rx3:GFPトランスジェニックゼブラフィッシュを用いたライトシート顕微鏡による眼の形態形成の可視化

ゼブラフィッシュの使用を含むすべての実験は、ケンタッキー大学機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって確立されたプロトコルに従って実施された。 1. サンプル調製 イメージングが計画される前夜に、ゲート付きのクロスタンクにTg(Rx3:GFP)ゼブラフィッシュの交配ペアを設定します。翌朝、魚類施設34,35の明かりが灯ると門を引く。注:選択された魚の交配ペアは、生後4ヶ月から2歳の間である必要があり、体型および着色35に基づいて男性または女性として容易に区別される。 30分ごとに胚の十字架をチェックし、胚が最初にクロスタンクの底に視覚化される時間を書き留めます。胚をシャーレに移し、胚を28.5°Cで約10時間維持して、1〜2ソマイト段階(ss)に発達させる。1-2ソマイト段階(ss)でイメージを開始します。 ソマイトの存在をスクリーニングするには、10hpfの立体鏡の下で胚を観察し、ソマイトの数を数えます1。注:単一のソマイト段階を超える胚は、この実験に使用しないでください。 単一ソマイト段階にある胚のうち、実体顕微鏡と組み合わせて蛍光アダプターを用いてGFP発現をスクリーニングし、Rx3:GFP導入遺伝子の存在を確認した。3〜5人のGFP陽性個体が同定されたら、微細な鉗子を使用して胚を脱絨毛し、ガラスピペット35を用いてE3胚緩衝液を含む小さなペトリ皿に移す。 微量遠心チューブ35,36内の0.168 mg/mLトリカイン(MS222)を含む0.5 mL E3胚バッファー(pH 7)に移植することによって胚を麻酔する。自発的な筋肉の動きは、早くも17 hpf37で始まります。胚がこの時点を超えて画像化されるように麻酔をかけるようにします。 胚を0.168 mg/mLのトリカインおよびE3中の1%低融解温度アガロースに埋め込む。注:これは、胚を所定の位置に保持することを可能にするが、画像化時間経過30、31にわたって胚の成長を可能にするのに十分な柔軟性を維持するための、低融解温度アガロースの最適濃度である。 E3緩衝液中の2%低融点アガロースの10mL溶液を調製する。電子レンジで加熱し、15秒間隔でアガロースを溶かし、溶液が沸騰するのを防ぎます。溶液を不快感なく保持するのに十分なほど冷やすが、固化させず、胚に害を及ぼさないようにする。アガロースが十分に冷えたら、E3のトリカインのチューブ内の胚に0.5mLを加え、溶液と胚を穏やかにピペッティングして混合する。 1mmガラスキャピラリーとポリテトラフルオロエチレン(PTFE)プランジャーを使用して、アガロース溶液中の胚をキャピラリー内に引き上げる。合計3〜5個の胚(複数の胚)を毛細血管に引き込んで、良好な位置にある胚を有する可能性を高めるようにしてください。注:この時点での胚の丸い性質のために、毛細血管内の特定の向きを保証することは困難である。理想的には、胚の体は毛細血管内で横方向に配置され、顕微鏡内で最も容易な位置決めを可能にする。 アガロースを室温で30〜60秒かけて固化させる。毛細血管をE3バッファー中の0.168 mg/mLトリカインのビーカーに入れ、画像化の準備が整うまで入れます(図1A)。注:過剰の2%の低融点アガロース溶液を固化させ、その後将来の実験で再加熱することができる。 ステップ2.5の説明に従って、キャピラリーをサンプルホルダー(図1B-F)に置きます。 2. ツァイスライトシートZ.1セットアップ 顕微鏡とコンピュータの各コンポーネントを次の順序でオンにします:1)システム、2)PC、3)インキュベーション(図2A)。 20倍のイメージング対物レンズと10倍の照明対物レンズを顕微鏡チャンバーに入れます。[ メンテナンス ]タブの[Zen Software]インターフェイスの目的設定と一致します。 チャンバー(図2C)をトラック上のハウジング(図2B)にスライドさせ、チューブを外側に向けます。チューブは、 図2Eに示すように、右側の適切なポートに接続します。 延長線をルアーロック機構でシリンジに取り付けます(図2D)。E3にトリカインを充填し、顕微鏡35の右側に取り付けたホルダーに入れる。E3のトリカインを充填したシリンジに取り付けられたエクステンションを、ルアーロック機構でチャンバーの右下に接続します。