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Developmental Biology

Visualizando Morfogênese Ocular por Microscopia de Folha de Luz usando rx3:GFP Zebrafish Transgênico

Published: April 05, 2021
doi:
10.3791/62296
,
1Department of Biology,University of Kentucky

Summary

Aqui, é fornecido um protocolo para imagens de lapso de tempo de morfogênese ocular usando um microscópio de folha de luz comercialmente disponível e uma estação de trabalho de processamento de imagem para analisar os dados resultantes. Este protocolo detalha os procedimentos para anestesia embrionária, incorporando em baixa temperatura de fusão agarose, suspensão na câmara de imagem, configuração dos parâmetros de imagem e, finalmente, analisando os dados de imagem usando software de análise de imagem.

Abstract

O desenvolvimento do olho vertebrado é um processo complexo que começa perto do fim da gastrulação do embrião e requer a coordenação precisa da migração celular, proliferação e diferenciação. A imaginação com lapso de tempo oferece uma visão única do comportamento das células durante o desenvolvimento dos olhos, pois nos permite visualizar a oculogênese in vivo. O zebrafish é um excelente modelo para visualizar esse processo devido ao seu olho vertebrado altamente conservado e sua capacidade de se desenvolver de forma rápida e externa enquanto permanece opticamente transparente. Estudos de imagem de lapso de tempo do desenvolvimento dos olhos de zebrafish são muito facilitados pelo uso da linha transgênica de zebrafish Tg (rx3:GFP). No antebrado em desenvolvimento, a expressão rx3:GFP marca as células do campo único dos olhos, e o GFP continua a ser expresso à medida que o campo ocular se evagita para formar uma vesícula óptica, que então invagina para formar um copo óptico. A imagem de lapso de tempo de alta resolução da expressão rx3:GFP, portanto, nos permite rastrear o primordium ocular através do tempo à medida que se desenvolve na retina. A microscopia de lightsheet é um método ideal para a imagem morfogênese ocular ao longo do tempo devido à sua capacidade de penetrar amostras mais grossas para imagens fluorescentes, minimizar fotobleaching e fototoxicidade, e imagem em alta velocidade. Aqui, é fornecido um protocolo para imagens de lapso de tempo de morfogênese ocular usando um microscópio de folha de luz comercialmente disponível e uma estação de trabalho de processamento de imagem para analisar os dados resultantes. Este protocolo detalha os procedimentos para anestesia embrionária, incorporando em baixa temperatura de fusão agarose, suspensão na câmara de imagem, configuração dos parâmetros de imagem e, finalmente, analisando os dados de imagem usando software de análise de imagem. O conjunto de dados resultante pode fornecer insights valiosos sobre o processo de morfogênese ocular, bem como perturbações a este processo como resultado de mutação genética, exposição a agentes farmacológicos ou outras manipulações experimentais.

Introduction

O desenvolvimento embrionário é um processo complexo que requer a coordenação precisa de muitos eventos diferentes. A formação do olho vertebrado começa no cérebro em desenvolvimento, onde uma parte das células são especificadas como o campo ocular. Essas células evagirão em direção ao ectoderme superficial, dando origem a duas vesículasópticas bilaterais 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. O contato com o ectoderme superficial então induz uma invaginação da vesícula óptica em um copo óptico. O ectoderme superficial dará origem às estruturas anteriores do olho, como a lente e a córnea, enquanto o copo óptico dará origem à retina neural e ao epitélio pigmentadoda retina 1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,12 . Interrupções nesse processo podem levar a defeitos congênitos como microftalmia, anophthalmia e coloboma (MAC). Neste momento, não há opções para corrigir esses defeitos 3,5,6,7,9,10,11,12. Estudos adicionais sobre os mecanismos da morfogênese ocular e os problemas que podem levar ao MAC fornecerão uma base de conhecimento que potencialmente levará a tratamentos. Uma ferramenta poderosa para investigar os comportamentos dinâmicos das células durante o desenvolvimento dos olhos é a imaginação de lapso de tempo, que permite que esse processo seja visualizado e caracterizado in vivo e em tempo real.

