Real-time kwantificering van reactieve zuurstofsoorten bij neutrofielen besmet met meningitische Escherichia Coli
Summary
Escherichia coli is de belangrijkste oorzaak van neonatale gramnegatieve bacteriële meningitis. Tijdens de bacteriële infectie spelen reactieve zuurstofsoorten geproduceerd door neutrofielen een belangrijke bacteriedodende rol. Hier introduceren we een methode om de reactieve zuurstofsoorten bij neutrofielen te detecteren als reactie op meningitis E. coli.
Abstract
Escherichia coli (E. coli) is de meest voorkomende Gram-negatieve bacterie die neonatale meningitis veroorzaakt. Het optreden van bacteriëmie en bacteriële penetratie door de bloed – hersenbarrière zijn onmisbare stappen voor de ontwikkeling van E. coli meningitis. Reactieve zuurstofsoorten (ROS) vertegenwoordigen de belangrijkste bacteriedodende mechanismen van neutrofielen om de binnengevallen pathogenen te vernietigen. In dit protocol werd de tijdsafhankelijke intracellulaire ROS-productie bij neutrofielen die besmet zijn met meningitische E. coli gekwantificeerd met behulp van fluorescerende ROS-sondes die werden gedetecteerd door een real-time fluorescentiemicroplaatlezer. Deze methode kan ook worden toegepast bij de beoordeling van de ROS-productie in zoogdiercellen tijdens interacties tussen pathogene gastheer en gastheer.
Introduction
Neonatale bacteriële meningitis is een veel voorkomende pediatrische infectieziekte. Escherichia coli (E. coli) met een K1 capsule is de meest voorkomende Gram-negatieve ziekteverwekker die neonatale bacteriële meningitis veroorzaakt, goed voor ongeveer 80% van de totale incidentie1,2,3. Ondanks de vooruitgang in de antimicrobiële chemotherapie en ondersteunende zorg, is bacteriële meningitis nog steeds een van de meest verwoestende aandoeningen met hoge morbiditeit enmortaliteit 4.
Het optreden van neonatale bacteriële meningitis begint meestal met bacteriëmie veroorzaakt door het binnendringen van pathogene bacteriën in de perifere circulatie van de lokale laesies van de pasgeborenen, gevolgd door penetratie door de bloed – hersenbarrière (BBB) in de hersenen, wat resulteert in de ontsteking van de hersenvliezen4. Het begin van bacteriëmie hangt af van de interactie tussen bacteriën en gastheerimmuuncellen, waaronder neutrofielen en macrofagen, enz. Neutrofielen, die goed zijn voor ~ 50-70% van de witte bloedcellen, zijn de eerste verdedigingslinie tegen bacteriële infecties5,6. Tijdens de invasie van bacteriën worden de geactiveerde neutrofielen gerekruteerd naar de besmettelijke locaties en geven reactieve zuurstofsoorten (ROS) vrij, waaronder het superoxide anion, waterstofperoxide, hydroxylradicalen en singlet zuurstof7. Ros ondergaat redoxreacties met het celmembraan, nucleïnezuurmoleculen en proteïnen van de bacteriën, resulterend in het letsel en de dood van de binnenvallende bacteriën8. De mitochondriën is de belangrijkste plaats van ROS-productie in eukaryotische cellen, en verschillende oxidasen (bijv. nicotinamide adenine dinucleotidefosfaat (NADPH) oxidasecomplex, lipoxygenasesysteem, eiwitkinase C en cyclooxygenasesysteem) bemiddelen de productie van ROS9,10. De real-time meting van de productie van ROS, die het primaire antimicrobiële mechanisme bij neutrofielen vertegenwoordigt, is een nuttige methode voor het bestuderen van gastheerverdediging tijdens de interactie tussen bacteriën en gastheer.
