Ex-vivo-Wunden angewendet werden; Für eine genaue Quantifizierung des Wundverschlusses und der Reepithelisierung sollte jedoch die Hochdurchsatz-Ganzmontagefärbung die bevorzugte Methode sein. Wir weisen darauf hin, dass dieses Whole-Mount-Färbeprotokoll auch mit der anschließenden Verarbeitung (Wachs oder OCT) für die traditionelle histologische Analyse kompatibel sein sollte.
Ganzmontage ist nicht ohne Nachteile. Während es eine höhere Reproduzierbarkeit in Wundheilungsexperimenten bietet, erfordert es die Verwendung von mehr Gewebe für die Analyse als Standard-histologische Techniken. Dies kann ein Problem sein, wenn der Zugang zu Gewebe eingeschränkt ist, insbesondere wenn mehrere Antikörper bewertet werden müssen. Ein alternativer Ansatz wäre die Anwendung einer Schnittwundenmethode, bei der die Wundbreite relativ gleichmäßig ist und die Variabilität reduziert ist (wie in Maus- und menschliche Wunden15,16gezeigt). Exzisionswunden bleiben jedoch für die meisten pathologischen Wundtypen anwendbar17.
In dieser Studie wurden 2 mm teildicke Wunden in der Mitte von 6 mm Hauterregungen erzeugt. Diese Methode kann für alternative Exzisionswunde und Explantionsgrößen in verschiedenen Hauttiefen optimiert werden18. Darüber hinaus variiert die Kraft, die erforderlich ist, um Wunden zu erzeugen, zwischen den Spendern, wobei gealterte Haut weniger Kraft zur Biopsie benötigt. Wir würden auch vermeiden, Haut zu verwenden, die auffällige Dehnungsstreifen oder andere strukturelle Veränderungen aufweist. Wir haben eine Reihe von Antikörpern validiert, um verschiedene Aspekte der Ex-vivo-Heilungsreaktion zu berücksichtigen. Dieses Protokoll kann auch mit anderen hautrelevanten Antikörpern verwendet werden, bei denen Antikörperkonzentrationen und Inkubationszeiten optimiert werden müssen. Dennoch glauben wir, dass unser Protokoll am besten für die absolute Quantifizierung des gesamten Wundverschlusses geeignet ist, gefolgt von einer räumlichen Bewertung spezifischer Proteine von Interesse. Während Whole-Mount eine reduzierte Auflösung der Immunlokalisierung im Vergleich zur histologischen Standardanalyse von Gewebeschnitten bietet, liefert es zusätzliche 3D-Informationen, die in der Standard-2D-Histologie fehlen.
Ein Vorbehalt bei der Beurteilung der Heilung in Ex-vivo-Haut im Vergleich zu In-vivo-Modellen ist, dass es keine systemische Reaktion gibt. Ein wichtiger Aspekt der Wundreparatur ist die Entzündung und anschließende Gewebegranulation, die durch einen Zustrom von Entzündungszellen und Endothelzellen aus dem Gefäß verursacht wird19. Trotz dieser Einschränkung bietet ex vivo Haut immer noch eine bessere Rekapitulation der klinischen Heilung als zellbasierte Wundtests. In-vitro-Experimente beinhalten im Allgemeinen Einzelzell-Monoschichten oder Co-Kulturen, die auf Gewebekulturkunststoff gezüchtet wurden, während ex vivo Haut eine native Umgebung bietet, um das Zellverhalten zu erforschen. In jüngerer Zeit sind eine Reihe von hautäquivalenten Systemen entstanden, bei denen die Haut in einer Laborumgebung aus künstlicher Matrix und isolierten Hautzellen gezüchtet wird20,21. Obwohl diese Modelle die menschliche Haut besser nachahmen als die meisten In-vitro-Ansätze, simulieren