Produzione di cellule CAR-T umane ingegnerizzate CRISPR

La terapia cellulare del recettore dell’antigene chimerico (CAR)-T ha rivoluzionato il campo delle terapie cellulari adottive e dell’immunoterapia del cancro. Le cellule CAR-T sono cellule T ingegnerizzate che esprimono un recettore immunitario sintetico che combina un frammento di anticorpo a catena singola antigene-specifico con domini di segnalazione derivati dalla catena TCRzeta e domini costimulatori necessari e sufficienti per l’attivazione e la co-stimolazione delle cellule T^1,2,3,4 . La produzione di cellule CAR-T inizia estraendo le cellule T del paziente, seguita dalla trasduzione virale ex vivo del modulo CAR e dall’espansione del prodotto cellulare CAR-T con perle magnetiche che funzionano come antigene artificiale presentando cellule⁵. Le cellule CAR-T espanse vengono reinfuse nel paziente dove possono attecchire, eliminare le cellule tumorali bersaglio e persino persistere per più anni dopo l’infusione^6,7,8. Sebbene la terapia con cellule CAR-T abbia portato a notevoli tassi di risposta nelle neoplasie delle cellule B, il successo clinico per i tumori solidi è stato messo alla prova da molteplici fattori tra cui la scarsa infiltrazione delle cellule T^9,un microambiente tumorale immunosoppressivo^10,la copertura e la specificità dell’antigene e la disfunzione delle cellule CAR-T^11,12 . Un’altra limitazione dell’attuale terapia cellulare CAR-T include l’uso di cellule T autologhe. Dopo più cicli di chemioterapia e un elevato carico tumorale, le cellule CAR-T possono essere di scarsa qualità rispetto ai prodotti ALLOGENI CAR-T di donatori sani, oltre al tempo e alle spese associate alla produzione di cellule CAR-T autologhe. L’editing genetico del prodotto car-T di CRISPR/Cas9 rappresenta una nuova strategia per superare gli attuali limiti delle cellule CAR-T^{13,14,15,16,17.}

CRISPR/Cas9 è un sistema bicomponente che può essere utilizzato per l’editing mirato del genoma nelle cellule di mammifero^18,19. L’endonucleasi Associata a CRISPR Cas9 può indurre rotture a doppio filamento sito-specifiche guidate da piccoli RNA attraverso l’accoppiamento di basi con la sequenza di DNA bersaglio^20. In assenza di un modello di riparazione, le rotture a doppio filamento vengono riparate dalla via NHEJ (nonhomologous end joining) soggetta a errori, con conseguenti mutazioni frameshift o codoni di arresto prematuro attraverso mutazioni di inserzione e delezione (INDL)^19,20,21. Efficienza, facilità d’uso, economicità e capacità di editing del genoma multiplex rendono CRISPR/Cas9 un potente strumento per migliorare l’efficacia e la sicurezza delle cellule CAR-T autologhe e allogenei. Questo approccio può essere utilizzato anche per modificare le celle T dirette TCR sostituendo il costrutto CAR con un TCR. Inoltre, le cellule CAR-T allogeniche che hanno un potenziale limitato di causare la malattia del trapianto contro l’ospite possono anche essere generate dalla modifica genica del locus TCR, b2m e HLA.

In questo protocollo, mostriamo come l’ingegneria CRISPR delle cellule T può essere combinata con la consegna mediata da vettori virali del CAR-Transgene per generare prodotti a cellule CAR-T modificati dal genoma con maggiore efficacia e sicurezza. Un diagramma schematico dell’intero processo è mostrato nella Figura 1. Utilizzando questo approccio, abbiamo dimostrato knockout genico ad alta efficienza nelle cellule CAR-T umane primarie. La Figura 2A descrive in dettaglio la sequenza temporale di ogni passaggio per la modifica e la produzione di celle T. Vengono inoltre discusse le strategie per la progettazione dell’RNA guida e la convalida del knockout per applicare questo approccio a vari geni bersaglio.