Mikrokristall-Elektronenbeugung kleiner Moleküle

Die Mikrokristall-Elektronenbeugung (MicroED) ist eine elektronenkryomikroskopische Methode (Kryo-EM) zur Bestimmung von Strukturen mit atomarer Auflösung aus Kristallen im Submikrometerbereich ^1,2. Kristalle werden auf Standardgitter des Transmissionselektronenmikroskops (TEM) aufgebracht und eingefroren, indem sie entweder in flüssiges Ethan oder flüssigen Stickstoff getaucht werden. Die Gitter werden dann in ein TEM geladen, das bei kryogenen Temperaturen arbeitet. Die Kristalle befinden sich auf dem Gitter und werden auf die anfängliche Beugungsqualität geprüft. Kontinuierliche Rotation MicroED-Daten werden von einer Teilmenge der geschirmten Kristalle gesammelt, wo die Daten mit einer schnellen Kamera als Film^{gespeichert werden 3}. Diese Filme werden in ein kristallographisches Standardformat konvertiert und nahezu identisch wie ein Röntgenkristallographie-Experiment^{verarbeitet 4}.

MicroED wurde ursprünglich entwickelt, um Protein-Mikrokristalle^zu untersuchen ^1,2. Ein Engpass in der Proteinkristallographie ist die Züchtung großer, wohlgeordneter Kristalle für herkömmliche Synchrotron-Röntgenbeugungsexperimente. Da Elektronen mit Materie wechselwirken, die um Größenordnungen stärker ist als Röntgenstrahlung, sind die Grenzen der Kristallgröße, die erforderlich ist, um eine nachweisbare Beugung zu erzeugen,^{erheblich geringer 5}. Darüber hinaus ist das Verhältnis von elastischen zu inelastischen Streuereignissen für Elektronen günstiger, was darauf hindeutet, dass mit einer geringeren Gesamtexposition nützlichere Daten gesammelt werden können⁵. Ständige Weiterentwicklungen haben es ermöglicht, MicroED-Daten von den anspruchsvollsten Mikrokristallen zu sammeln 6,7,8,9.

Kürzlich hat sich gezeigt, dass MicroED ein leistungsfähiges Werkzeug zur Bestimmung der Strukturen von niedermolekularen Pharmazeutika aus scheinbar amorphen Materialien ist^10,11,12,13. Diese Pulver können direkt aus einer Flasche mit gekauftem Reagenz, einer Reinigungssäule oder sogar aus dem Zerkleinern einer Pille zu einem feinen Pulver^{stammen 10}. Diese Pulver erscheinen auf den ersten Blick amorph, können aber entweder vollständig aus Nanokristallen bestehen oder nur Spuren nanokristalliner Ablagerungen in einer größeren nichtkristallinen, amorphen Fraktion enthalten. Das Auftragen des Materials auf das Gitter ist einfach, und die nachfolgenden Schritte der Kristallidentifikation, des Screenings und der Datenerfassung könnten in naher Zukunft sogar automatisiert werden¹⁴. Während andere andere Methoden zur Probenvorbereitung und Datenerfassung verwenden, werden hier die Protokolle, die im Gonen-Labor entwickelt und verwendet werden, um Proben kleiner Moleküle für die Mikro-ED und für die Datenerfassung vorzubereiten, detailliert beschrieben.