Здесь предусмотрен протокол для покадровой визуализации морфогенеза глаза с использованием коммерчески доступного светового микроскопа и рабочей станции обработки изображений для анализа полученных данных. В этом протоколе подробно описываются процедуры анестезии эмбрионов, встраивание агарозы с низкой температурой плавления, суспензия в камере визуализации, настройка параметров визуализации и, наконец, анализ данных визуализации с использованием программного обеспечения для анализа изображений.
Развитие глаза позвоночных является сложным процессом, который начинается ближе к концу гаструляции эмбриона и требует точной координации миграции клеток, пролиферации и дифференцировки. Покадровое воображение дает уникальное представление о поведении клеток во время развития глаз, потому что оно позволяет нам визуализировать окулогенез in vivo. Рыбки данио являются отличной моделью для визуализации этого процесса из-за их высококонсервированного глаза позвоночных и их способности быстро и внешне развиваться, оставаясь оптически прозрачными. Покадровые исследования развития глаз рыбок данио значительно облегчаются использованием трансгенной линии рыбок данио Tg(rx3: GFP). В развивающемся переднем мозге экспрессия rx3: GFP отмечает клетки одного глазного поля, и GFP продолжает экспрессироваться, когда глазное поле уклоняется, образуя зрительный пузырь, который затем инвагинируется, образуя оптическую чашку. Таким образом, покадровая визуализация экспрессии rx3: GFP с высоким разрешением позволяет нам отслеживать примордий глаза во времени, когда он развивается в сетчатку. Световой микроскопия является идеальным методом для изображения глазного морфогенеза с течением времени из-за его способности проникать в более толстые образцы для флуоресцентной визуализации, минимизировать фотоотбеливание и фототоксичность, а также изображение на высокой скорости. Здесь предусмотрен протокол для покадровой визуализации морфогенеза глаза с использованием коммерчески доступного светового микроскопа и рабочей станции обработки изображений для анализа полученных данных. В этом протоколе подробно описываются процедуры анестезии эмбрионов, встраивание агарозы с низкой температурой плавления, суспензия в камере визуализации, настройка параметров визуализации и, наконец, анализ данных визуализации с использованием программного обеспечения для анализа изображений. Полученный набор данных может дать ценную информацию о процессе морфогенеза глаз, а также о возмущениях этого процесса в результате генетической мутации, воздействия фармакологических агентов или других экспериментальных манипуляций.
Эмбриональное развитие является сложным процессом, который требует точной координации множества различных событий. Формирование глаза позвоночных начинается в развивающемся переднем мозге, где часть клеток указывается как поле глаза. Эти клетки будут уклоняться к поверхностной эктодерме, давая начало двум двусторонним зрительным везикулам 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Контакт с поверхностной эктодермой затем индуцирует инвагинацию зрительного пузырька в оптическую чашку. Поверхностная эктодерма будет давать начало передним структурам глаза, таким как хрусталик и роговица, в то время как оптическая чашечка даст начало нервной сетчатке и пигментированному эпителию сетчатки и сетчатки 1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,12 . Нарушения в этом процессе могут привести к врожденным дефектам, таким как микрофтальмия, анофтальмия и колобома (MAC). В настоящее время нет вариантов исправления этих дефектов 3,5,6,7,9,10,11,12. Дальнейшие исследования механизмов морфогенеза глаз и проблем, которые могут привести к МАК, обеспечат основу знаний, которые потенциально приведут к лечению. Одним из мощных инструментов для исследования динамического поведения клеток во время развития глаз является покадровое воображение, которое позволяет визуализировать и характеризовать этот процесс in vivo и в режиме реального времени.