O zebrafish (Danio rerio) é um excelente modelo para visualizar o desenvolvimento ocular precoce usando imagens de lapso de tempo. Eles têm um olho vertebrado altamente conservado e possuem a capacidade de desenvolver-se rapidamente e externamente enquanto permanecem opticamentetransparentes 1. O zebrafish fornece um grande recurso para imagens de lapso de tempo devido a essas características que os modelos de mamíferos não têm. Estudos de imagem de lapso de tempo do desenvolvimento dos olhos de zebrafish são muito facilitados pelo uso da linha de zebrafish transgênico Tg(rx3:GFP)13. Rx3 (Retinal homeobox protein 3) é um fator de transcrição essencial para o desenvolvimento dos olhos14. Rx3 é o primeiro dos três genes rx no zebrafish a ser expresso, iniciando sua expressão mid-gastrulation, aproximadamente 8 h pós fertilização (hpf)15,16. O transgene rx3:GFP pode ser visualizado no cérebro em desenvolvimento a partir da fase 1 somite (ss), aproximadamente 10 cvf 15,17,18,19,20. No cérebro em desenvolvimento, a expressão rx3:GFP marca as células do campo ocular único, e o GFP (proteína fluorescente verde) continua a ser expresso através do restante da morfogênese ocular. A imagem de lapso de tempo de alta resolução da expressão rx3:GFP, portanto, nos permite rastrear o campo único ocular através do tempo à medida que se desenvolve na retina 17,18,20.

Estudos de imagem de lapso de tempo do desenvolvimento de zebrafish têm sido realizados principalmente usando microscopia confocal ou Lightsheet. A microscopia confocal é vantajosa na que permite a imagem precisa das amostras ao longo do eixo z e reduz o sinal de fundo fluorescente. No entanto, é limitado pela quantidade de tempo que leva para adquirir uma imagem, rigidez de posição de amostra e sua propensão à fotobleaching e fototoxicidade de amostras vivas. A microscopia de lightsheet é um método ideal para a morfogênese ocular ao longo do tempo devido à sua capacidade de penetrar amostras mais espessas para imagens fluorescentes, maior flexibilidade na orientação da amostra, fotobleaching minimizado e fototoxicidade, e imagem em alta velocidade 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 31. A resolução espacial alcançável com sistemas de microcopia de folha de luz atual é de aproximadamente 250-500 nanômetros (nm). Embora isso não seja significativamente diferente do que pode ser obtido com microscopia confocal, a amostra pode ser livremente girada e imagem de múltiplos ângulos, melhorando a profundidade e a resolução de imagens, e oferecendo uma flexibilidade muito maior para experimentos de imagem de lapso de tempo in vivo do que a plataforma confocal27,32 . Por essas razões, a microscopia Lightsheet está rapidamente se tornando o método favorecido para estudos de imagem de lapso de tempo do desenvolvimento de zebrafish. Este protocolo descreve as etapas de quantificação da oculogênese através da imagem de zebrafish transgênicos Rx3:GFP usando um microscópio Lightsheet33 comercialmente disponível e detalha um pipeline para análise de imagens usando a plataforma de software arivis.

