Herstellung von humanen CRISPR-engineered CAR-T Zellen
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll für die Genbearbeitung in primären menschlichen T-Zellen vor, das die CRISPR Cas-Technologie verwendet, um CAR-T-Zellen zu modifizieren.
Abstract
Adoptive Zelltherapien mit chimären Antigenrezeptor-T-Zellen (CAR-T-Zellen) haben eine bemerkenswerte klinische Wirksamkeit bei Patienten mit hämatologischen Malignomen gezeigt und werden derzeit auf verschiedene solide Tumoren untersucht. CAR-T-Zellen werden erzeugt, indem T-Zellen aus dem Blut eines Patienten entfernt und so hergestellt werden, dass sie einen synthetischen Immunrezeptor exprimieren, der die T-Zellen umleitet, um Zieltumorzellen zu erkennen und zu eliminieren. Die Geneditierung von CAR-T-Zellen hat das Potenzial, die Sicherheit aktueller CAR-T-Zelltherapien zu verbessern und die Wirksamkeit von CAR-T-Zellen weiter zu erhöhen. Hier beschreiben wir Methoden zur Aktivierung, Expansion und Charakterisierung von humanen CRISPR-engineered CD19 gerichteten CAR-T-Zellen. Dies umfasst die Transduktion des car-lentiviralen Vektors und die Verwendung von Single-Guide-RNA (sgRNA) und Cas9-Endonuklease, um Gene von Interesse in T-Zellen anzusprechen. Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden können universell auf andere CAR-Konstrukte und Zielgene angewendet werden, die über die für diese Studie verwendeten hinausgehen. Darüber hinaus werden in diesem Protokoll Strategien für das gRNA-Design, die Lead-gRNA-Selektion und die Target-Gen-Knockout-Validierung diskutiert, um reproduzierbar ein hocheffizientes Multiplex-CRISPR-Cas9-Engineering von humanen T-Zellen in klinischer Qualität zu erreichen.
Introduction
Die chimäre Antigenrezeptor (CAR)-T-Zelltherapie hat das Gebiet der adoptiven Zelltherapien und der Krebsimmuntherapie revolutioniert. CAR-T-Zellen sind technisch hergestellte T-Zellen, die einen synthetischen Immunrezeptor exprimieren, der ein antigenspezifisches einkettiges Antikörperfragment mit Signaldomänen aus der TCRzeta-Kette und kostimulatorischen Domänenkombiniert,die für die T-Zellaktivierung und Co-Stimulation notwendig und ausreichend sind1,2,3,4 . Die Herstellung von CAR-T-Zellen beginnt mit der Extraktion der patienteneigenen T-Zellen, gefolgt von der ex vivo viralen Transduktion des CAR-Moduls und der Erweiterung des CAR-T-Zellprodukts mit magnetischen Perlen, die als künstliche Antigen-präsentierende Zellen fungieren5. Expandierte CAR-T-Zellen werden erneut in den Patienten infundiert, wo sie transplantieren, Zieltumorzellen eliminieren und sogar mehrere Jahre nach der Infusion bestehen können6,7,8. Obwohl die CAR-T-Zelltherapie zu bemerkenswerten Ansprechraten bei malignen B-Zell-Erkrankungen geführt hat, wurde der klinische Erfolg bei soliden Tumoren durch mehrere Faktoren in Frage gestellt, darunter eine schlechte T-Zell-Infiltration9, eine immunsuppressive Tumormikroumgebung10, Antigenabdeckung und -spezifität sowie CAR-T-Zelldysfunktion11,12 . Eine weitere Einschränkung der aktuellen CAR-T-Zelltherapie ist die Verwendung autologer T-Zellen. Nach mehreren Chemotherapierunden und hoher Tumorbelastung können CAR-T-Zellen im Vergleich zu allogenen CAR-T-Produkten von gesunden Spendern von schlechter Qualität sein, zusätzlich zu dem Zeit- und Kostenaufwand, der mit der Herstellung autologer CAR-T-Zellen verbunden ist. Die Gen-Editierung des CAR-T-Zellprodukts durch CRISPR/Cas9 stellt eine neue Strategie dar, um die derzeitigen Einschränkungen der CAR-T-Zellen zu überwinden13,14,15,16,17.