In dit protocol werd de tijdsafhankelijke ROS-productie bij neutrofielen die besmet zijn met meningitische E. coli gekwantificeerd met een fluorescerende ROS-sonde DHE, gedetecteerd door een real-time fluorescentiemicroplaatlezer. Deze methode kan ook worden toegepast bij de beoordeling van de ROS-productie in andere zoogdiercellen tijdens de interactie tussen ziekteverwekker en gastheer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neutrofielen fungeren als de meest voorkomende component van witte bloedcellen in de menselijke bloedsomloop. Het zijn belangrijke effectorcellen in het aangeboren menselijke immuunsysteem, dat de eerste verdedigingslinie bouwt tegen de invasie van ziekteverwekkers11. De generatie van ROS vertegenwoordigt een van de belangrijkste bacteriedodende mechanismen van neutrofielen na fagocytose11. Recente studies hebben aangetoond dat een netachtige structuur die vrijkomt door een…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (31670845, 31870832, 32000811) en het Program of Distinguished Professor of Liaoning Province (LJH2018-35).
Materials
| 15 mL polypropylene conical centrifuge tubes | KIRGEN | KG2611 | |
| 96-well plate | Corning | 3025 | |
| Agar | DINGGUO | DH010-1.1 | |
| Autuomated cell counter | Bio-rad | 508BR03397 | |
| Biological Safety Carbinet | Shanghai Lishen | Hfsafe-1200Lcb2 | |
| Brain heart infusion | BD | 237500 | |
| CD16 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-701 | |
| Centrifuge | Changsha Xiangyi | TDZ5-WS | |
| Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Dihydroethidium (DHE) | MedChemExpress | 104821-25-2 | |
| Fetal bovine serum | Cellmax | SA211.02 | |
| Incubator | Heraeus | Hera Cell | |
| MACS separation buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Beyoitme | S1819-1mg | |
| QuadroMACS separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Rifampicin | Solarbio | 13292-46-1 | |
| RPMI1640 medium | Sangon Biotech | E600027-0500 | |
| Thermostatic shaker | Shanghai Zhicheng | ZWY-100D | |
| Trypton | OXOID | LP0042 | |
| Yeast extract | OXOID | LP0021 |
References
- Kim, K. S. Acute bacterial meningitis in infants and children. Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11 (2010).
- Woll, C., et al. Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants </=60 Days Old Treated in Emergency Departments. Journal of Pediatrics. 200, 210-217 (2018).
- Xu, M., et al. Etiology and Clinical Features of Full-Term Neonatal Bacterial Meningitis: A Multicenter Retrospective Cohort Study. Frontiers in Pediatrics. 7, 31 (2019).
- Kim, K. S. Human Meningitis-Associated Escherichia coli. EcoSal Plus. 7 (1), (2016).
- Rosales, C. Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity. Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 377-396 (2020).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews: Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Witko-Sarsat, V., Descamps-Latscha, B., Lesavre, P., Halbwachs-Mecarelli, L. Neutrophils: Molecules, Functions and Pathophysiological Aspects. Laboratory Investigation. 80 (5), 617-653 (2000).
- Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
- Zeng, M. Y., Miralda, I., Armstrong, C. L., Uriarte, S. M., Bagaitkar, J. The roles of NADPH oxidase in modulating neutrophil effector responses. Molecular Oral Microbiology. 34 (2), 27-38 (2019).
- Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil’s Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303 (5), 1532-1535 (2004).
- Lam, G. Y., Huang, J., Brumell, J. H. The many roles of NOX2 NADPH oxidase-derived ROS in immunity. Seminars in Immunopathology. 32 (4), 415-430 (2010).
- Panday, A., Sahoo, M. K., Osorio, D., Batra, S. NADPH oxidases: an overview from structure to innate immunity-associated pathologies. Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 5-23 (2015).
- Nunes, P., Demaurex, N., Dinaue, C. Regulation of the NADPH Oxidase and Associated Ion Fluxes During Phagocytosis. Traffic. 14, 1118-1131 (2013).
- Dahlgren, C., Karlsson, A., Bylund, J. Intracellular Neutrophil Oxidants: From Laboratory Curiosity to Clinical Reality. Journal of Immunology. 202 (11), 3127-3134 (2019).
- Stoiber, W., Obermayer, A., Steinbacher, P., Krautgartner, W. D. The Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in the Formation of Extracellular Traps (ETs) in Humans. Biomolecules. 5 (2), 702-723 (2015).
- Haynes, A. P., Fletcher, J. neutrophil function test. Clinical Haematology. 3 (4), 871-887 (1990).
- Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection. Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).
- Siano, B., Oh, H., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
- Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Puleston, D. Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).