sie immer noch nicht vollständig die native Gewebeumgebung und sind im Allgemeinen zu zerbrechlich, um reproduzierbar zu verletzen. Darüber hinaus haben wir (und andere) gezeigt, dass ex vivo menschliches Hautgewebe ansässige Immunzellen behält, was zweifellos zur Reparatur beitragen wird22,23. Zukünftige Arbeiten sollten sich nun darauf konzentrieren, die Lebensfähigkeit und Immunkompetenz des Ex-vivo-Modells für die Heilungsbewertung im Spätstadium zu erweitern24. Eine Option ist die Weiterentwicklung vielversprechender Organ-on-a-Chip-Technologien, die in der Lage sind, die Lebensfähigkeit des Gewebes zu verlängern und die native Hautarchitektur für bis zu zwei Wochen in Kulturaufrechtzuerhalten 25. Ex-vivo-Modelle haben auch begonnen, die Bedeutung der Entzündungsreaktion der Haut zu berücksichtigen, indem sie erfolgreich Immunzellen wie Neutrophile in das Wirtsgewebeeinbauen 26 oder Wirtsgewebe mit Antikörpern injizieren, um eine Immunreaktionauszulösen 27. Wir gehen davon aus, dass diese Erkenntnisse den Weg für die Entwicklung verfeinerter und übersetzbarer Methoden in der Zukunft ebnen werden.
Ein großer Vorteil der Verwendung von Ex-vivo-Haut zur Messung des Wundverschlusses ist die Fähigkeit, Heilungsraten in gesundem (z. B. nicht-diabetischem) und pathologischem (z. B. diabetischem oder gealtertem) Gewebe zu vergleichen. Hier haben wir gezeigt, dass Re-Epithelisierung und Barrierebildung bei diabetischen versus gesunden Ex-vivo-Wunden tatsächlich beeinträchtigt sind. In der Tat bietet dies einen Weg für die präklinische Bewertung der pathologischen Reparatur, wo Alterung und Diabetes Hauptrisikofaktoren für die Entwicklung chronischer Wunden sind1. Während in vitro pathologische Modelle existieren, wie Zellen, die aus gealtertem und diabetischem Gewebe isoliert wurden, oder Zellen, die in hoher Glukose kultiviertwurden,um Hyperglykämie nachzuahmen28,29, können diese Zellen schnell ihren Phänotyp verlieren, sobald sie aus der In-vivo-Mikroumgebung entfernt wurden. Ein wichtiger Bestandteil der extrinsischen pathologischen Heilungsumgebung ist die dermale Matrix, die sowohl beim Altern als auch bei Diabetes30verändert wird. Tatsächlich beeinflusst diese gestörte Matrix das Verhalten der ansässigen und naiven Fibroblasten31,32. Daher ist die Bedeutung der Untersuchung von Zellen in ihrer Wirtsgewebeumgebung nicht zu unterschätzen.
Zusammenfassend bietet unser Protokoll eine wichtige Plattform, um die Reepithelisierung menschlicher Wunden zu quantifizieren, regulatorische Faktoren zu erforschen und die Validität und Wirksamkeit potenzieller Therapeutika zu testen12,13. Während präklinische Tests immer noch In-vivo-Ansätze erfordern, sollte eine kombinierte Strategie, bei der ex vivo menschliches Gewebe und in vivo murine Verwundungen verwendet werden, den präklinischen Weg verfeinern, den Tiereinsatz reduzieren und gleichzeitig die artübergreifende Übersetzbarkeit erhöhen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Herrn Paolo Matteuci und Herrn George Smith für die Bereitstellung von Patientengewebe. Wir danken auch Miss Amber Rose Stafford für die Unterstützung bei der Gewebeentnahme und dem Daisy Appeal für die Bereitstellung von Laboreinrichtungen.