CRISPR/Cas9 ist ein Zweikomponentensystem, das für die gezielte Genombearbeitung in Säugetierzellen eingesetzt werden kann18,19. Die CRISPR-assoziierte Endonuklease Cas9 kann ortsspezifische Doppelstrangbrüche induzieren, die von kleinen RNAs durch Basenpaarung mit der Ziel-DNA-Sequenz20geleitet werden. In Ermangelung einer Reparaturschablone werden Doppelstrangbrüche durch den fehleranfälligen nichthomologen End joining (NHEJ) -Weg repariert, was zu Frameshift-Mutationen oder vorzeitigen Stop-Codons durch Insertions- und Deletionsmutationen (INDELs) führt19,20,21. Effizienz, Benutzerfreundlichkeit, Kosteneffizienz und die Fähigkeit zur Multiplex-Genom-Editierung machen CRISPR/Cas9 zu einem leistungsstarken Werkzeug, um die Wirksamkeit und Sicherheit autologer und allogener CAR-T-Zellen zu verbessern. Dieser Ansatz kann auch verwendet werden, um TCR-gerichtete T-Zellen zu bearbeiten, indem das CAR-Konstrukt durch ein TCR ersetzt wird. Darüber hinaus können allogene CAR-T-Zellen, die ein begrenztes Potenzial haben, eine Graft-versus-Host-Krankheit zu verursachen, auch durch Gen-Editing des TCR-, b2m- und HLA-Locus erzeugt werden.
In diesem Protokoll zeigen wir, wie CRISPR-Engineering von T-Zellen mit viraler vektorvermittelter Abgabe des CAR-Transgens kombiniert werden kann, um genomeditierte CAR-T-Zellprodukte mit erhöhter Wirksamkeit und Sicherheit zu erzeugen. Ein schematisches Diagramm des gesamten Prozesses ist in Abbildung 1 dargestellt. Mit diesem Ansatz haben wir einen hocheffizienten Gen-Knockout in primären menschlichen CAR-T-Zellen nachgewiesen. Abbildung 2A beschreibt detailliert den Zeitplan der einzelnen Schritte zum Bearbeiten und Herstellen von T-Zellen. Strategien für das RNA-Design und die Knockout-Validierung werden ebenfalls diskutiert, um diesen Ansatz auf verschiedene Zielgene anzuwenden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir Ansätze zur Genbearbeitung von CAR-T-Zellen mit crispR Cas9-Technologie und zur Herstellung von Produkten, um die Funktion und Wirksamkeit weiter zu testen. Das obige Protokoll wurde für die Durchführung von CRIPSR-Gen-Editing in primären menschlichen T-Zellen in Kombination mit engineering T-Zellen mit chimären Antigenrezeptoren optimiert. Dieses Protokoll ermöglicht eine hohe Knockout-Effizienz bei minimaler Variabilität von Spender zu Spender. Die Modifikation mit CRISPR kann sowohl die Wir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir erkennen den Human Immunology Core für die Bereitstellung normaler Spender-T-Zellen und den Flow Cytometry Core an der University of Pennsylvania an.
Materials
| 4D-Nucleofactor Core Unit | Lonza | AAF-1002B | |
| 4D-Nucleofactor X-Unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Accuprime Pfx Supermix | ThermoFisher | 12344040 | |
| Beckman Optima XPN ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317322 | Clone OKT3 |
| BV711 Anti-human PD1 | Biolegend | Clone EH12.2H7 | |
| Cas9-Electroporation enhancers | IDT | 1075915 | |
| CD3/CD28 Dynabeads | ThermoFisher | 40203D | |
| CD4+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15062 | |
| CD8+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15063 | |
| Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle | Corning | 430768 | |
| Corning T150 cell culture flask | Millipore Sigma | CLS430825 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D2650 | |
| DNAeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| DynaMag Magnet | ThermoFisher | 12321D | |
| Glutamax supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| huIL-15 | PeproTech | 200-15 | |
| huIL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668019 | |
| Nucleospin Gel and PCR cleanup | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | |
| Penicilin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | |
| pTRPE expression Plasmid | in house | ||
| Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE | CytoArt | 200105 | |
| RPMI1640 | ThermoFisher | 12633012 | |
| sgRNA | IDT | ||
| Spy Fi Cas9 | Aldevron | 9214 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Viral packaging mix | in house | ||
| X-Vivo-15 Media | Lonza | BE02-060F |
References
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