Кратковременная индукция гипотермии у крыс с использованием моделей для исследований, изучающих клиническую значимость и механизмы
Summary
В данной статье описаны два метода индукции кратковременная гипотермия всего тела у крыс. Первый, быстрый индукционный метод, использует активное охлаждение с использованием вентиляторов и распыления этанола для быстрого снижения температуры. Второй способ – метод постепенного охлаждения. Это достигается с помощью комбинации изофлурановой анестезии и снижения температурных настроек на гомеотермическом тепловом мате. Это приводит к постепенному снижению температуры тела без использования каких-либо внешних охлаждающих устройств.
Abstract
Терапевтическая гипотермия (TH) является мощной нейропротекторной стратегией, которая предоставила надежные доказательства нейропротекции в доклинических исследованиях неврологических расстройств. Несмотря на убедительные доклинические доказательства, TH не показал эффективности в клинических испытаниях большинства неврологических расстройств. Единственные успешные испытания, использующие терапевтическую гипотермию, были связаны с остановкой сердца у взрослых и гипоксическим ишемическим повреждением у новорожденных. Необходимы дальнейшие исследования параметров его использования и сравнение дизайна исследований между доклинических и клиническими исследованиями. В данной статье демонстрируются два метода индукции кратковременная гипотермия. Первый метод позволяет быстро индуцирования гипотермии у крыс с помощью этанолового спрея и вентиляторов. Этот метод работает путем охлаждения кожи, что реже используется в клинических испытаниях и может иметь различные физиологические эффекты. Охлаждение происходит гораздо быстрее с помощью этой техники, чем достижимо у пациентов-людей из-за различий в соотношении площади поверхности к объему. Наряду с этим представлен и второй метод, который позволяет обеспечить клинически достижимую скорость охлаждения при кратковременная гипотермия. Этот метод прост в реализации, воспроизводим и не требует активного охлаждения кожи.
Introduction
TH – это практика охлаждения температуры тела или мозга с целью сохранения жизнеспособности и функции органа/системы1,2. Роль гипотермии в нейропротекции была исследована и показала преимущества в ряде доклинических моделей неврологических заболеваний, таких как инсульт3,субарахноидальное кровоизлияние4и черепно-мозговая травма5. С точки зрения клинического применения, TH показал эффективность у пациентов после остановки сердца и при гипоксически-ишемическом повреждении новорожденных6.
Индукция TH достигается с использованием поверхностных или эндоваскулярных методов охлаждения. Большинство доклинических исследований гипотермии выполняют поверхностное охлаждение путем нанесения воды или этанола на шерсть животного или с использованием охлаждающего одеяла для достижения целевой температуры1. У человека системное охлаждение поверхности достигается за счет использования пакетов со льдом и охлаждающих одеял7,8. Более быстрое охлаждение было показано у пациентов, использующих эндоваскулярные методы, которые соединяют индукционную инфузию холодного физиологического раствора через внутривенный или внутриартериальный катетер с размещением эндоваскулярного охлаждающего устройства в пределах нижней полой вены9,10. Например, умеренная целевая температура 33 °C может быть достигнута через 1,5 ч при эндоваскулярном охлаждении по сравнению с 3-4 ч при поверхностном охлаждении у пациентов11. Эндоваскулярный подход также стал более популярным в последние годы, потому что, как сообщается, он уменьшает некоторые побочные эффекты, наблюдаемые при системном охлаждении поверхности, такие какдрожь 12,13. Европейское многоцентровое рандомизированное клиническое исследование III фазы гипотермии при ишемическом инсульте (EUROHYP-1) использовало в основном поверхностное охлаждение14. Результаты, недавно опубликованные в этом исследовании, показали, что дрожь была серьезным осложнением и, возможно, ограничивала способность достигать целевой температуры10. Известно, что реакция на дрожь в основном обусловлена температурой кожи. Были предприняты некоторые усилия для разработки метода эндоваскулярного охлаждения грызунов15,но высокоинвазивный характер метода по сравнению с тем, который используется у людей, рискует спутать любые результаты, полученные из этой модели.
