Diffrazione elettronica microcristallina di piccole molecole
Summary
Qui, descriviamo le procedure sviluppate nel nostro laboratorio per la preparazione di polveri di cristalli di piccole molecole per esperimenti di diffrazione elettronica microcristallina (MicroED).
Abstract
Viene descritto un protocollo dettagliato per la preparazione di campioni di piccole molecole per esperimenti di diffrazione elettronica microcristallina (MicroED). MicroED è stato sviluppato per risolvere strutture di proteine e piccole molecole utilizzando apparecchiature standard di criomicroscopia elettronica (crio-EM). In questo modo, piccole molecole, peptidi, proteine solubili e proteine di membrana sono state recentemente determinate ad alte risoluzioni. I protocolli sono presentati qui per la preparazione di griglie di farmaci a piccole molecole usando il farmaco carbamazepina come esempio. Vengono presentati protocolli per lo screening e la raccolta dei dati. Ulteriori passaggi nel processo complessivo, come l’integrazione dei dati, la determinazione della struttura e il perfezionamento, sono presentati altrove. Il tempo necessario per preparare le griglie di piccole molecole è stimato in meno di 30 minuti.
Introduction
La diffrazione elettronica a microcristalli (MicroED) è un metodo di criomicroscopia elettronica (cryo-EM) per determinare strutture di risoluzione atomica da cristalli di dimensioni sub-micrometriche 1,2. I cristalli vengono applicati alle griglie standard del microscopio elettronico a trasmissione (TEM) e congelati immergendosi nell’etano liquido o nell’azoto liquido. Le griglie vengono quindi caricate in un TEM che opera a temperature criogeniche. I cristalli si trovano sulla griglia e vengono schermati per la qualità iniziale della diffrazione. I dati MicroED a rotazione continua vengono raccolti da un sottoinsieme dei cristalli schermati, dove i dati vengono salvati utilizzando una fotocamera veloce come un filmato3. Questi filmati vengono convertiti in un formato cristallografico standard ed elaborati in modo quasi identico come un esperimento di cristallografia a raggi X4.
MicroED è stato originariamente sviluppato per studiare i microcristalli proteici 1,2. Un collo di bottiglia nella cristallografia delle proteine sta crescendo cristalli grandi e ben ordinati per i tradizionali esperimenti di diffrazione dei raggi X di sincrotrone. Poiché gli elettroni interagiscono con la materia ordini di grandezza più forte dei raggi X, i limiti della dimensione del cristallo necessari per produrre la diffrazione rilevabile sono considerevolmente più piccoli5. Inoltre, il rapporto tra eventi di scattering elastici e anelastici è più favorevole per gli elettroni, suggerendo che dati più utili possono essere raccolti con un’esposizione complessiva inferiore5. I costanti sviluppi hanno permesso di raccogliere dati MicroED dai microcristalli più impegnativi 6,7,8,9.
Recentemente, MicroED ha dimostrato di essere un potente strumento per determinare le strutture di farmaci a piccole molecole da materiali apparentemente amorfi10,11,12,13. Queste polveri possono provenire direttamente da una bottiglia di reagente acquistato, da una colonna di purificazione o anche dalla frantumazione di una pillola in una polvere fine10. Queste polveri appaiono amorfe ad occhio, ma possono essere interamente composte da nanocristalli o semplicemente contenere tracce di depositi nanocristallini in una maggiore frazione amorfa non cristallina. L’applicazione del materiale alla griglia è facile e le fasi successive di identificazione dei cristalli, screening e raccolta dei dati potrebbero anche essere automatizzate nel prossimo futuro14. Mentre altri possono utilizzare metodi diversi per la preparazione dei campioni e la raccolta dei dati, qui sono dettagliati i protocolli sviluppati e utilizzati nel laboratorio Gonen per la preparazione di campioni di piccole molecole per MicroED e per la raccolta dei dati.
Protocol
Representative Results
Discussion
La preparazione dei campioni è in genere un processo iterativo, in cui le ottimizzazioni vengono effettuate dopo sessioni di screening e raccolta dati. Per i campioni di piccole molecole, è spesso prudente tentare prima la preparazione della griglia senza scaricare le griglie, poiché molti farmaci tendono ad essere idrofobici10,11. Se le griglie hanno troppo pochi depositi nanocristallini, è una buona idea riprovare dopo aver scaricato le griglie. Può darsi …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il laboratorio Gonen è supportato da fondi dell’Howard Hughes Medical Institute. Questo studio è stato supportato dal National Institutes of Health P41GM136508.
Materials
| 0.1-1.5mL Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | Any vial or tube will do. |
| Autogrid clips | Thermo-Fisher | 1036173 | Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system. |
| Autogrid C-rings | Thermo-Fisher | 1036171 | |
| Carbamazapine | Sigma | C4024-1G | Any amount will suffice for these experiments |
| CMOS based detector | Thermo-Fisher | CetaD 16M | We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable. |
| Delphi software | Thermo-Fisher | N/A | Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage |
| EPU-D software | Thermo-Fisher | N/A | Commercial software for the acquisition of MicroED data |
| Glass cover slides | Hampton | HR3-231 | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| High PrecisionTweezers | EMS | 78325-AC | Any high precision tweezer will do |
| Liquid nitrogen vessel | Spear Lab | FD-800 | A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen – 800mL |
| SerialEM software | UC Boulder | N/A | Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology |
| TEM grids | Quantifoil/EMS | Q310CMA | Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon. |
| transmission electron microscope (TEM) | Thermo-Fisher | Talos Arctica | |
| Whatman circular filter paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | 90mm or larger |
References
- Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, 01345 (2013).
- Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED. Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).
- Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. MicroED with the Falcon III direct electron detector. IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).
- Hattne, J., et al. MicroED data collection and processing. Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).
- Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
- Martynowycz, M. W., et al. MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP. BioRxiv. , 316109 (2020).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Martynowycz, M. W., Gonen, T. Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking. Structure. , (2020).
- Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).
- Jones, C. G., et al. The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination. ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).
- Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation. Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).
- Gallagher-Jones, M., et al. Sub-ångström cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).
- Ting, C. P., et al. Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products. Science. 365 (6450), 280-284 (2019).
- de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. MicroED data collection with SerialEM. Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
- Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
- Winter, G., et al. DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).
- de la Cruz, M. J., et al. Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED. Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).
- Shi, D., et al. The collection of MicroED data for macromolecular crystallography. Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).
- Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. Structure of catalase determined by MicroED. eLife. 3, 03600 (2014).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED. Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).