Materials
| 50 mL Falcon Tubes | Falcon | 352070 | For skin washing |
| 1.5 ml TubeOne Microcentrifuge Tubes, Natural (Sterile) | Starlab | S1615-5510 | For whole-mount staining |
| 48-Well CytoOne Plate, TC-Treated | Starlab | CC7682-7548 | For whole-mount staining |
| Acetic Acid Glacial | Fisher Chemical | A/0400/PB15 | Part of fixative |
| Alkyltrimethylammonium Bromide | Sigma-Aldrich | M7635 | Part of fixative |
| Anti-Alpha Smooth Muscle Actin Antibody [1A4] | Abcam | ab7817 | Stains blood vessels |
| Anti-Collagen I Antibody | Abcam | ab34710 | Stains collagen |
| Anti-Cytokeratin 14 Antibody [LL002] | Abcam | ab7800 | Stains epidermis |
| CD1A Antibody (CTB6) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5265 | Stains Langerhans cells |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | 62247 | Counterstain for cell nuclei |
| Falcon 60mm Petri dishes | Falcon | 353004 | Human ex vivo culture |
| Fibronectin Antibody (EP5) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8422 | Stains fibronectin |
| Formaldehyde, Extra Pure, Solution 37-41%, SLR | Fisher Chemical | F/1501/PB17 | Part of fixative |
| Gauze Swabs | Medisave | CS1650 | To clean skin |
| Gibco™ Antibiotic-Antimycotic Solution | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Human ex vivo culture |
| Gibco DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960044 | Human ex vivo culture |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Human ex vivo culture |
| Gibco HBSS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14170088 | Human ex vivo culture |
| Gibco L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Human ex vivo culture |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | For immunoperoxidase staining |
| ImageJ Software | National Institutes of Health | N/A | For image analysis |
| Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | Secondary antibody used depends on required fluorochromes and primary antibody |
| Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A11012 | Secondary antibody used depends on required fluorochromes and primary antibody |
| Invitrogen LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher Scientific | L3224 | For viability assessment of tissue |
| Iris Forceps, 10 cm, Curved, 1×2 teeth | World Precision Instruments | 15917 | To create wounds |
| Iris Scissors, 11 cm, Curved, SuperCut, Tungsten Carbide | World Precision Instruments | 501264 | To create wounds |
| Iris Scissors, 11 cm, Straight, SuperCut, Tungsten Carbide | World Precision Instruments | 501263 | To remove adipose tissue |
| Keratin 1 Polyclonal Antibody, Purified | Biolegend | 905201 | Stains epidermis |
| Keratin 14 Polyclonal Antibody, Purified | Biolegend | 905301 | Stains epidermis |
| LSM 710 Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | Discontinued | For fluorescent imaging |
| Merck Millipore Absorbent pads | Merck Millipore | AP10045S0 | Human ex vivo culture |
| Merck Millipore Nylon Hydrophilic Membrane Filters | Merck Millipore | HNWP04700 | Human ex vivo culture |
| Normal Goat Serum Solution | Vector Laboratories | S-1000-20 | Animal serum used depends on secondary antibody |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P3619 | For wash buffer |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | For blocking buffer |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-212 | Part of fixative |
| Sterilisation Pouches | Medisave | SH3710 | To sterilise instruments |
| Stiefel 2mm biopsy punches | Medisave | BI0500 | For partial thickness wound |
| Stiefel 6mm biopsy punches | Medisave | BI2000 | For outer explant |
| Thermo Scientific Sterilin Standard 90mm Petri Dishes | Thermo Fisher Scientific | 101VR20 | To prepare skin |
| Triton X-100 | Fisher Chemical | T/3751/08 | For wash buffer |
| VECTASTAIN Elite ABC-HRP Kit, Peroxidase (Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-6101 | For immunoperoxidase staining; HRP kit used depends on primary antibody |
| Vector NovaRED Substrate Kit, Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories | SK-4800 | For immunoperoxidase staining |
| Wireless Digital Microscope | Jiusion | N/A | For brightfield imaging |
References
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