rx3:GFP 형질전환 제브라피쉬를 이용한 라이트시트 현미경으로 안구 형태생성 시각화

제브라피쉬의 사용과 관련된 모든 실험은 켄터키 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)가 수립 한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 1. 시료 준비 이미징이 계획되기 전날 밤 게이트 크로스 탱크에 Tg (Rx3 : GFP) 제브라 피쉬의 짝짓기 쌍을 설정하십시오. 다음날 아침 물고기 시설34,35에서 불이 켜지면 문을 당깁니다.참고 : 선택한 짝짓기 쌍은 생후 4 개월에서 2 세 사이이어야하며 체형과 채색35에 따라 남성 또는 여성으로 쉽게 구별됩니다. 배아에 대한 매 반 시간마다 십자가를 확인하고 배아가 교차 탱크의 바닥에서 처음 시각화되는 시간을 기록하십시오. 배아를 페트리 접시로 옮기고 배아를 약 10시간 동안 28.5°C에서 유지하여 1-2 소마이트 단계(ss)로 발전시킨다. 1-2 소마이트 단계 (ss)에서 이미지를 시작하십시오. 소미트의 존재를 스크리닝하려면 10 hpf의 스테레오스코프로 배아를 관찰하고 소마이트의 수1을 계산하십시오.참고 : 단일 소마이트 단계를 초과하는 배아는이 실험에 사용해서는 안됩니다. 단일 소마이트 단계에 있는 배아 밖에서, Rx3:GFP 전이유전자의 존재를 확인하기 위해 입체현미경과 조합된 형광 어댑터를 사용하여 GFP 발현을 스크리닝한다. 일단 3-5 GFP 양성 개체가 확인되면, 미세한 포셉을 사용하여 배아를 데코리온화하고 유리 피펫35가있는 E3 배아 버퍼가 들어있는 작은 페트리 접시로 옮깁니다. 배아를 미세원심분리 튜브 35,36의 0.168 mg/mL 트리카인(MS222)을 함유하는0.5 mL E3 배아 완충액(pH 7)으로 옮겨 마취시킨다. 자발적인 근육 운동은 17 hpf37만큼 일찍 시작됩니다. 배아가 이 시점을 넘어 이미지를 나타내기 위해 마취되도록 하십시오. 배아를 0.168 mg/mL 트리카인 및 E3의 1% 낮은 용융 온도 아가로스에 내장시킨다.참고 : 이것은 배아가 제자리에 유지되도록 허용하지만 이미징 시간 과정30,31에 걸쳐 배아의 성장을 허용 할만큼 충분히 유연하게 유지되도록 낮은 용융 온도 아가로스의 최적 농도입니다. E3 완충액 중의 2% 저융점 아가로오스의 용액 10 mL를 제조하였다. 전자 레인지에서 가열하여 용액이 끓는 것을 방지하기 위해 15 초 간격으로 아가로스를 용해시킵니다. 용액이 불편 함없이 유지되기에 충분히 차갑지 만 응고되지 않고 배아에 해를 끼치 지 않도록하십시오. 아가로스가 충분히 차가워지면 E3의 Tricaine 튜브에있는 배아에 0.5 mL를 넣고 용액과 배아를 부드럽게 피펫하여 혼합하십시오. 1 mm 유리 모세관과 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 플런저를 사용하여, 아가로스 용액 내의 배아를 모세관으로 끌어올린다. 모세관 안으로 총 3-5개의 배아(다중 배아)를 끌어당겨 잘 배치된 배아를 가질 가능성을 높여야 합니다.참고 :이 시점에서 배아의 둥근 특성으로 인해 모세 혈관에서 특정 방향을 보장하는 것은 어렵습니다. 이상적으로, 배아의 몸체는 모세관에 옆으로 위치하여 현미경 내에서 가장 쉽게 배치 할 수 있습니다. 아가로스가 실온에서 30-60 초에 걸쳐 응고되도록하십시오. 모세관 0.168mg/mL 트리카인의 비이커에 E3 버퍼에 넣고 이미지를 촬영할 준비가 될 때까지 놓습니다(그림 1A).참고 : 초과 2 % 낮은 용융 온도 아가로스 용액은 향후 실험에서 응고 및 이후에 재가열되도록 허용 될 수 있습니다. 단계 2.5에 설명된 바와 같이 모세관을 샘플 홀더(도 1B-F) 내로 놓는다. 2. 자이스 라이트 시트 Z.1 설정 현미경과 컴퓨터의 각 구성 요소를 다음 순서로 켭니다: 1) 시스템, 2) PC, 3) 인큐베이션(그림 2A). 