Температура является ключевым модулятором биологических процессов в организме и жестко регулируется гомеостазом. Поэтому любые манипуляции с температурой тела могут иметь сопутствующие риски. Продолжительность охлаждения является фактором, который, возможно, ограничил успех клинических испытаний гипотермии. В этих испытаниях используется длительный метод охлаждения, при этом многие из них сохраняют гипотермию от 24-72 ч11. Эта увеличенная продолжительность создает риск заражения во время протокола охлаждения. Пневмония является наиболее распространенным осложнением от переохлаждения, затрагивающим между 40-50% пациентов, которые проходят процедуру13. Это контрастирует с тем, что обычно наблюдается в исследованиях гипотермии на животных, где используется кратковременная парадигма (1-6 ч)3. Успех этих доклинических исследований на животных, вероятно, приведет к адаптации кратковременной гипотермии для использования в клинических испытаниях. В результате необходимо иметь на животных модель кратковременье гипотермии, которая напоминает скорость охлаждения будущих клинических испытаний. Дополнительные подробности, относящиеся к другим температурным параметрам и обоснованности кратковременным переохлаждениям, обсуждались в нескольких обзорных статьях1,16,17,18.
Здесь демонстрируется постепенная модель охлаждения, которая более клинически достижима, чем современные экспериментальные модели гипотермии. Этот новый метод имеет гораздо более медленную скорость охлаждения и, следовательно, время до целевой температуры ближе к диапазону тех, которые наблюдаются в клинических испытаниях гипотермии11. Он также избегает прямого охлаждения поверхности, которое имеет специфические физиологические эффекты, и, следовательно, может быть более сопоставимым с эндоваскулярным охлаждением, которое было наиболее часто используемым методом охлаждения в клинических испытаниях9,12. Эта модель позволяет постепенно охлаждать животных в течение 2 ч с последующим коротким периодом поддержания при целевой температуре. Кроме того, также продемонстрирована быстрая охлаждение метода кратковременная гипотермия19. Метод быстрого охлаждения позволяет быстро достичь целевой температуры после начала гипотермии. Хотя этот подход не так клинически актуален, как метод постепенного охлаждения, он полезен для исследований, направленных на изучение механизмов нейропротекции гипотермии, чтобы потенциально имитировать ее мощные нейропротекторные эффекты фармакологически. Этот метод также имеет потенциальное применение за пределами нейробиологии и может быть адаптирован к любому количеству доклинических исследований. Еще одним преимуществом обоих методов по сравнению с другими подходами является то, что они недороги и не требуют специального оборудования. Наконец, этот протокол также демонстрирует имплантацию регистраторов температурных данных, поскольку послеоперационное потепление и его мониторинг важны для предотвращения непреднамеренного послеоперационного переохлаждения, поскольку оно может спутать результаты исследования20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Процедуры, описанные здесь, легко реализуются, неинвазивны и обеспечивают надежное и воспроизводимое снижение температуры тела до желаемой целевой температуры.
Существует несколько критических этапов в методе быстрого охлаждения, которые включают в себя следующее. Не перенасыщение этаноловым спреем – необходимо соблюдать осторожность, чтобы не замочить животное в этаноле, так как это помешает результатам. Следите за животным во время индукции гипотермии – необходимо тщательно следить за реакцией животных на быструю индукцию гипотермии. Тщательное наблюдение за ректальной температурой важно для обеспечения того, чтобы температура не опускалась ниже желаемой цели – если это произойдет, выключите вентиляторы и позвольте тепловой лампе осторожно согреть животное обратно к требуемой цели.
В обоих методах физиологический мониторинг важен для обеспечения соответствующей корректировки дозы анестетика. При длительном охлаждении неадекватная доза анестетика может продлить продолжительность охлаждения. В этом случае концентрация изофлурана может быть увеличена до тех пор, пока не будет достигнута адекватная скорость охлаждения. Другим важным шагом является перекрестная калибровка температурных устройств. При использовании теплового мата с регулируемым температурным зондом и регистратора данных в одном и том же эксперименте рекомендуется перекрестно калибровать регистратор данных с ректальным зондом in vivo, поскольку могут быть незначительные изменения в зарегистрированной температуре двух устройств.
