Kortdurende hypothermie-inductie bij ratten met behulp van modellen voor studies die klinische relevantie en mechanismen onderzoeken

Alle experimentele procedures waren in overeenstemming met de Australische praktijkcode voor de verzorging en het gebruik van dieren voor wetenschappelijke doeleinden en werden goedgekeurd door de Animal Care and Ethics Committee van de Universiteit van Newcastle (A-2013-343 en A-2020-003). Naast de hieronder beschreven inductiemethoden voor hypothermie, worden de volgende protocollen routinematig uitgevoerd in combinatie met onderkoeling: femorale lijn cannulatie om de bloeddruk en hartslag te controleren21, en experimentele beroerte22. 1. Datalogger implantatie OPMERKING: Het datalogger-apparaat dat in dit protocol wordt gebruikt, was niet in staat om de lichaamstemperatuur in realtime uit te lezen. Uitlezen is mogelijk zodra de datalogger van het dier is verwijderd en weer op de computer is aangesloten. Als gevolg hiervan wordt de rectale temperatuurvoeler gebruikt om realtime informatie te verstrekken tijdens het koel- en opwarmproces. Bovendien is de rectale sonde ook van vitaal belang voor deze methode omdat de chirurgische warmtemat waarop het dier tijdens de procedure wordt geplaatst, wordt gereguleerd door het rectale sondesysteem. De datalogger dient ook een waardevol doel bij het verstrekken van temperatuurgegevens bij vrij bewegende, wakkere ratten en is belangrijk om ervoor te zorgen dat de normale lichaamstemperatuur na het opwarmen wordt gehandhaafd. Daarom zijn beide temperatuurbewakingsapparaten belangrijk voor dit protocol. Verdoof 10-12 weken oude mannelijke gefokte Wistar-rat met isofluraan (5% voor inductie en 2-2,5% voor onderhoud) in een 50% N2- en 50% O2-mengsel. Plaats de rat na inductie in buikligging op een chirurgische warmtemat. Plaats de rat zo dat de neus in de neuskegel zit. Zet de neus vast met chirurgische tape om ervoor te zorgen dat er geen gassen ontsnappen. Scheer de vacht van de rechter onderbuik en injecteer de site subcutaan met een lokaal verdovingsmiddel, Bupivacaïne 0,2 ml, 0,05%. Breng antiseptische oplossing aan op het vers geschoren gebied. Maak met behulp van gesteriliseerde chirurgische hulpmiddelen een longitudinale incisie van 2 cm langs het rechter abdominale gebied, proximaal aan de rechterdij. Maak de incisie diep genoeg om de ruimte bij de ventrale dijbeenplooi bloot te leggen. Gebruik hemostaat en tang om een ‘zak’ onder de huid te creëren die groot genoeg is om het apparaat vast te houden. Plaats het temperatuurbewakingsapparaat in de zak en sluit de spier en huid met behulp van 5-0 zijden hechtingen. De hier beschreven subcutane methode heeft de voorkeur boven de intra-peritoneale methode omdat deze minder invasief is en een beter herstel na de procedure mogelijk maakt. Zorg ervoor dat datalogger en rectale sonde kruisgekalibreerd zijn voor temperatuurbewaking (zie Discussie). Zorg ervoor dat de datalogger na het inbrengen niet tegen de warmtemat van het dier rust, omdat dit de temperatuurmetingen zal beïnvloeden. Figuur 1: Implantatie van dataloggerapparaat. (A) Panelen van links naar rechts tonen een incisie van ongeveer 2 cm aan de rechterkant van de onderbuik van de rat. B)De temperatuurbewakingsdatalogger werd subcutaan in de pocketincisie ingebracht. (C) De incisie werd gesloten met nylon hechtingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 2. Inductie van actieve (snelle) hypothermie voor mechanistische studies Ingesteld voor onderkoeling (zie figuur 2). Plaats twee retort-stands met klemmen aan weerszijden van het lichaam van de rat. Bevestig een ventilator van 60 mm 12 v/130 mA aan elke retortstandaard, zodat de ventilatoren op de onderrug van de rat zijn gericht. De afstand tussen de klem en de rat is ongeveer 20 cm. De gebruikte ventilator moet een toerental van 4.000 tpm hebben. Houd een dierenwarmtelamp klaar aan de zijkant of op een derde retortstandaard. Begin met onderkoeling door de dierlijke warmtemat aan te passen aan de gewenste doeltemperatuur. In dit voorbeeld is 32,5 °C de