Protocol

Todos os experimentos envolvendo o uso de zebrafish foram realizados de acordo com protocolos estabelecidos pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Kentucky (IACUC). 1. Preparação da amostra Configure um par de zebrafish Tg(Rx3:GFP) em um tanque cruzado fechado na noite anterior à ção. Na manhã seguinte, puxe o portão enquanto as luzes se acendem na instalação de peixes34,35.NOTA: O par de peixes selecionados deve ter entre 4 meses e 2 anos de idade e ser facilmente distinguido como macho ou fêmea com base na forma corporal e coloração35. Verifique as cruzes a cada meia hora para embriões e note que horas os embriões são visualizados pela primeira vez no fundo do tanque cruzado. Transfira os embriões para uma placa de Petri e mantenha os embriões a 28,5 °C por aproximadamente 10 h para desenvolver-se para o estágio 1-2 de somite (ss). Comece a imagem na fase 1-2 somite (ss). Para testar a presença de somites, observe os embriões sob um estereoscópio a 10 hpf e conte o número de somites1.NOTA: Quaisquer embriões que estejam além do estágio de somite único não devem ser usados para este experimento. Dos embriões que estão no estágio único de somite, tela para expressão GFP usando um adaptador de fluorescência em combinação com um estereomicroscope para confirmar a presença do transgene Rx3:GFP. Uma vez identificados 3-5 indivíduos positivos GFP, use fórceps finos para descoriorar os embriões e transferi-los para uma pequena placa de Petri contendo tampão de embrião E3 com uma pipetade vidro 35. Anestesiar os embriões transferindo-os para um tampão de embrião E3 de 0,5 mL (pH 7) contendo 0,168 mg/mL Tricaine (MS222) em um tubo de microcentrifusagem 35,36. Os movimentos musculares espontâneos começam em 17 hpf37. Certifique-se de que os embriões são anestesiados à imagem além deste ponto de tempo. Incorporar os embriões em 1% de baixa temperatura de fusão surgiu em 0,168 mg/mL Tricaine e E3.NOTA: Esta é a concentração ideal de baixa temperatura de fusão agarose para permitir que o embrião seja mantido no lugar, mas permanecer flexível o suficiente para permitir o crescimento do embrião ao longo do curso de tempo de imagem30,31. Prepare uma solução de 10 mL de 2% de baixa temperatura de fusão em buffer E3. Aqueça-o em um forno micro-ondas para dissolver agarose usando intervalos de 15 s, para evitar que a solução ebule por cima. Deixe a solução esfriar o suficiente para segurar sem desconforto, mas não tanto que se solidifice, e não cause danos aos embriões. Uma vez que a agarose esteja suficientemente fria, adicione 0,5 mL aos embriões no tubo de Tricaine em E3 e encobre suavemente a solução e os embriões para misturar. Usando um êmbolo capilar de vidro de 1 mm e politetrafluoroetileno (PTFE), puxe os embriões na solução agarose para o capilar. Certifique-se de puxar um total de 3-5 embriões (embriões múltiplos) para o capilar para aumentar a probabilidade de ter um embrião bem posicionado.NOTA: Devido à natureza redonda dos embriões neste ponto de tempo, é desafiador garantir uma orientação específica no capilar. Idealmente, o corpo do embrião será posicionado lateralmente no capilar, permitindo a maior facilidade de posicionamento dentro do microscópio. Que a agarose solidifique durante um período de 30-60 s à temperatura ambiente. Coloque o capilar em um béquer de 0,168 mg/mL Tricaine no buffer E3 até estar pronto para a imagem (Figura 1A).NOTA: A solução de temperatura de fusão de 2% baixa pode ser permitida para solidificar e, posteriormente, reaquecer em experimentos futuros. Coloque o capilar no suporte da amostra (Figura 1B-F) conforme descrito na etapa 2.5. 