Рыбки данио (Danio rerio) являются отличной моделью для визуализации раннего развития глаз с использованием покадровой визуализации. Они имеют высокосохраненный глаз позвоночных и обладают способностью быстро и внешне развиваться, оставаясь оптически прозрачными1. Рыбки данио обеспечивают отличный ресурс для покадровой визуализации из-за этих характеристик, которых не хватает моделям млекопитающих. Покадровые исследования развития глаз рыбок данио значительно облегчаются использованием трансгенной линии рыбок данио Tg(rx3: GFP)13. Rx3 (гомеобоксный белок сетчатки 3) является транскрипционным фактором, необходимым для развития глаз14. Rx3 является первым из трех генов rx у рыбок данио, которые экспрессируются, начиная свою экспрессию в середине гаструляции, примерно через 8 ч после оплодотворения (hpf) 15,16. Трансген rx3:GFP может быть визуализирован в развивающемся переднем мозге, начиная с 1 стадии сомита (ss), примерно 10 л.с. 15,17,18,19,20. В развивающемся переднем мозге экспрессия rx3:GFP отмечает клетки одного глазного поля, а GFP (зеленый флуоресцентный белок) продолжает экспрессироваться через оставшуюся часть глазного морфогенеза. Таким образом, покадровая визуализация экспрессии rx3: GFP с высоким разрешением позволяет нам отслеживать одно поле глаза во времени, когда оно развивается в сетчатку 17,18,20.
Покадровые исследования развития рыбок данио в основном проводились с использованием конфокальной или световой микроскопии. Конфокальная микроскопия выгодна тем, что она позволяет точно визуализировать образцы вдоль оси Z и уменьшает флуоресцентный фоновый сигнал. Однако он ограничен количеством времени, необходимого для получения изображения, жесткостью положения образца и его склонностью к фотоотбеливанию и фототоксичности живых образцов. Световой микроскопия является идеальным методом для изображения глазного морфогенеза с течением времени благодаря его способности проникать в более толстые образцы для флуоресцентной визуализации, повышенной гибкости в ориентации образцов, минимизации фотоотбеливания и фототоксичности, а также визуализации на высокой скорости 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 ,31. Пространственное разрешение, достижимое с помощью современных систем световой листовой микроскопии, составляет примерно 250-500 нанометров (нм). Хотя это существенно не отличается от того, что может быть получено с помощью конфокальной микроскопии, образец можно свободно поворачивать и визуализировать под несколькими углами, улучшая как глубину изображения, так и разрешение, и предлагая гораздо большую гибкость для экспериментов по покадровой визуализации in vivo, чем конфокальная платформа27,32 . По этим причинам микроскопия Lightsheet быстро становится предпочтительным методом для покадровых исследований развития рыбок данио. Этот протокол описывает этапы количественной оценки окулогенеза посредством визуализации трансгенных рыбок данио Rx3: GFP с использованием коммерчески доступного микроскопа Lightsheet33 и детализирует конвейер для анализа изображений с использованием программной платформы arivis.
В этом протоколе микроскоп Lightsheet использовался для выполнения покадровой визуализации развития глаз, и полученные данные были проанализированы. Полученный набор данных может дать ценную информацию о процессе морфогенеза глаз, а также о нарушениях этого процесса в результате генетической мутации, воздействия фармакологических агентов или других экспериментальных параметров. Здесь протокол продемонстрировал, как можно получить этот набор данных, и предоставил пример того, как анализировать объем глазного поля на ранней стадии развития. Было установлено, что эти данные воспроизводимы и последовательны (менее 10% вариаций объема) среди биологических реплик, учитывая, что небольшие различия в стадии эмбриона до начала пробега могут привести к некоторым изменениям в окончательных измерениях объема.
Следует проявлять осторожность при первоначальном позиционировании эмбриона в капилляре и при позиционировании внедренного эмбриона перед целью. Ориентация играет важную роль в предотвращении роста эмбриона и выхода из поля зрения цели. Эмбрионы имеют круглую форму при 10 л.с.ф., что затрудняет гарантию определенной ориентации в капилляре. В идеале тело эмбриона будет располагаться латерально в капилляре. Загрузка нескольких эмбрионов в капилляр увеличит вероятность наличия хорошо расположенного эмбриона.
В этой процедуре эмбрион встраивается в агарозу, чтобы подвешивать ее перед целями визуализации и освещения. Выбор правильной концентрации агарозы с низкой температурой плавления имеет решающее значение. Слишком высокая концентрация будет сжимать эмбрион и препятствовать его правильному развитию; слишком низкая концентрация приведет к тому, что агароза развалится и не удержит эмбрион. Оптимальной для данного протокола концентрацией является конечная концентрация 1% с низкой температурой плавления агарозы30,31.