20x 이미징 대물렌즈와 10x 조명 조준을 현미경 챔버에 넣습니다. 유지 관리 탭의 Zen Software 인터페이스의 목표 설정을 일치시킵니다. 챔버(그림 2C)를 튜브가 바깥쪽을 향하도록 트랙(그림 2B)의 하우징으로 밀어 넣습니다. 튜브는 그림 2E와 같이 오른쪽에 있는 적절한 포트에 연결됩니다. 루어-락 기구를 사용하여 주사기에 연장선을 부착한다(그림 2D); E3의 Tricaine으로 채우고 현미경35의 오른쪽에 부착 된 홀더에 놓습니다. E3의 Tricaine으로 채워진 주사기에 부착 된 연장을 루어 잠금 메커니즘으로 챔버의 오른쪽 하단에 연결하십시오. 플런저를 밀어 챔버를 Tricaine/E3 버퍼로 채웁니다. 챔버의 문을 닫으십시오. 샘플이 있는 모세관을 모세관 샘플 홀더에 넣습니다. 모세관 샘플 홀더는 두 개의 고무 슬리브, 금속 샘플 홀더 디스크, 금속 스템 및 금속 캡으로 구성됩니다(그림 1B). 금속 디스크의 중앙으로 금속 덮개를 클릭합니다(그림 1C). 두 개의 고무 마개를 칼집에 넣고 슬릿이 칼집 끝을 향하게하고 모세관이 뒤 따른다. 고무 마개 중앙을 통해 모세관을 밀어 넣습니다. 마커가 금속 덮개의 바닥에 있으면 금속 뚜껑을 제자리에 고정합니다(그림 1D). 모세관 샘플 홀더를 현미경 상단에 놓고 흰색 표시가 정렬되어 있습니다(그림 1E,F). 뚜껑을 닫습니다. 소프트웨어 인터페이스에서 모세관 찾기 단추를 클릭합니다(그림 3A). 모세관 방향을 제어하는 수동 장치인 ErgoDrive 제어판(그림 3E)을 사용하여 모세관을 이동하고 목표 바로 위에 배치합니다(그림 3B). 뚜껑을 열고, 배아를 포함하는 아가로오스의 섹션이 모세관 바닥 아래에 매달려 목표물 앞에 있을 때까지 플런저를 부드럽게 밀었다(도 3C). 모세관 찾기를 끄고 샘플 찾기 단추를 클릭합니다(그림 3A). 이렇게 하면 뷰가 샘플 챔버의 웹캠에서 현미경 대물로 전환됩니다(그림 3D). 이 뷰를 사용하여 샘플의 위치를 보다 정확하게 조정할 수 있습니다. 샘플 찾기를 끕니다(그림 3A). 획득 탭으로 전환합니다. Z-스택 및 시계열 확인란을 선택합니다. 획득 모드 매개변수 창에서 듀얼 사이드 라이트시트 설정을 선택하고 온라인 듀얼 사이드 퓨전 및 피벗 스캔 확인란을 선택합니다. 채널 창에서 488 채널을 선택하고 레이저 파워를 1로 설정하고 노출 시간을 7.5ms로 설정합니다. 그런 다음 연속 버튼을 클릭하여 배아의 라이브 뷰를 얻으십시오. ErgoDrive 컨트롤 패널을 사용하여 안구장이 카메라를 직접 향할 때까지 배아의 위치를 조정합니다. 눈 필드에 충분히 초점이 맞춰질 때까지 채널 매개변수의 왼쪽 및 오른쪽 라이트시트를 계속 조정합니다. ErgoDrive 제어판을 사용하여 Z-Stack 매개변수를 설정하여 Z- 평면을 통과합니다. 첫 번째 및 마지막 Z-위치를 마지막으로 검출 가능한 형광 신호를 넘어 약 500 μm로 설정하십시오. 이것은 배아가 타임랩스 이미징 세션 동안 성장함에 따라 안구장이 프레임에 남아있을 수있는 공간을 남겨 둡니다. Z-Stack의 범위를 설정 한 후 최적 버튼을 클릭하여 스텝 크기를 최 적 설정 인 0.477 μm로 설정하십시오. 온도를 28°C로 유지하기 위해 펠티에 유닛의 박스를 체크하여 인큐베이션 파라미터를 설정한다. 시계열 창에서 이미지를 획득할 빈도와 시간 간격을 선택합니다. 이 프로토콜에서, 파라미터들은 총 166개의 간격 동안 매 5분마다 이미지화되도록 설정되었다. 실험 시작 단추를 클릭합니다. 이미지 세트를 저장할 폴더를 선택합니다. 이미지 접두사를 설정하고 저장을 눌러 이미징을 시작합니다.참고: 이제 현미경은 지정된 간격으로 설정된 각 이미지를 통해 실행됩니다. 타임랩스 이미징 세션이 완료된 후, 스테이지를 로드 위치로 보내고, 모세관 샘플 홀더를 제거한다. 