2. Configuração zeiss Lightsheet Z.1 Ligue cada componente do microscópio e do computador na seguinte ordem: 1) Sistema, 2) PC, depois 3) Incubação (Figura 2A). Coloque o objetivo de imagem 20x e o objetivo de iluminação 10x na câmara de microscópio. Combine as configurações objetivas na interface Software Zen sob a guia Manter . Deslize a câmara (Figura 2C) para a carcaça da pista (Figura 2B) com a tubulação virada para fora. O tubo se conecta às portas apropriadas à direita, conforme mostrado na Figura 2E. Fixar a linha de extensão à seringa com o mecanismo de trava de luer (Figura 2D); preenchê-lo com Tricaine em E3 e colocá-lo no suporte preso à direita do microscópio35. Conecte a extensão anexada à seringa preenchida com Tricaine em E3 ao canto inferior direito da câmara com o mecanismo de travamento de luer. Empurre o êmbolo para encher a câmara com o tampão Tricaine/E3. Feche a porta para a câmara. Coloque o capilar com a amostra no suporte da amostra capilar. O suporte de amostra capilar é composto por duas mangas de borracha, um disco portador de amostra de metal, uma haste metálica e uma tampa metálica (Figura 1B). Clique na baia metálica no centro do disco de metal (Figura 1C). Coloque as duas rolhas de borracha na bainha, com as fendas voltadas para as extremidades da bainha seguidas do capilar. Deslize o capilar pelo meio das rolhas de borracha. Fixe-o no lugar com a tampa metálica uma vez que o marcador esteja na base da baia metálica (Figura 1D). Coloque o suporte de amostra capilar na parte superior do microscópio, com as marcas brancas alinhadas (Figura 1E,F). Feche a tampa. Clique no botão Localizar capilar na interface de software (Figura 3A). Use o painel de controle ErgoDrive, um dispositivo manual que controla a orientação capilar (Figura 3E), para mover o capilar e posicioná-lo logo acima do objetivo (Figura 3B). Abra a tampa e empurre suavemente o êmbolo até que a seção da agarose contendo o embrião esteja pendurada abaixo do fundo capilar e esteja na frente do objetivo (Figura 3C). Desligue localizar capilar e clique no botão Localizar amostra (Figura 3A). Isso muda a visão da webcam da câmara amostral para o objetivo do microscópio (Figura 3D). Use esta visão para ajustar a posição da amostra com mais precisão. Desligue a amostra de localização (Figura 3A). Mude para a guia Aquisição . Verifique as caixas para Z-Stack e Séries temporentas. Na janela parâmetros do Modo de Aquisição , escolha a configuração de folha de luz lateral dupla e verifique as caixas para Fusão Dupla Lateral Online e Digitalização dinâmica. Na janela Canais , escolha o canal 488, defina a potência laser para 1 e o tempo de exposição a 7,5 ms. Em seguida, clique no botão Contínuo para obter uma visão ao vivo do embrião. Use o painel de controle ErgoDrive para ajustar a posição do embrião até que o campo ocular esteja diretamente voltado para a câmera. Continue ajustando as folhas de luz esquerda e direita nos parâmetros canais até que o campo ocular esteja suficientemente em foco. Defina os parâmetros Z-Stack usando o painel de controle ErgoDrive para mover-se através do plano Z. Defina o primeiro e o último Z-Positions em torno de 500 μm além do último sinal fluorescente detectável. Isso deixa espaço para que o campo ocular permaneça em quadro à medida que o embrião cresce ao longo da sessão de imagem de lapso de tempo. Depois de definir o intervalo do Z-Stack, clique no botão Ideal para definir o tamanho da etapa para 0,477 μm, a configuração ideal. Defina os parâmetros de Incubação verificando a caixa para a Unidade Peltier para manter a temperatura em 28 °C. Na janela Série Time , escolha a frequência e o intervalo de tempo para adquirir imagens. Neste protocolo, os parâmetros foram definidos para imagem a cada 5 minutos, num total de 166 intervalos. Clique no botão Iniciar experiência . Escolha a pasta para salvar o conjunto de imagens. Defina o prefixo da imagem e aperte Salvar para iniciar a imagem.NOTA: O microscópio agora será executado através de cada conjunto de imagens no intervalo especificado. Após a conclusão da sessão de imagem de lapso de tempo, envie o estágio para a posição de carga e remova