Эти методы подходят для исследований, которые хотят изучить использование гипотермии в качестве потенциального лечения неврологических расстройств. Конкретная цель исследования должна диктовать, какой метод используется. Оба метода можно классифицировать как системное поверхностное охлаждение, однако второй метод не требует активного охлаждения. Модель постепенного охлаждения, описанная выше, имеет важные потенциальные применения для использования гипотермии в лечении ишемического инсульта. Длительная гипотермия и связанные с ней осложнения представляют собой проблему для пожилых пациентов с инсультом. Кроме того, дрожащая реакция затрудняет достижение целевой температуры у некоторых пациентов10. В то время как противодрожащие лекарства могут помочь уменьшить реакцию на дрожь, кратковременное постепенное охлаждение может более эффективно облегчить проблему. Наличие более короткого периода охлаждения также, вероятно, снизит заболеваемость пневмонией, о которых часто сообщалось в испытаниях. Еще одним потенциальным преимуществом этого кратковременного метода является то, что скорость согревания может быть не такой важной по сравнению с длительным охлаждением. Очень ранние клинические исследования длительного охлаждения у пациентов с инсультом с большими инфарктами показали, что быстрое согревание приводило к значительному повышению внутричерепного давления (ВЧД), что ухудшало исход и часто приводило к летальному исходу. Это привело к разработке парадигм постепенного сопрея, что еще больше увеличило общую продолжительность охлаждения. Кратковременное охлаждение поддерживает целевую температуру только в течение короткого периода времени и может с меньшей вероятностью привести к отскоку ВЧД. Предыдущая работа, в которой изучалось лечение гипотермии для повышения ВЧД с использованием аналогичного протокола быстрого охлаждения и согревания, как и описанные здесь, не показала отскока повышения ВЧП после повторного сопрея23,24.
Клинические испытания гипотермии для лечения ишемического инсульта не смогли перевести преимущества гипотермии, о которых сообщалось в экспериментальных исследованиях. Несоответствие скорости охлаждения и продолжительности между экспериментальными моделями и пациентами являются важными переменными, которые могут объяснить это несоответствие. Наличие экспериментальной модели гипотермии, которая лучше напоминает клиническую скорость охлаждения, позволит более обоснованно иследованно иследовать преимущества гипотермии в качестве меры лечения пациентов с инсультом.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект финансировался Университетом Ньюкасла, Институтом медицинских исследований Хантера (HMRI), Dalara Early Research Career Researcher Fellowship, NSW Health Early-Mid Career Research Fellowship и National Health and Medical Research Council (NHMRC) Australia.
Materials
| Absolute ethanol | ThermoFisher Scientific/ Ajax Finechem | AJA214-20LPL | Diluted with deionized water to give 70 % ethanol |
| Antiseptic solution (Chlorhexidine) | David Craig | A2957 | |
| Anaesthetic (Marcain) | Aspen | PS13977 | |
| Brushless fan motor | Sirocco | YX2505 | 2 x 12 V/130 mA |
| Heat lamp | Reptile One | AC220 | 240 V 50/60 Hz |
| Heat pad | FHC, Inc | 40-90-2 | |
| Rectal probe | FHC, Inc | 40-90-5D-02 | |
| Temperature controller | FHC, Inc | 40-90-8D | |
| Temperature Datalogger | Maxim | DS1922L-F5 |
References
- Kurisu, K., Yenari, M. A. Therapeutic hypothermia for ischemic stroke; pathophysiology and future promise. Neuropharmacology. 134, 302-309 (2018).
- Polderman, K. H. Induced hypothermia and fever control for prevention and treatment of neurological injuries. Lancet. 371 (9628), 1955-1969 (2008).
- vander Worp, H. B., Sena, E. S., Donnan, G. A., Howells, D. W., Macleod, M. R. Hypothermia in animal models of acute ischaemic stroke: a systematic review and meta-analysis. Brain. 130, 3063-3074 (2007).
- Thomé, C., Schubert, G. A., Schilling, L. Hypothermia as a neuroprotective strategy in subarachnoid hemorrhage: a pathophysiological review focusing on the acute phase. Neurological Research. 27 (3), 229-237 (2005).
