Микрокристаллическая дифракция электронов малых молекул
Summary
Здесь мы описываем разработанные в нашей лаборатории процедуры получения порошков низкомолекулярных кристаллов для экспериментов по дифракции электронов микрокристаллов (MicroED).
Abstract
Описан подробный протокол подготовки образцов малых молекул для экспериментов по дифракции электронов микрокристаллов (MicroED). MicroED был разработан для решения структур белков и малых молекул с использованием стандартного оборудования электронной криомикроскопии (крио-ЭМ). Таким образом, небольшие молекулы, пептиды, растворимые белки и мембранные белки недавно были определены с высоким разрешением. Представлены протоколы подготовки сеток низкомолекулярных лекарственных препаратов на примере препарата карбамазепин. Представлены протоколы скрининга и сбора данных. Дополнительные этапы общего процесса, такие как интеграция данных, определение структуры и уточнение, представлены в другом разделе. Время, необходимое для подготовки низкомолекулярных сеток, оценивается менее чем в 30 минут.
Introduction
Микрокристаллическая дифракция электронов (MicroED) – это метод электронной криомикроскопии (крио-ЭМ) для определения структур атомного разрешения из кристаллов субмикрометрового размера 1,2. Кристаллы наносятся на сетки стандартного просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ) и замораживаются путем погружения в жидкий этан или жидкий азот. Затем решетки загружаются в ПЭМ, работающую при криогенных температурах. Кристаллы располагаются на сетке и экранируются на начальное дифракционное качество. Данные MicroED непрерывного вращения собираются из подмножества экранированных кристаллов, где данные сохраняются с помощью быстрой камеры в виде видеоролика3. Эти фильмы преобразуются в стандартный кристаллографический формат и обрабатываются почти так же, как эксперимент по рентгеновской кристаллографии4.
MicroED был первоначально разработан для исследования белковых микрокристаллов 1,2. Узким местом в кристаллографии белков является выращивание больших, хорошо упорядоченных кристаллов для традиционных экспериментов по синхротронной рентгеновской дифракции. Поскольку электроны взаимодействуют с веществом на порядки сильнее, чем рентгеновские лучи, ограничения размера кристалла, необходимого для получения обнаруживаемой дифракции, значительно меньше5. Кроме того, соотношение событий упругого и неупругого рассеяния более благоприятно для электронов, что позволяет предположить, что при меньшем общем воздействии можно собрать больше полезных данных5. Постоянные разработки позволили собирать данные MicroED из самых сложных микрокристаллов 6,7,8,9.
Недавно было показано, что MicroED является мощным инструментом для определения структур низкомолекулярных фармацевтических препаратов из явно аморфных материалов10,11,12,13. Эти порошки могут поступать прямо из бутылки с покупным реагентом, очистительной колонки или даже из измельчения таблетки в мелкий порошок10. Эти порошки кажутся аморфными на глаз, но могут либо полностью состоять из нанокристаллов, либо просто содержать следовые количества нанокристаллических отложений в большей некристаллической, аморфной фракции. Нанесение материала на сетку является простым, и последующие этапы идентификации кристаллов, скрининга и сбора данных могут быть даже автоматизированы в ближайшем будущем14. В то время как другие могут использовать другие методы для подготовки образцов и сбора данных, здесь подробно описаны протоколы, разработанные и используемые в лаборатории Гонена для подготовки образцов малых молекул для MicroED и для сбора данных.
Protocol
Representative Results
Discussion
Пробоподготовка обычно представляет собой итеративный процесс, при котором оптимизация производится после сеансов скрининга и сбора данных. Для низкомолекулярных образцов часто целесообразно сначала попытаться получить решетку без тлеющей разрядки решеток, поскольку многие фармац…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Лаборатория Гонена поддерживается средствами Медицинского института Говарда Хьюза. Это исследование было поддержано Национальным институтом здравоохранения P41GM136508.
Materials
| 0.1-1.5mL Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | Any vial or tube will do. |
| Autogrid clips | Thermo-Fisher | 1036173 | Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system. |
| Autogrid C-rings | Thermo-Fisher | 1036171 | |
| Carbamazapine | Sigma | C4024-1G | Any amount will suffice for these experiments |
| CMOS based detector | Thermo-Fisher | CetaD 16M | We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable. |
| Delphi software | Thermo-Fisher | N/A | Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage |
| EPU-D software | Thermo-Fisher | N/A | Commercial software for the acquisition of MicroED data |
| Glass cover slides | Hampton | HR3-231 | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| High PrecisionTweezers | EMS | 78325-AC | Any high precision tweezer will do |
| Liquid nitrogen vessel | Spear Lab | FD-800 | A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen – 800mL |
| SerialEM software | UC Boulder | N/A | Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology |
| TEM grids | Quantifoil/EMS | Q310CMA | Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon. |
| transmission electron microscope (TEM) | Thermo-Fisher | Talos Arctica | |
| Whatman circular filter paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | 90mm or larger |
References
- Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, 01345 (2013).
- Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED. Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).
- Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. MicroED with the Falcon III direct electron detector. IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).
- Hattne, J., et al. MicroED data collection and processing. Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).
- Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
- Martynowycz, M. W., et al. MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP. BioRxiv. , 316109 (2020).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Martynowycz, M. W., Gonen, T. Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking. Structure. , (2020).
- Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).
- Jones, C. G., et al. The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination. ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).
- Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation. Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).
- Gallagher-Jones, M., et al. Sub-ångström cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).
- Ting, C. P., et al. Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products. Science. 365 (6450), 280-284 (2019).
- de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. MicroED data collection with SerialEM. Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
- Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
- Winter, G., et al. DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).
- de la Cruz, M. J., et al. Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED. Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).
- Shi, D., et al. The collection of MicroED data for macromolecular crystallography. Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).
- Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. Structure of catalase determined by MicroED. eLife. 3, 03600 (2014).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED. Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).