o suporte da amostra capilar. Retire o suporte da amostra capilar na ordem inversa em que foi montado e use o êmbolo para remover a amostra e o excesso de agarose do capilar. Abra a porta da câmara. Use a seringa para remover o líquido da câmara, desconecte e remova a câmara, depois enxágue com água e ar seco. 3. Análise de imagem Abra o programa de software Arivis Vision4D. Clique em Arquivo e escolha o arquivo Importação. Selecione todos os arquivos .czi da sessão de imagem time-lapse e abra. A próxima janela se abre com as opções sobre como importar os arquivos; selecione pilhas Z como Quadros para encomendar as pilhas z na ordem obtida. Uma vez que os arquivos foram importados, o software salva como um único arquivo .sis. Para especificar o local para que o arquivo seja salvo, selecione a pasta antes de clicar em Importar. Depois que o arquivo é importado, arivis está agora pronto para renderizar um vídeo das imagens de lapso de tempo. Clique no Cubo de Visualização 4D no canto inferior esquerdo e no ícone Escala Bar (Figura 4D-E). Clique no ícone de vídeo para trazer a barra de tarefas do Storyboard para a parte inferior da tela (Figura 4C). Na barra de tarefas do Storyboard , escolha Adicionar sequência de quadro de teclas (Figura 4F). Especifique a duração do vídeo em segundos, desmarque a caixa Criar rotação e verifique a Progressão do Tempo de Uso para incluir os pontos de tempo específicos no vídeo. O software exibe esses parâmetros à direita da barra de tarefas storyboard para quaisquer ajustes a qualquer momento. Salve o Storyboard para aplicar os mesmos parâmetros em vários conjuntos de imagens (Figura 4F). Clique em Export Movie para salvar um vídeo da imagem de lapso de tempo (Figura 4F). Especifique as configurações de exportação de filme, incluindo o nome e o local do arquivo, formato de vídeo (.mp4), resolução de vídeo (1.080 p), framerate (60 FPS) e resolução de dados (1.297 x 1.297 x 784). Adicione os timestamps aqui, se desejar. Uma vez definidos esses parâmetros, escolha Record (Figura 4F). As etapas 3.4 e 3.5 podem ser repetidas com modificação na Etapa 3.4 para criar vídeos de rotação em pontos de tempo específicos. Ao adicionar uma sequência de quadro-chave ao storyboard, verifique a caixa Criar rotação e desmarque a progressão do tempo de uso. Em seguida, siga as mesmas instruções da etapa 3.5. Para tornar uma imagem de alta resolução em qualquer orientação em qualquer ponto de tempo individual, selecione o ícone da câmera no Visualizador 4D para obter uma imagem de alta resolução (Figura 4C). Para construir um pipeline para análise, escolha o ícone Flask para acessar o painel Análise (Figura 4B). No painel Análise , clique no menu suspenso das operações de análise . Como exemplo, o protocolo demonstra abaixo a sequência de operações para um pipeline de análise de volume. Execute ou desfaça cada etapa do gasoduto individualmente para ajustar cada parâmetro (Tabela 1). Clique no triângulo azul no topo do pipeline para permitir que o gasoduto seja executado.NOTA: Isso levará algum tempo dependendo da velocidade do computador. Uma vez que o gasoduto tenha sido otimizado, o gasoduto pode ser exportado e importado para arivis com facilidade e aplicado a vários conjuntos de dados em uma análise em lote. Para acessar a análise do lote, clique em Análise de Lotes na guia Análise . Depois que o oleoduto funciona, uma janela se levanta com todos os objetos encontrados. Acesse manualmente através do ícone Tabela (Figura 4B). Na parte superior desta janela, clique na caixa rotulada Colunas de Recursos para puxar uma lista de recursos que podem fornecer informações sobre o objeto de interesse. Para a análise do volume do campo ocular, essas características incluem Área de Superfície, Volume (Volume, VoxelCount), Intensidades #1 (Média), Atributos (Id, Type) e Time Point (Primeiro). Clique em Exportar os dados para uma planilha.