Еще одним элементом, который следует учитывать, является уровень насыщенности. По мере роста и дифференциации глаз сила сигнала Rx3:GFP усиливается. Поэтому при установке начальных параметров изображения экспозиция и мощность лазера должны быть уменьшены, чтобы перенасытить изображение. Это предотвратит перенасыщение изображения, поскольку Rx3: GFP со временем становится ярче. Изменения могут быть сделаны для исправления недостаточной насыщенности в обработке изображений, но перенасыщение не может быть исправлено после получения изображений.
Существует несколько дополнительных изменений, которые могут быть внесены в этот протокол, которые могут быть полезны для некоторых проектов, которые не описаны в этом документе. Например, можно настроить многовидную визуализацию в настройке получения изображения. Этот параметр позволит последовательно визуализировать несколько эмбрионов в разных положениях вдоль оси Y на каждом временном интервале. Усложняя набор данных, это увеличило бы скорость сбора данных. Кроме того, с точки зрения обработки изображений, можно количественно оценить поле глаза по другим параметрам. Здесь мы описали, как количественно оценить данные с точки зрения объема поля глаза. В качестве альтернативы может быть сделан конвейер для количественной оценки и отслеживания отдельных клеток или определения скорости эвагинации зрительных пузырьков.
Как упоминалось ранее, как конфокальная, так и Lightsheet микроскопия использовались для выполнения покадровых исследований изображений рыбок данио. Lightsheet был специально выбран для этого проекта из-за его превосходной способности к изображению через толстый (>1 мм) образец, потому что он оснащен инкубационной установкой для поддержания идеальной температурной среды для эмбриона рыбки данио, и потому, что его способность получать изображения с более высокой скоростью, чем конфокальная микроскопия, позволяет получать изображения через многочисленные промежутки времени, необходимые для этого протокола, без сопутствующего повреждения или фотоотбеливания эмбриона21, 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Также важно отметить, что микроскоп Lightsheet оснащен для изображения сигнала от нескольких флуорофоров. Микроскоп Lightsheet, используемый в этом исследовании, имеет твердотельные лазерные линии возбуждения на 405, 445, 488, 515, 561 и 638 нм, которые могут быть полезны для визуализации трансгенных эмбрионов, экспрессирующих более одного флуоресцентного репортерного трансгена.
В то время как этот протокол детализирует инструкции по анализу получения изображений, в частности, с использованием системы микроскопов с двойным освещением Lightsheet Z.1 и аналитического программного обеспечения arivis Vision4D, существуют другие коммерчески доступные микроскопы Lightsheet, изготовленные Leica, Olympus и Luxendo, а также программное обеспечение для анализа изображений Imaris, которые могут быть использованы для достижения аналогичных результатов. Выбор оборудования и программного обеспечения для этого протокола определялся наличием в нашем учреждении.
Таким образом, ожидается, что этот протокол обеспечит прочную отправную точку для проведения покадровой визуализации с использованием микроскопии Lightsheet и для количественной оценки изображений раннего развития глаз у рыбок данио.
The authors have nothing to disclose.
Исследования, о которых сообщается в этой публикации, были поддержаны Управлением директора Национальных институтов здравоохранения (NIH) под номером S10OD020067 и наградой NIH R01EY021769 (A.C.M.). Мы благодарны за помощь Дугу Харрисону и Джиму Бегли в Центре визуализации искусств и наук при Университете Кентукки, а также Лукасу Виейре Франциско и Эвелин М. Тернбо за экспертный уход за рыбками данио.
60mL Syringe Luer-Lok Tip | BD | 309653 |
Agarose, Low Melting Temperature | Promega | V2111 |
arivis Vision4D Software | arivis | https://www.arivis.com/en/imaging-science/arivis-vision4d |
Dumoxel N3C Forceps | Dumont | 0203-N3C-PO |
E3 fish buffer (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4) | ||
Glass Capillary – Size 2 (~1mm) | Zeiss | Black/701904 |
Heidelberger Extension Line 100cm | B. Braun | 4097262 |
Light & Filter Set – Royal Blue | Night Sea | SFA-LFS-RB |
Petri Dish (100 x 15 mm) | VWR | 25384-302 |
Stereomicroscope Fluorescence Adapter | NightSea | |
Teflon Tipped Plunger – Size 2 | Zeiss | #701997 |
Tg(rx3:GFP) zebrafish | This line was established by Rembold et al.13 | |
Tricaine (MS222) | Sigma | A-5040 |
Z.1 Lightsheet | Zeiss | |
Zen Software | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |