Quantificazione in tempo reale delle specie reattive dell'ossigeno nei neutrofili infettati da Escherichia Coli meningitica
Summary
Escherichia coli è la principale causa di meningite batterica gram-negativa neonatale. Durante l’infezione batterica, le specie reattive di ossigeno prodotte dai neutrofili svolgono un ruolo battericida importante. Qui introduciamo un metodo per rilevare le specie reattive dell’ossigeno nei neutrofili in risposta alla meningite E. coli.
Abstract
L’Escherichia coli (E. coli)è il batterio Gram-negativo più comune che causa meningite neonatale. Il verificarsi di batteriemia e penetrazione batterica attraverso la barriera ematica-encefalica sono passi indispensabili per lo sviluppo della meningite E. coli. Le specie reattive dell’ossigeno (ROS) rappresentano i principali meccanismi battericidi dei neutrofili per distruggere gli agenti patogeni invasi. In questo protocollo, la produzione di ROS intracellulare dipendente dal tempo nei neutrofili infetti da meningite E. coli è stata quantificata utilizzando sonde ROS fluorescenti rilevate da un lettore di micropiacche a fluorescenza in tempo reale. Questo metodo può anche essere applicato alla valutazione della produzione di ROS nelle cellule di mammifero durante le interazioni patogeno-ospite.
Introduction
La meningite batterica neonatale è una malattia infettiva pediatrica comune. L’Escherichia coli (E. coli) con una capsula K1 è il più comune agente patogeno Gram-negativo che causa meningite batterica neonatale, rappresentando circa l’80% dell’incidenzatotale 1,2,3. Nonostante i progressi nella chemioterapia antimicrobica e nelle cure di supporto, la meningite batterica è ancora una delle condizioni più devastanti con elevata morbilità e mortalità4.
Il verificarsi di meningite batterica neonatale di solito inizia con la batteriemia causata dall’ingresso di batteri patogeni nella circolazione periferica dalle lesioni locali dei neonati, seguita dalla penetrazione attraverso la barriera ematico-encefalica (BBB) nel cervello, con conseguente infiammazione delle meningi4. L’insorgenza della bacteremia dipende dall’interazione tra batteri e cellule immunitarie ospiti tra cui neutrofili e macrofagi, ecc. I neutrofili, che rappresentano ~ 50-70% dei globuli bianchi, sono la prima linea di difesa contro le infezionibatteriche 5,6. Durante l’invasione dei batteri, i neutrofili attivati vengono reclutati nei siti infettivi e rilasciano specie reattive dell’ossigeno (ROS) tra cui l’anione superossido, il perossido di idrogeno, i radicali idrossili e l’ossigeno singlet7. Il ROS subisce reazioni redox con la membrana cellulare, molecole di acido nucleico e proteine dei batteri, con conseguente lesione e morte del batterio invasore8. I mitocondri sono il principale sito di produzione di ROS nelle cellule eucariotiche e varie ossidasi (ad esempio, nicotinammide adenina dinucleotide fosfato (NADPH) complesso ossidasi, sistema lipossigenasi, protein chinasi C e sistema cicloossigenasi) mediano la produzione di ROS9,10. La misurazione in tempo reale della produzione di ROS, che rappresenta il meccanismo antimicrobico primario nei neutrofili, è un metodo utile per studiare la difesa dell’ospite durante l’interazione batteri-ospite.
In questo protocollo, la produzione di ROS dipendente dal tempo nei neutrofili infetti da meningite E. coli è stata quantificata con una sonda FLUORESCENTE ROS DHE, rilevata da un lettore di micropiacche a fluorescenza in tempo reale. Questo metodo può anche essere applicato alla valutazione della produzione di ROS in altre cellule di mammiferi durante l’interazione agente patogeno-ospite.
Protocol
Representative Results
Discussion
I neutrofili agiscono come il componente più abbondante dei globuli bianchi nella circolazione sanguigna umana. Sono importanti cellule effettori nel sistema immunitario umano innato, che costruisce la prima linea di difesa contro l’invasione di agenti patogeni11. La generazione di ROS rappresenta uno dei principali meccanismi battericidi dei neutrofili dopo la fagocitosi11. Recenti studi hanno dimostrato che una struttura simile a una rete rilasciata da un neutrofilo chia…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla National Natural Science Foundation of China (31670845, 31870832, 32000811) e dal Programma di Distinguished Professor della provincia di Liaoning (LJH2018-35).
Materials
| 15 mL polypropylene conical centrifuge tubes | KIRGEN | KG2611 | |
| 96-well plate | Corning | 3025 | |
| Agar | DINGGUO | DH010-1.1 | |
| Autuomated cell counter | Bio-rad | 508BR03397 | |
| Biological Safety Carbinet | Shanghai Lishen | Hfsafe-1200Lcb2 | |
| Brain heart infusion | BD | 237500 | |
| CD16 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-701 | |
| Centrifuge | Changsha Xiangyi | TDZ5-WS | |
| Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Dihydroethidium (DHE) | MedChemExpress | 104821-25-2 | |
| Fetal bovine serum | Cellmax | SA211.02 | |
| Incubator | Heraeus | Hera Cell | |
| MACS separation buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Beyoitme | S1819-1mg | |
| QuadroMACS separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Rifampicin | Solarbio | 13292-46-1 | |
| RPMI1640 medium | Sangon Biotech | E600027-0500 | |
| Thermostatic shaker | Shanghai Zhicheng | ZWY-100D | |
| Trypton | OXOID | LP0042 | |
| Yeast extract | OXOID | LP0021 |
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