Productie van menselijke CRISPR-engineered CAR-T-cellen

Chimere antigeenreceptor (CAR)-T celtherapie heeft een revolutie teweeggebracht op het gebied van adoptieve celtherapieën en kankerimmunotherapie. CAR-T-cellen zijn gemanipuleerde T-cellen die een synthetische immuunreceptor tot expressie brengen die een antigeenspecifiek antilichaamfragment met één keten combineert met signaaldomeinen afgeleid van de TCRzeta-keten en kostenimulatorische domeinen die nodig en voldoende zijn voor T-celactivering en co-stimulatie^1,2,3,4 . De productie van CAR-T-cellen begint met het extraheren van de eigen T-cellen van de patiënt, gevolgd door ex vivo virale transductie van de CAR-module en uitbreiding van het CAR-T-celproduct met magnetische kralen die functioneren als kunstmatige antigeen presenterende cellen⁵. Geëxpandeerde CAR-T-cellen worden opnieuw in de patiënt geïnjecteerd, waar ze kunnen enten, doeltumorcellen kunnen elimineren en zelfs meerdere jaren na infusie kunnen aanhouden^6,7,8. Hoewel CAR-T-celtherapie heeft geresulteerd in opmerkelijke responspercentages bij B-cel maligniteiten, is klinisch succes voor solide tumoren uitgedaagd door meerdere factoren, waaronder slechte T-celinfiltratie⁹, een immunosuppressieve tumor micro-omgeving¹⁰, antigeen dekking en specificiteit, en CAR-T cel disfunctie^11,12 . Een andere beperking van de huidige CAR-T-celtherapie omvat het gebruik van autologe T-cellen. Na meerdere rondes chemotherapie en hoge tumorbelasting kunnen CAR-T-cellen van slechte kwaliteit zijn in vergelijking met allogene CAR-T-producten van gezonde donoren, naast de tijd en kosten die gepaard gaan met de productie van autologe CAR-T-cellen. Genbewerking van het CAR-T-celproduct door CRISPR/Cas9 vertegenwoordigt een nieuwe strategie om de huidige beperkingen van CAR-T-cellen te overwinnen^{13,14,15,16,17.}

CRISPR/Cas9 is een tweecomponentensysteem dat kan worden gebruikt voor gerichte genoombewerking in zoogdiercellen^18,19. De CRISPR-geassocieerde endonuclease Cas9 kan plaatsspecifieke dubbelstrengsbreuken induceren geleid door kleine RNA’s door base-pairing met de doel-DNA-sequentie²⁰. Bij afwezigheid van een reparatiesjabloon worden dubbelstrengsbreuken gerepareerd door de foutgevoelige niet-homologe eindvoeging (NHEJ) -route, resulterend in frameshiftmutaties of voortijdige stopcodons door insertie- en deletiemutaties (INDELs)^19,20,21. Efficiëntie, gebruiksgemak, kosteneffectiviteit en de mogelijkheid voor multiplex genoombewerking maken CRISPR/Cas9 tot een krachtig hulpmiddel om de werkzaamheid en veiligheid van autologe en allogene CAR-T-cellen te verbeteren. Deze aanpak kan ook worden gebruikt om TCR-gerichte T-cellen te bewerken door de CAR-constructie te vervangen door een TCR. Bovendien kunnen allogene CAR-T-cellen met een beperkt potentieel om graft versus host-ziekte te veroorzaken, ook worden gegenereerd door genbewerking van de TCR-, b2m- en HLA-locus.

In dit protocol laten we zien hoe CRISPR-engineering van T-cellen kan worden gecombineerd met virale vectorgemedieerde levering van het CAR-Transgen om genoom-bewerkte CAR-T-celproducten te genereren met verbeterde werkzaamheid en veiligheid. Een schematisch diagram van het gehele proces is weergegeven in figuur 1. Met behulp van deze aanpak hebben we een zeer efficiënte gen knock-out aangetoond in primaire menselijke CAR-T-cellen. Figuur 2A beschrijft in detail de tijdlijn van elke stap voor het bewerken en vervaardigen van T-cellen. Strategieën voor gids RNA-ontwerp en knock-out validatie worden ook besproken om deze aanpak toe te passen op verschillende doelgenen.