İnsan CRISPR-Engineered CAR-T Hücrelerinin Üretimi
Summary
Burada, CAR-T hücrelerini değiştirmek için CRISPR Cas Teknolojisini kullanarak birincil insan T hücrelerinde gen düzenleme protokolü sunuyoruz.
Abstract
Kimerik antijen reseptör T hücreleri (CAR-T hücreleri) kullanılarak yapılan evlat edinen hücre tedavileri, hematolojik maligniteleri olan hastalarda dikkat çekici klinik etkinlik göstermiştir ve şu anda çeşitli katı tümörler için araştırılmaktadır. CAR-T hücreleri, T hücrelerini hastanın kanından uzaklaştırarak ve T hücrelerini hedef tümör hücrelerini tanımaya ve ortadan kaldırmaya yönlendiren sentetik bir bağışıklık reseptörü ifade etmek için mühendisliği yapılarak oluşturulur. CAR-T hücrelerinin gen düzenlemesi, mevcut CAR-T hücre tedavilerinin güvenliğini artırma ve CAR-T hücrelerinin etkinliğini daha da artırma potansiyeline sahiptir. Burada, CRISPR tarafından tasarlanmış insan CD19 yönlendirilmiş CAR-T hücrelerinin aktivasyonu, genişletilmesi ve karakterizasyonu için yöntemleri açıklıyoruz. Bu, CAR lentiviral vektörün transdüksiyonunu ve T hücrelerine ilgi genlerini hedeflemek için tek kılavuz RNA (sgRNA) ve Cas9 endonucleaz kullanımını içerir. Bu protokolde açıklanan yöntemler, bu çalışma için kullanılanların ötesindeki diğer CAR yapılarına ve hedef genlere evrensel olarak uygulanabilir. Ayrıca, bu protokolde gRNA tasarımı, kurşun gRNA seçimi ve hedef gen nakavt doğrulaması için yüksek verimli, çok katlı CRISPR-Cas9 klinik sınıf insan T hücrelerinin mühendisliğini yeniden elde etmek için stratejiler tartışılmaktadır.
Introduction
Kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücre tedavisi, evlat edinen hücre tedavileri ve kanser immünoterapisi alanında devrim sağlamıştır. CAR-T hücreleri, antijene özgü tek zincirli antikor parçasını TCRzeta zincirinden elde edilen sinyal etki alanları ve T hücre aktivasyonu ve ko-stimülasyon için gerekli ve yeterli costimülatör etki alanlarıyla birleştiren sentetik bir immün reseptörü ifade eden T hücreleridir. . CAR-T hücrelerinin üretimi hastanın kendi T hücrelerini çıkararak başlar, ardından CAR modülünün ex vivo viral transdüksiyonu ve CAR-T hücre ürününün yapay antijen olarak işlev gören manyetik boncuklarla genişletilmesi5. Genişletilmiş CAR-T hücreleri, hastaya engraft, hedef tümör hücrelerini ortadan kaldırabilecekleri ve hatta infüzyonsonrası 6,7,8. CAR-T hücre tedavisi B hücre malignitelerinde dikkate değer yanıt oranlarına neden olsa da, katı tümörler için klinik başarı, zayıf T hücre infiltrasyon9, immünsüpresif tümör mikroçevrimi10, antijen kapsamı ve özgüllüğü ve CAR-T hücre disfonksiyonu11,12 dahil olmak üzere birden fazla faktör tarafındanzorlandı. . Mevcut CAR-T hücre tedavisinin bir diğer sınırlaması otolog T hücrelerinin kullanımını içerir. Birden fazla kemoterapi ve yüksek tümör yükünden sonra, CAR-T hücreleri, otolog CAR-T hücrelerinin üretimiyle ilişkili zaman ve masrafa ek olarak sağlıklı donörlerden gelen allogeneik CAR-T ürünlerine kıyasla düşük kalitede olabilir. CAR-T hücre ürününün CRISPR/Cas9 tarafından gen düzenlemesi, CAR-T hücrelerinin mevcut sınırlamalarını aşmak için yeni bir stratejiyi temsil eder13,14,15,16,17.
CRISPR/Cas9, memeli hücrelerinde hedeflenen genom düzenleme için kullanılabilecek iki bileşenli bir sistemdir18,19. CRISPR ile ilişkili endonuclease Cas9, hedef DNA dizisi20ile baz eşleştirme yoluyla küçük RNA’lar tarafından yönlendirilen bölgeye özgü çift iplikçik kırılmalarına neden olabilir. Bir onarım şablonunun yokluğunda, çift iplikçik molaları, ekleme ve silme mutasyonları (INDEL’ ler) 19,20,21yoluyla frameshift mutasyonları veya erken durdurma kodonları ile sonuçlanan hataya eğilimli nonhomolog son birleştirme(NHEJ)yolu ile onarılır. Verimlilik, kullanım kolaylığı, maliyet etkinliği ve çok katlı genom düzenleme yeteneği CRISPR/Cas9’u otolog ve allogeneik CAR-T hücrelerinin etkinliğini ve güvenliğini artırmak için güçlü bir araç haline getirir. Bu yaklaşım, CAR yapısını bir TCR ile değiştirerek TCR yönlendirilmiş T hücrelerini düzenlemek için de kullanılabilir. Ek olarak, grefte ve konak hastalığa neden olma potansiyeli sınırlı olan allogeneik CAR-T hücreleri de TCR, b2m ve HLA lokus gen düzenlemesi ile üretilebilir.
Bu protokolde, T hücrelerinin CRISPR mühendisliğinin, gelişmiş etkinlik ve güvenliğe sahip genom düzenlemeli CAR-T hücre ürünleri üretmek için CAR-Transgene’in viral vektör aracılı teslimatı ile nasıl birleştirilebileceğini gösteriyoruz. Şekil 1‘de tüm işlemin şematik diyagramı gösterilmiştir. Bu yaklaşımı kullanarak, birincil insan CAR-T hücrelerinde yüksek verimli gen nakavtı gösterdik. Şekil 2A, T hücrelerini düzenlemek ve üretmek için her adımın zaman çizelgesini ayrıntılı olarak açıklar. Bu yaklaşımı çeşitli hedef genlere uygulamak için kılavuz RNA tasarımı ve nakavt doğrulaması stratejileri de tartışılmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada CRISPR Cas9 teknolojisini kullanarak CAR-T hücrelerini gen düzenleme yaklaşımlarını açıklıyoruz ve işlev ve etkinliği daha fazla test etmek için ürünler üretiyoruz. Yukarıdaki protokol, chimerik antijen reseptörleri ile mühendislik T hücreleri ile birlikte birincil insan T hücrelerinde CRIPSR gen düzenleme yapmak için optimize edilmiştir. Bu protokol, donörden donöre en az değişkenlik ile yüksek nakavt verimliliği sağlar. CRISPR kullanılarak yapılan modifikasyon, T hücrelerinin iş…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
İnsan İmmünoloji Çekirdeği’ni normal donör T hücreleri ve Pennsylvania Üniversitesi’ndeki Akış Sitometri Çekirdeğini sağladığı için kabul ediyoruz.
Materials
| 4D-Nucleofactor Core Unit | Lonza | AAF-1002B | |
| 4D-Nucleofactor X-Unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Accuprime Pfx Supermix | ThermoFisher | 12344040 | |
| Beckman Optima XPN ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317322 | Clone OKT3 |
| BV711 Anti-human PD1 | Biolegend | Clone EH12.2H7 | |
| Cas9-Electroporation enhancers | IDT | 1075915 | |
| CD3/CD28 Dynabeads | ThermoFisher | 40203D | |
| CD4+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15062 | |
| CD8+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15063 | |
| Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle | Corning | 430768 | |
| Corning T150 cell culture flask | Millipore Sigma | CLS430825 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D2650 | |
| DNAeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| DynaMag Magnet | ThermoFisher | 12321D | |
| Glutamax supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| huIL-15 | PeproTech | 200-15 | |
| huIL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668019 | |
| Nucleospin Gel and PCR cleanup | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | |
| Penicilin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | |
| pTRPE expression Plasmid | in house | ||
| Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE | CytoArt | 200105 | |
| RPMI1640 | ThermoFisher | 12633012 | |
| sgRNA | IDT | ||
| Spy Fi Cas9 | Aldevron | 9214 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Viral packaging mix | in house | ||
| X-Vivo-15 Media | Lonza | BE02-060F |
References
- Kowolik, C. M., et al. CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells. Cancer Research. 66 (22), 10995-11004 (2006).
- Krause, A., et al. Antigen-dependent CD28 signaling selectively enhances survival and proliferation in genetically modified activated human primary T lymphocytes. The Journal of Experimental Medicine. 188 (4), 619-626 (1998).
- Kuwana, Y., et al. Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V resions and T-cell receptor-derived C regions. Biochemical and biophysical research Communications. 149 (3), 960-968 (1987).
- Maher, J., Brentjens, R. J., Gunset, G., Rivière, I., Sadelain, M. Human T-lymphocyte cytotoxicity and proliferation directed by a single chimeric TCRζ/CD28 receptor. Nature Biotechnology. 20 (1), 70-75 (2002).
- Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K., Keir, C. Global manufacturing of CAR-T cell therapy. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
- Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR-T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 139 (2015).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
- Melero, I., Rouzaut, A., Motz, G. T., Coukos, G. T-cell and NK-cell infiltration into solid tumors: a key limiting factor for efficacious cancer immunotherapy. Cancer Discovery. 4 (5), 522-526 (2014).
- Mohammed, S., et al. Improving chimeric antigen receptor-modified T cell function by reversing the immunosuppressive tumor microenvironment of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 25 (1), 249-258 (2017).
- Moon, E. K., et al. Multifactorial T-cell hypofunction that is reversible can limit the efficacy of chimeric antigen receptor-transduced human T cells in solid tumors. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4262-4273 (2014).
- Beatty, G. L., O’Hara, M. Chimeric antigen receptor-modified T cells for the treatment of solid tumors: defining the challenges and next steps. Pharmacology & Therapeutics. 166, 30-39 (2016).
- Stadtmauer, E. A., et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 367 (6481), (2020).
- MacLeod, D. T., et al. Integration of a CD19 CAR into the TCR alpha chain locus streamlines production of allogeneic gene-edited CAR-T cells. Molecular Therapy. 25 (4), 949-961 (2017).
- Ren, J., et al. Multiplex genome editing to generate universal CAR-T cells resistant to PD1 inhibition. Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).
- Ureña-Bailén, G., et al. CRISPR/Cas9 technology: towards a new generation of improved CAR-T cells for anticancer therapies. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 191-200 (2020).
- Li, C., Mei, H., Hu, Y. Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR-T-cell therapy. Briefings in Functional Genomics. 19 (3), 175-182 (2020).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. Elife. 2, 00471 (2013).
- Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrançois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nature Immunology. 1 (5), 426-432 (2000).
- Prlic, M., Lefrancois, L., Jameson, S. C. Multiple choices: regulation of memory CD8 T cell generation and homeostasis by interleukin (IL)-7 and IL-15. The Journal of Experimental Medicine. 195 (12), 49-52 (2002).
- Zhou, J., et al. Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects. Protein & Cell. 10 (10), 764-769 (2019).
- Hultquist, J. F., et al. CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions. Nature Protocols. 14 (1), 1-27 (2019).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