Representative Results

O conjunto de dados exibido aqui foi visualizado usando o protocolo descrito acima. Um embrião Tg(Rx3:GFP) foi imageado a partir do estágio 1 somite (ss) até 24 hpf, um período total de tempo de 14h, com as imagens adquiridas em intervalos de 5 minutos. A imagem de lapso de tempo permite uma seleção fácil e comparação de qualquer ponto de tempo que mostre um fenótipo de interesse. A Figura 5 demonstra um conjunto de imagens de alta resolução que foram renderizadas a partir do ponto de vista dorsal em pontos de tempo de desenvolvimento selecionados. O pipeline executado no Arivis Vision4D constrói uma máscara que representa o olho em desenvolvimento como identificado pelo sinal fluorescente. Na Figura 5 e vídeos 1-6, a máscara pode ser visualizada em comparação com a renderização fluorescente do olho em desenvolvimento. Além disso, a Tabela 2 exibe os dados de volume do olho em desenvolvimento em cada ponto de imagem. Este conjunto de dados inclui o nome do segmento, id, volume em μm3 e contagem de voxel, a intensidade média de fluorescência do objeto, o ponto de tempo que o objeto foi identificado e a área de superfície do objeto em μm2. É importante notar que quando o campo ocular se separa em duas vesículas ópticas (começando no Ponto de Tempo 64), permanece uma terceira região que é Rx3:GFP positiva no cérebro, o que contribuirá para o hipotálamo38,39,40 (Figura 5D-M). Isso aparece nos dados de volume representados na Tabela 2 (destacado em amarelo a partir do Ponto de Tempo 71) e pode ser facilmente separado das vesículas ópticas, uma vez que é muito menor em volume do que qualquer vesícula óptica. Figura 1: Preparação da amostra. (A) Posicionamento de embriões em um capilar de vidro. A flecha aponta para um embrião no capilar. (B) Peças capilares e capilares de vidro. (C) Suporte capilar parcialmente montado. (D) Suporte capilar totalmente montado. (E) Câmara de montagem de folhas de luz. A seta indicou a linha branca usada para orientar o suporte capilar. (F) Suporte capilar devidamente montado na folha de luz. A seta mostra as linhas brancas correspondentes, indicando a orientação adequada do suporte capilar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Configuração de imagem de folha de luz. (A) Quadro de comutação para ativar a unidade de planilha, computador e incubação. Os números indicam a ordem das operações. (B) Câmara objetiva de folha de luz. (C) Câmara de imagem. (D) Seringa e tubos que serão conectados à câmara de imagem. (E) A câmara de imagem posicionada adequadamente dentro da câmara objetiva com todos os tubos conectados às portas apropriadas à direita. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Posicionamento da amostra. (A) Localizar botões capilares e localizar amostras no Software Zen, conforme indicado pelas setas. (B) O posicionamento sobre o capilar de vidro. A seta indica a borda do capilar de vidro posicionada logo acima da lente do objetivo. (C) A suspensão do embrião além do capilar de vidro. A seta indicou que o embrião suspenso em agarose sob o capilar de vidro em frente à lente do objetivo. (D) Ver o embrião através do objetivo. (E) O painel de controle ErgoDrive. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Ícones importantes para navegar arivis Vison4D. Cada painel tem a função de ícone identificada da esquerda para a direita. (A) Abrir, Salvar, Fechar. (B) Painel de análise, Tabela mostrar objetos, editor de faixa aberta. (C) Copie o conteúdo atual do visualizador como uma imagem na área de transferência, marcadores de alternação, crie uma imagem de alta resolução para a exibição atual, Toggle Storyboard. (D) Show Measure Box, Show Orientation Cross, Show Legend, Show Scale Bar. (E) Show as 2D Viewer, Show as Gallery Viewer, Show as 4D Viewer, Show as Info Viewer, Show as Projection Viewer. F) Atualizar todos os keyframes, adicionar keyframe, adicionar sequência de keyframe, inserir quadro-chave, remover todos os keyframes, exportar filme, carregar storyboard, salvar storyboard, ajustar o tempo de destino de todo o filme, Primeiro Quadro de Chaves, Reproduzir, Pausar, Parar, Último Quadro-Chave. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Imagens de alta resolução e máscaras de campo ocular. (A-M) Um conjunto de imagens de alta resolução que foram renderizadas a partir dos pontos de vista dorsal; (A’-M’) as máscaras de campo ocular para cada ponto de tempo correspondente. Cada conjunto de imagens é anotado no momento em que foi adquirido desde o início da imagem e o estágio de desenvolvimento correspondente em estágio de somite (ss) ou horas de fertilização pós-fertilização (hpf). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Vídeo 1: Vídeo de lapso de tempo do embrião de zebrafish Tg(rx3:GFP) de 1 ss-24 hpf. Por favor, clique aqui para baixar o vídeo (salvar link como). Vídeo 2: Vídeo de lapso de tempo do embrião de zebrafish Tg(rx3:GFP) de 1 ss-24 hpf com o eyefield identificado pelo gasoduto Arivis Vision4D. Por favor, clique aqui para baixar o vídeo (salvar link como).  Vídeo 3: rotação de 360° de um embrião de zebrafish Tg(rx3:GFP) a 1 ss. Por favor, clique aqui para baixar o vídeo (salvar link como).  Vídeo 4: rotação de 360° de uma máscara de campo de embrião de zebrafish Tg(rx3:GFP) a 1 ss. Por favor, clique aqui para baixar o vídeo (salvar link como).  Vídeo 5: rotação de 360° de um embrião de zebrafish Tg(rx3:GFP) a 24 hpf. Por favor, clique aqui para baixar o vídeo (salvar link como).  Vídeo 6: rotação de 360° de uma máscara de campo de embrião de zebrafish Tg(rx3:GFP) a 24 hpf. Por favor, clique aqui para baixar o vídeo (salvar link como).  Tabela 1: gasoduto Arivis Vision4D para análise de volume do campo ocular em desenvolvimento. Clique aqui para baixar esta Tabela. Tabela 2: Área de volume e superfície do campo ocular em desenvolvimento adquirido pela arivis Vision4D. As linhas relativas ao hipotálamo presunçoso são destacadas em amarelo para distingui-las das vesículas ópticas. Clique aqui para baixar esta Tabela.

