低分子の微小結晶電子回折
Summary
ここでは、微結晶電子回折(MicroED)実験用の低分子結晶粉末を調製するために私たちの研究室で開発された手順について説明します。
Abstract
微結晶電子回折(MicroED)実験用の低分子サンプルを調製するための詳細なプロトコルについて説明します。MicroEDは、標準的なクライオ電子顕微鏡(クライオEM)装置を用いてタンパク質や低分子の構造を解明するために開発されました。このようにして、低分子、ペプチド、可溶性タンパク質、および膜タンパク質が最近高解像度に決定されている。例として薬物カルバマゼピンを使用して低分子医薬品のグリッドを調製するためのプロトコルがここに提示される。データのスクリーニングと収集のためのプロトコルが提示されます。データ統合、構造決定、改良など、プロセス全体の追加ステップは、他の場所で紹介されています。低分子グリッドの調製に要する時間は30分未満と推定される。
Introduction
微結晶電子回折(MicroED)は、サブマイクロメートルサイズの結晶から原子分解能構造を決定するためのクライオ電子顕微鏡(クライオEM)法です1,2。結晶は標準的な透過型電子顕微鏡(TEM)グリッドに適用され、液体エタンまたは液体窒素に突入することによって凍結されます。次に、グリッドは極低温で動作するTEMにロードされます。結晶はグリッド上に配置され、初期回折品質についてスクリーニングされます。連続回転マイクロEDデータは、スクリーニングされた結晶のサブセットから収集され、そこでデータは高速カメラを使用してムービー3として保存されます。これらの動画は、標準的な結晶学フォーマットに変換され、X線結晶学実験4とほぼ同じように処理されます。
MicroEDはもともとタンパク質の微結晶を調べるために開発されました1,2。タンパク質結晶構造解析のボトルネックは、従来のシンクロトロンX線回折実験のために大きく整然とした結晶を成長させることです。電子はX線よりも桁違いに強い物質と相互作用するため、検出可能な回折を生成するために必要な結晶サイズの限界はかなり小さくなります5。さらに、弾性散乱イベントと非弾性散乱イベントの比率は電子にとってより有利であり、より小さな全体的な曝露でより有用なデータを収集できることを示唆しています5。絶え間ない開発により、最も困難な微結晶からMicroEDデータを収集できるようになりました6、7、8、9。
最近、MicroEDは、明らかに非晶質材料から低分子医薬品の構造を決定するための強力なツールであることが示されている10、11、12、13。これらの粉末は、購入した試薬のボトル、精製カラムから直接、または錠剤を微粉末に粉砕することからでも得る10。これらの粉末は、目で見るとアモルファスに見えるが、完全にナノ結晶で構成されているか、または単により大きな非結晶性のアモルファス画分に微量のナノ結晶堆積物を含むことができる。グリッドへの材料の塗布は容易であり、結晶の同定、スクリーニング、およびデータ収集の後続のステップは、近い将来自動化される可能性さえあります14。他の人はサンプル調製とデータ収集に異なる方法を使用するかもしれませんが、ここでは、MicroED用の低分子のサンプルを調製し、データ収集するためにGonenラボで開発および使用されているプロトコルが詳しく説明されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
サンプル調製は通常反復的なプロセスであり、スクリーニングとデータ収集のセッションの後に最適化が行われます。低分子サンプルの場合、多くの医薬品は疎水性である傾向があるため、グリッドをグロー放電せずに最初にグリッド調製を試みることが賢明であることがよくあります10,11。グリッドのナノ結晶堆積物が少なすぎる場合は、最初に…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ゴネンラボは、ハワードヒューズ医学研究所からの資金によってサポートされています。この研究は、国立衛生研究所P41GM136508によってサポートされました。
Materials
| 0.1-1.5mL Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | Any vial or tube will do. |
| Autogrid clips | Thermo-Fisher | 1036173 | Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system. |
| Autogrid C-rings | Thermo-Fisher | 1036171 | |
| Carbamazapine | Sigma | C4024-1G | Any amount will suffice for these experiments |
| CMOS based detector | Thermo-Fisher | CetaD 16M | We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable. |
| Delphi software | Thermo-Fisher | N/A | Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage |
| EPU-D software | Thermo-Fisher | N/A | Commercial software for the acquisition of MicroED data |
| Glass cover slides | Hampton | HR3-231 | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| High PrecisionTweezers | EMS | 78325-AC | Any high precision tweezer will do |
| Liquid nitrogen vessel | Spear Lab | FD-800 | A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen – 800mL |
| SerialEM software | UC Boulder | N/A | Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology |
| TEM grids | Quantifoil/EMS | Q310CMA | Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon. |
| transmission electron microscope (TEM) | Thermo-Fisher | Talos Arctica | |
| Whatman circular filter paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | 90mm or larger |
References
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