Küçük Moleküllerin Mikrokristal Elektron Kırınımı
Summary
Burada, mikrokristal elektron kırınımı (MicroED) deneyleri için küçük moleküllü kristallerin tozlarının hazırlanması için laboratuvarımızda geliştirilen prosedürleri açıklıyoruz.
Abstract
Mikrokristal elektron kırınımı (MicroED) deneyleri için küçük molekül örnekleri hazırlamak için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. MicroED, standart elektron kriyo-mikroskopi (cryo-EM) ekipmanı kullanılarak proteinlerin ve küçük moleküllerin yapılarını çözmek için geliştirilmiştir. Bu şekilde, küçük moleküller, peptitler, çözünür proteinler ve membran proteinleri son zamanlarda yüksek çözünürlüklerde belirlenmiştir. Örnek olarak karbamazepin ilacını kullanarak küçük moleküllü farmasötiklerin ızgaralarını hazırlamak için protokoller burada sunulmuştur. Verilerin taranması ve toplanmasına yönelik protokoller sunulmaktadır. Veri entegrasyonu, yapı belirleme ve iyileştirme gibi genel süreçteki ek adımlar başka yerlerde sunulmaktadır. Küçük moleküllü ızgaraları hazırlamak için gereken sürenin 30 dakikadan az olduğu tahmin edilmektedir.
Introduction
Mikrokristal elektron kırınımı (MicroED), mikrometre altı boyutlu kristallerdenatomik çözünürlük yapılarını belirlemek için kullanılan bir elektron kriyo-mikroskopi (cryo-EM) yöntemidir 1,2. Kristaller standart transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ızgaralarına uygulanır ve sıvı etan veya sıvı azota daldırılarak dondurulur. Izgaralar daha sonra kriyojenik sıcaklıklarda çalışan bir TEM’e yüklenir. Kristaller ızgarada bulunur ve ilk kırınım kalitesi için taranır. Sürekli rotasyon MicroED verileri, verilerin film olarak hızlı bir kamera kullanılarak kaydedildiği taranmış kristallerin bir alt kümesinden toplanır3. Bu filmler standart bir kristalografik formata dönüştürülür ve bir X-ışını kristalografi deneyi4 ile neredeyse aynı şekilde işlenir.
MicroED başlangıçta protein mikrokristalleri 1,2’yi araştırmak için geliştirilmiştir. Protein kristalografisindeki bir darboğaz, geleneksel senkrotron X-ışını kırınım deneyleri için büyük, iyi düzenlenmiş kristaller büyüyor. Elektronlar, X-ışınlarından daha güçlü olan madde büyüklük sıralarıyla etkileşime girdiğinden, tespit edilebilir kırınım üretmek için gereken kristal boyutunun sınırlamaları oldukça küçüktür5. Ek olarak, elastik ve elastik olmayan saçılma olaylarının oranı elektronlar için daha elverişlidir, bu da daha küçük bir genel maruz kalma ile daha yararlı verilerin toplanabileceğini düşündürmektedir5. Sürekli gelişmeler, MicroED verilerinin en zorlu mikrokristallerdentoplanmasına izin vermiştir 6,7,8,9.
Son zamanlarda, MicroED’nin görünüşte amorf malzemelerden küçük moleküllü farmasötiklerin yapılarını belirlemek için güçlü bir araç olduğu gösterilmiştir10,11,12,13. Bu tozlar doğrudan bir şişe satın alınan reaktiften, bir saflaştırma kolonundan veya hatta bir hapı ince bir toz haline getirmekten gelebilir10. Bu tozlar gözle amorf görünür, ancak ya tamamen nanokristallerden oluşabilir ya da sadece kristalin olmayan, amorf fraksiyonda eser miktarda nanokristalin birikintileri içerebilir. Malzemenin ızgaraya uygulanması kolaydır ve kristal tanımlama, tarama ve veri toplamanın sonraki adımları yakın gelecekte otomatikleştirilebilir14. Diğerleri numune hazırlama ve veri toplama için farklı yöntemler kullanabilirken, burada MicroED için küçük moleküllerin örneklerinin hazırlanması ve veri toplanması için Gönen laboratuvarında geliştirilen ve kullanılan protokoller detaylandırılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Numune hazırlama tipik olarak, tarama ve veri toplama oturumlarından sonra optimizasyonların yapıldığı yinelemeli bir işlemdir. Küçük moleküllü numuneler için, birçok farmasötik hidrofobik olma eğiliminde olduğundan, ızgaraları kızdırmadan ilk önce ızgara hazırlamayı denemek genellikle ihtiyatlıdır10,11. Izgaralarda çok az nanokristal birikintisi varsa, ızgaraları ilk kez kızdırdıktan sonra tekrar denemek iyi bir fikirdir. Liyofi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gonen laboratuvarı, Howard Hughes Tıp Enstitüsü’nün fonlarıyla desteklenmektedir. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri P41GM136508 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 0.1-1.5mL Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | Any vial or tube will do. |
| Autogrid clips | Thermo-Fisher | 1036173 | Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system. |
| Autogrid C-rings | Thermo-Fisher | 1036171 | |
| Carbamazapine | Sigma | C4024-1G | Any amount will suffice for these experiments |
| CMOS based detector | Thermo-Fisher | CetaD 16M | We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable. |
| Delphi software | Thermo-Fisher | N/A | Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage |
| EPU-D software | Thermo-Fisher | N/A | Commercial software for the acquisition of MicroED data |
| Glass cover slides | Hampton | HR3-231 | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| High PrecisionTweezers | EMS | 78325-AC | Any high precision tweezer will do |
| Liquid nitrogen vessel | Spear Lab | FD-800 | A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen – 800mL |
| SerialEM software | UC Boulder | N/A | Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology |
| TEM grids | Quantifoil/EMS | Q310CMA | Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon. |
| transmission electron microscope (TEM) | Thermo-Fisher | Talos Arctica | |
| Whatman circular filter paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | 90mm or larger |
References
- Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, 01345 (2013).
- Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED. Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).
- Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. MicroED with the Falcon III direct electron detector. IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).
- Hattne, J., et al. MicroED data collection and processing. Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).
- Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
- Martynowycz, M. W., et al. MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP. BioRxiv. , 316109 (2020).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Martynowycz, M. W., Gonen, T. Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking. Structure. , (2020).
- Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).
- Jones, C. G., et al. The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination. ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).
- Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation. Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).
- Gallagher-Jones, M., et al. Sub-ångström cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).
- Ting, C. P., et al. Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products. Science. 365 (6450), 280-284 (2019).
- de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. MicroED data collection with SerialEM. Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
- Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
- Winter, G., et al. DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).
- de la Cruz, M. J., et al. Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED. Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).
- Shi, D., et al. The collection of MicroED data for macromolecular crystallography. Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).
- Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. Structure of catalase determined by MicroED. eLife. 3, 03600 (2014).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED. Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).