doeltemperatuur (3,75 op de temperatuurregelaar). Zet beide ventilatoren aan en breng drie tot vier sprays van 70% ethanol (standaard plastic spuitfles) aan op de onderrug van de rat. Ruk dierlijke vacht bij het spuiten voor een snellere afkoelende inductie.OPMERKING: Ethanol wordt gebruikt als een voorkeursoplossing boven water omdat het een snellere verdampingssnelheid heeft en daarom resulteert in een snellere inductie van onderkoeling. Zorg ervoor dat u de vacht niet oververzadigt, omdat dit kan bijdragen aan het overschrijden van de doeltemperatuur.OPMERKING: De ventilatoren versnellen de verdamping van ethanol en het koelproces. Laat korte intervallen tussen ethanoltoepassingen toe terwijl u de rectale temperatuur van de rat goed in de gaten houdt. Stop elke verdere toepassing van ethanol zodra de rectale temperatuur binnen 1 °C van de doeltemperatuur ligt. Schakel beide ventilatoren uit zodra de temperatuur binnen 0,5 °C van de doeltemperatuur is bereikt (33 °C in dit geval).OPMERKING: Het uitschakelen van ventilatoren voordat de doeltemperatuur is bereikt, helpt voorkomen dat de rat boven de vereiste temperatuur overkoelt. Laat de temperatuur dalen tot 32,5 °C. Als er overkoeling optreedt, gebruik dan de warmtelamp van het dier om het dier licht op te warmen naar het doel. De hulp van één ventilator kan worden gebruikt om een opwarmende overshoot te voorkomen. Zodra de doeltemperatuur is bereikt en is gestabiliseerd, blijft u de temperatuur controleren. De temperatuur blijft meestal zeer stabiel voor de rest van de onderkoelingsperiode zonder de noodzaak van sproeien, het gebruik van ventilatoren of het gebruik van een warmtelamp. Om het dier aan het einde van de onderkoeling opnieuw op te warmen, stelt u de temperatuur van de warmtemat terug naar 37 °C (6 op de temperatuurregelaar die in dit voorbeeld wordt gebruikt) en laat u het dier gedurende een periode van 30 minuten thermoreguleren.OPMERKING: Temperatuurinstellingen op temperatuurregelaars kunnen variëren en daarom kan het nodig zijn om instellingen voor doelhypothermie en normothermie op afzonderlijke apparaten te bepalen. 3. Inductie van klinisch haalbare geleidelijk optredende onderkoeling zonder actieve huidkoeling Bereik onderkoeling door de temperatuur van de kerntemperatuur gereguleerde huisotherme warmtemat in kleine stappen te verlagen tot de vereiste doeltemperatuur. In het geïllustreerde voorbeeld (figuur 3B) werd elke 30 minuten een verhoging van 1 °C gebruikt. Koel het dier af tot de doeltemperatuur gedurende de gewenste periode (2 uur in het beschreven voorbeeld). Eenmaal afgekoeld, op het doel houden voor het gewenste interval. Meestal is er geen verdere interventie nodig als ze op de huisotherme warmtemat worden onderhouden die is ingesteld voor de gewenste doeltemperatuur. Er is geen externe koeling nodig met dit protocol, omdat anesthesie de normale regulering van de kerntemperatuur van het lichaam voorkomt.OPMERKING: De isofluraanvereisten nemen af met onderkoeling. Bij de meeste dieren kan een beginnende isofluraanconcentratie van 2% worden verlaagd in stappen van 0,1% elke 20-30 min tot 1,5% om een stabiele ademhalingsfrequentie (>50 ademhalingen / min), hartslag en bloeddruk te behouden en onderdrukking van reflexreacties te behouden. Om het dier na onderkoeling opnieuw te verwarmen, past u de warmtemat aan zodat het dier over het gewenste interval kan opwarmen. In het voorbeeld werd over een periode van 30 minuten een opwarming met een enkele aanpassing tot 37 °C (6 op de FHC-temperatuurregeleenheid die in het voorbeeld wordt gebruikt) bereikt. Voor studies op langere termijn die herstel van dieren vereisen, houdt u dieren in een kooi die half over een warmtemat wordt geplaatst om het dier in staat te stellen te thermoreguleren en om onbedoelde postoperatieve onderkoeling te voorkomen. Rectale paracetamol (250 mg/kg) kan worden toegediend voor herstel en ovrenight pijnverlichting. Subcutane zoutoplossinginjecties (2 x 1,5 ml) kunnen ook worden gegeven om uitdroging door anesthesie en chirurgische ingrepen te voorkomen.