- McIntyre, L. A., Fergusson, D. A., Hébert, P. C., Moher, D., Hutchison, J. S. Prolonged therapeutic hypothermia after traumatic brain injury in adults: a systematic review. Journal of the American Medical Association. 289 (22), 2992-2999 (2003).
- Kuczynski, A. M., Demchuk, A. M., Almekhlafi, M. A. Therapeutic hypothermia: Applications in adults with acute ischemic stroke. Brain Circulation. 5 (2), 43-54 (2019).
- Shankaran, S., et al. Whole-body hypothermia for neonates with hypoxic-ischemic encephalopathy. New England Journal of Medicine. 353 (15), 1574-1584 (2005).
- Jacobs, S. E., et al. Whole-body hypothermia for term and near-term newborns with hypoxic-ischemic encephalopathy: a randomized controlled trial. Archives of Pediatrics and Adolescent Medicine. 165 (8), 692-700 (2011).
- Lyden, P., et al. Results of the ICTuS 2 Trial (Intravascular cooling in the treatment of stroke 2). Stroke. 47 (12), 2888-2895 (2016).
- vander Worp, H. B., et al. Therapeutic hypothermia for acute ischaemic stroke. Results of a European multicentre, randomised, phase III clinical trial. European Stroke Journal. 4 (3), 254-262 (2019).
- Wu, T. C., Grotta, J. C. Hypothermia for acute ischaemic stroke. Lancet Neurology. 12 (3), 275-284 (2013).
- Hemmen, T. M., et al. Intravenous thrombolysis plus hypothermia for acute treatment of ischemic stroke (ICTuS-L): final results. Stroke. 41 (10), 2265-2270 (2010).
- Lyden, P., Ernstrom, K., Raman, R. Determinants of pneumonia risk during endovascular hypothermia. Therapeutic Hypothermia and Temperature Management. 3 (1), 24-27 (2013).
- vander Worp, H. B., et al. EuroHYP-1: European multicenter, randomized, phase III clinical trial of therapeutic hypothermia plus best medical treatment vs. best medical treatment alone for acute ischemic stroke. International Journal of Stroke. 9 (5), 642-645 (2014).
- Lamb, J. A., Rajput, P. S., Lyden, P. D. Novel method for inducing rapid, controllable therapeutic hypothermia in rats using a perivascular implanted closed-loop cooling circuit. Journal of Neuroscience Methods. 267, 55-61 (2016).
- Dumitrascu, O. M., Lamb, J., Lyden, P. D. Still cooling after all these years: Meta-analysis od pre-clinical trials of therapeutic hypothermia for acute ischemic stroke. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (7), 1157-1164 (2016).
- Wu, L., et al. Hypothermia neuroprotection against ischemic stroke: The 2019 update. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 40 (3), 461-481 (2020).
- Hemmen, T. M., Lyden, P. D. Hypothermia after acute ischemic stroke. Journal of Neurotrauma. 26 (3), 387-391 (2009).
- Colbourne, F., Sutherland, G. R., Auer, R. N. An automated system for regulating brain temperature in awake and freely moving rodents. Journal of Neuroscience Methods. 67 (2), 185-190 (1996).
- Campbell, K., Meloni, B. P., Zhu, H., Knuckey, N. W. Magnesium treatment and spontaneous mild hypothermia after transient focal cerebral ischemia in the rat. Brain Research Bulletin. 77 (5), 320-322 (2008).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. Journal of Visualized Experiments. (59), e3496 (2012).
- Trotman-Lucas, M., Kelly, M. E., Janus, J., Gibson, C. L. Middle cerebral artery occlusion allowing reperfusion via common carotid artery repair in mice. Journal of Visualized Experiments. (143), e58191 (2019).
- Murtha, L. A., et al. Short-duration hypothermia after ischemic stroke prevents delayed intracranial pressure rise. International Journal of Stroke. 9, 553-559 (2014).
- Murtha, L. A., et al. Intracranial pressure elevation after ischemic stroke in rats: cerebral edema is not the only cause, and short-duration mild hypothermia is a highly effective preventative therapy. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 35 (4), 592-600 (2015).