Discussion

Neste protocolo, o microscópio Lightsheet foi utilizado para realizar imagens de lapso de tempo do desenvolvimento dos olhos e os dados resultantes foram analisados. O conjunto de dados resultante pode fornecer insights valiosos sobre o processo de morfogênese ocular, bem como perturbações a este processo como resultado de mutação genética, exposição a agentes farmacológicos ou outros parâmetros experimentais. Aqui o protocolo demonstrou como esse conjunto de dados pode ser obtido e forneceu um exemplo de como analisar o volume do campo ocular através do desenvolvimento precoce. Esses dados foram reproduziveis e consistentes (menos de 10% de variação no volume) em todas as réplicas biológicas, tendo em vista que pequenas diferenças no estadiamento de embriões antes do início da corrida podem levar a alguma variação nas medições finais de volume.

Deve-se tomar cuidado no posicionamento inicial do embrião no capilar e no posicionamento do embrião incorporado na frente do objetivo. A orientação desempenha um papel importante na prevenção do crescimento do embrião e da mudança da visão do objetivo. Os embriões têm uma forma redonda de 10 hpf, o que torna desafiador garantir uma orientação específica no capilar. Idealmente, o corpo do embrião será posicionado lateralmente no capilar. Carregar vários embriões no capilar aumentará a probabilidade de ter um embrião bem posicionado.

Neste procedimento, o embrião é incorporado em agarose, a fim de suspendê-lo diante dos objetivos de imagem e iluminação. Escolher a concentração correta da baixa temperatura de fusão agarose é fundamental. Uma concentração muito alta irá restringir o embrião e impedi-lo de se desenvolver adequadamente; muito baixa de uma concentração resultará na agarose caindo aos pedaços e não segurando o embrião. A concentração ideal para este protocolo é uma concentração final de 1% de baixa temperatura de fusãoagarose 30,31.

Outro elemento que deve ser levado em consideração é o nível de saturação. À medida que o campo ocular cresce e se diferencia, a força do sinal Rx3:GFP se intensifica. Portanto, ao definir os parâmetros iniciais de imagem, a exposição e a potência do laser devem ser reduzidas para subsaturar a imagem. Isso evitará que a imagem fique supersaturada à medida que o Rx3:GFP ficar mais brilhante com o tempo. Modificações podem ser feitas para corrigir a subsaturação no processamento de imagens, mas a supersaturação não pode ser corrigida após a aquisição das imagens.