모세관 샘플 홀더를 역순으로 떼어내어 함께 넣고, 플런저를 사용하여 모세관으로부터 샘플 및 과량의 아가로스를 제거하였다. 챔버 도어를 엽니다. 주사기를 사용하여 챔버에서 챔버 액체를 제거하고 챔버를 분리 및 제거한 다음 물로 헹구고 공기 건조하십시오. 3. 이미지 분석 arivis Vision4D 소프트웨어 프로그램을 엽니다. 파일을 클릭 한 다음 파일 가져 오기를 선택하십시오. 타임랩스 이미징 세션에서 모든 .czi 파일을 선택하고 엽니다. 다음 창이 열리고 파일을 가져오는 방법에 대한 옵션이 표시됩니다. Z-스택을 프레임으로 선택하여 Z-스택을 얻은 순서대로 정렬합니다. 파일을 가져오면 소프트웨어는 단일 .sis 파일로 저장됩니다. 저장할 파일의 위치를 지정하려면 가져오기를 클릭하기 전에 폴더를 선택합니다. 파일을 가져온 후 arivis는 이제 타임랩스 이미지의 비디오를 렌더링할 준비가 되었습니다. 왼쪽 하단에 있는 4D 뷰어 큐브와 배율 표시줄 아이콘을 클릭합니다(그림 4D-E). 비디오 아이콘을 클릭하여 스토리보드 작업 표시줄을 화면 아래쪽으로 가져옵니다(그림 4C). 스토리보드 작업 표시줄에서 키프레임 시퀀스 추가를 선택합니다(그림 4F). 비디오의 지속 시간(초)을 지정하고, 회전 만들기 상자의 선택을 취소하고, 시간 진행률 사용을 선택하여 비디오에 특정 시점을 포함시킵니다. 이 소프트웨어는 언제든지 조정할 수 있도록 스토리 보드 작업 표시 줄의 오른쪽에 이러한 매개 변수를 표시합니다. 스토리보드를 저장하여 동일한 매개 변수를 여러 이미지 세트에 적용합니다(그림 4F). 동영상 내보내기를 클릭하여 타임랩스 이미징 비디오를 저장합니다(그림 4F). 파일 이름 및 위치, 비디오 형식(.mp4), 비디오 해상도(1,080p), 프레임 속도(60FPS) 및 데이터 해상도(1,297 x 1,297 x 784)를 포함한 동영상 내보내기 설정을 지정합니다. 원하는 경우 여기에 타임스탬프를 추가합니다. 이러한 매개 변수가 설정되면 기록을 선택합니다(그림 4F). 3.4단계와 3.5단계를 반복하여 3.4단계를 반복하여 특정 시점에 회전 비디오를 만들 수 있습니다. 스토리보드에 키프레임 시퀀스를 추가할 때 회전 만들기 상자를 선택하고 시간 진행률 사용의 선택을 취소합니다. 그런 다음 3.5단계와 동일한 지침을 따릅니다. 개별 시점에서 임의의 방향으로 고해상도 이미지를 렌더링하려면 4D 뷰어에서 카메라 아이콘을 선택하여 고해상도 이미지를 가져옵니다(그림 4C). 분석용 파이프라인을 구축하려면 플라스크 아이콘을 선택하여 [분석 ] 패널에 액세스합니다(그림 4B). [분석 ] 패널에서 [분석 작업 ] 드롭다운 메뉴를 클릭합니다. 예를 들어, 프로토콜은 볼륨 분석 파이프라인에 대한 작업 시퀀스를 아래에 보여 줍니다. 파이프라인의 각 단계를 개별적으로 실행하거나 실행 취소하여 각 매개 변수를 미세 조정합니다(표 1). 파이프라인 위쪽에 있는 파란색 삼각형을 클릭하여 파이프라인을 실행할 수 있도록 합니다.참고: 컴퓨터 속도에 따라 다소 시간이 걸립니다. 파이프라인이 최적화되면 파이프라인을 쉽게 내보내고 아리비스로 가져와서 배치 분석에서 여러 데이터 세트에 적용할 수 있습니다. 배치 분석에 액세스하려면 분석 탭에서 배치 분석을 클릭합니다. 파이프라인이 실행되면 발견된 모든 개체가 있는 창이 열립니다. 테이블 아이콘을 통해 수동으로 액세스합니다(그림 4B). 이 창의 맨 위에서 피쳐 열(Feature Column )이라는 상자를 클릭하여 관심 대상에 대한 정보를 제공할 수 있는 기능 목록을 가져옵니다. 안구 필드 볼륨 분석의 경우 이러한 기능에는 표면적, 볼륨(볼륨, VoxelCount), 강도 #1(평균), 속성(Id, 유형) 및 시점(첫 번째)이 포함됩니다. 내보내기 를 클릭하여 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.