Existem algumas modificações adicionais que podem ser feitas neste protocolo que podem ser vantajosas para alguns projetos que não estão descritos neste artigo. Por exemplo, é possível configurar imagens Multiview na configuração de aquisição de imagens. Este parâmetro permitiria que vários embriões em diferentes posições ao longo do eixo y fossem imagens sequencialmente em cada intervalo de tempo. Ao mesmo tempo em que adicionaria complexidade ao conjunto de dados, aumentaria a taxa de coleta de dados. Além disso, em termos de processamento de imagem, é possível quantificar o campo ocular por outros parâmetros. Aqui, descrevemos como quantificar os dados em termos do volume do campo ocular. Alternativamente, um gasoduto poderia ser feito para quantificar e rastrear células individuais ou determinar a taxa de evaginação vesícula óptica.

Como mencionado anteriormente, tanto a microscopia confocal quanto a lightsheet têm sido usadas para realizar estudos de imagem de lapso de tempo de zebrafish. O Lightsheet foi escolhido especificamente para este projeto devido à sua capacidade superior de imagem através de uma amostra espessa (>1 mm), pois é equipada com uma unidade de incubação para manter um ambiente de temperatura ideal para o embrião de zebrafish, e porque sua capacidade de imagem a uma taxa mais rápida do que a microscopia confocal permite a aquisição de imagens nos inúmeros intervalos de tempo necessários para este protocolo sem danos ou fotobleaching do embrião21, 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Também é importante notar que o microscópio Lightsheet está equipado para imagem do sinal de vários fluoroforos. O microscópio Lightsheet utilizado neste estudo tem linhas de excitação a laser de estado sólido em 405, 445, 488, 515, 561 e 638 nm, o que poderia ser útil para imagens de embriões transgênicos expressando mais de um repórter fluorescente transgene.

Embora este protocolo detalhe as instruções para análise de aquisição de imagens especificamente usando o Sistema de Microscópio de Iluminação Dupla Lightsheet Z.1 e o software de análise Arivis Vision4D, existem outros microscópios Lightsheet disponíveis comercialmente feitos por Leica, Olympus e Luxendo, bem como software de análise de imagem por Imaris, que poderiam ser usados para alcançar resultados semelhantes. A seleção de equipamentos e softwares para este protocolo foi determinada pela disponibilidade em nossa instituição.

Em resumo, é esperado que este protocolo forneça um ponto de partida sólido para a realização de imagens com lapso de tempo usando microscopia Lightsheet e para quantificação de imagem do desenvolvimento precoce dos olhos em zebrafish.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

A pesquisa relatada nesta publicação contou com o apoio do Escritório do Diretor dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) sob o Prêmio Número S10OD020067 e pelo prêmio NIH R01EY021769 (a A.C.M.). Somos gratos pela ajuda de Doug Harrison e Jim Begley no Centro de Imagens de Artes & Ciências da Universidade de Kentucky, e de Lucas Vieira Francisco e Evelyn M. Turnbaugh para cuidados especializados com zebrafish.

Materials

60mL Syringe Luer-Lok Tip BD 309653
Agarose, Low Melting Temperature Promega V2111
arivis Vision4D Software arivis https://www.arivis.com/en/imaging-science/arivis-vision4d
Dumoxel N3C Forceps Dumont 0203-N3C-PO
E3 fish buffer (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4)
Glass Capillary – Size 2 (~1mm) Zeiss Black/701904
Heidelberger Extension Line 100cm B. Braun 4097262
Light & Filter Set – Royal Blue Night Sea SFA-LFS-RB
Petri Dish (100 x 15 mm) VWR 25384-302
Stereomicroscope Fluorescence Adapter NightSea
Teflon Tipped Plunger – Size 2 Zeiss #701997
Tg(rx3:GFP) zebrafish This line was established by Rembold et al.13
Tricaine (MS222) Sigma A-5040
Z.1 Lightsheet Zeiss
Zen Software Zeiss https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html
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References

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Petersen, R. A., Morris, A. C. Visualizing Ocular Morphogenesis by Lightsheet Microscopy Using rx3:GFP Transgenic Zebrafish. J. Vis. Exp. (170), e62296, doi:10.3791/62296 (2021).
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