プランジャーを押してチャンバーをトリカイン/E3バッファーで満たします。部屋のドアを閉めます。 サンプルを含むキャピラリーをキャピラリーサンプルホルダーに入れます。キャピラリーサンプルホルダーは、2つのゴムスリーブ、金属サンプルホルダーディスク、金属ステム、および金属キャップで構成されています(図1B)。金属製のシースをクリックして、金属製のディスクの中央に差し込みます(図1C)。2つのゴム栓をシースに入れ、スリットがシースの端に向いていて、その後に毛細血管が続きます。キャピラリーをゴム栓の中央にスライドさせます。マーカーが金属シースの基部に着いたら、金属製のキャップで所定の位置に固定します(図1D)。 キャピラリーサンプルホルダーを顕微鏡の上部に置き、白いマークを合わせます(図1E、F)。蓋を閉めます。 ソフトウェアインタフェースの [キャピラリーの位置を特定 ]ボタンをクリックします(図3A)。キャピラリーの向きを制御する手動デバイスであるErgoDriveコントロールパネル(図3E)を使用して、キャピラリーを動かし、対物レンズのすぐ上に配置します(図3B)。 蓋を開き、胚を含むアガロースの断面が毛細血管底部の下に垂れ下がって対物レンズの前に来るまでプランジャーを静かに押します(図3C)。 [ キャピラリーの検索 ]をオフにして、[ サンプルの位置を特定] ボタンをクリックします(図3A)。これにより、サンプルチャンバーのウェブカメラから顕微鏡対物レンズにビューが切り替わります(図3D)。このビューを使用して、サンプルの位置をより正確に調整します。「 サンプルを探す」 をオフにします(図3A)。 「 取得」 タブに切り替えます。「 Z スタック 」と「 時系列」のチェックボックスをオンにします。 「集録モードパラメータ」ウィンドウで、「デュアルサイドライトシート」設定を選択し、「オンラインデュアルサイドフュージョン」および「ピボットスキャン」のチェックボックスをオンにします。 [チャンネル]ウィンドウで、[488チャンネル]を選択し、レーザー出力を1、露光時間を7.5ミリ秒に設定します。 次に、[ 連続] ボタンをクリックして、胚のライブビューを取得します。ErgoDriveコントロールパネルを使用して、眼球がカメラに直接向くまで胚の位置を調整します。[チャンネル]パラメータの左右のライトシートを、目のフィールドが十分に焦点を合わせるまで調整し続けます。 ErgoDrive コントロール パネルを使用して Z スタック パラメータを設定し、Z 平面内を移動します。最初と最後のZポジションを、最後の検出可能な蛍光シグナルから約500μm超えて設定します。これにより、タイムラプスイメージングセッション全体を通して胚が成長するにつれて、眼野がフレーム内にとどまる余地が残る。Zスタックの範囲を設定した後、最適ボタンをクリックしてステップサイズを最適な設定である0.477μmに設定します。 ペルチェユニットのチェックボックスをオンにして インキュベーション パラメータを設定し、温度を28°Cに保ちます。 [時系列] ウィンドウで、画像を取得する頻度と時間間隔を選択します。このプロトコルでは、パラメータは5分ごとに合計166の間隔で画像化するように設定されました。 [ 実験の開始] ボタンをクリックします。イメージセットを保存するフォルダを選択します。画像接頭辞を設定し、[ 保存] をクリックしてイメージングを開始します。メモ: 顕微鏡は、指定された間隔で各画像セットを駆け抜けます。 タイムラプスイメージングセッションが完了したら、ステージを負荷位置に送り、キャピラリーサンプルホルダーを取り外します。キャピラリーサンプルホルダーを一緒に置いたのと逆の順序で分解し、プランジャーを使用してサンプルと余分なアガロースをキャピラリーから取り出します。部屋のドアを開けます。シリンジを使用してチャンバーからチャンバー液体を取り出し、チャンバーを取り外して取り外してから、水ですすぎ、空気乾燥させます。 3. 画像解析 arivis Vision4Dソフトウェアプログラムを開きます。 「 ファイル」をクリックし、「 ファイルのインポート」を選択します。タイムラプスイメージングセッションからすべての.csiファイルを選択し、開きます。次のウィンドウが開き、ファイルのインポート方法に関するオプションが表示されます。 「フレーム」として「Z スタック」 を選択して、Z スタックを取得した順序で順序付けします。ファイルがインポートされると、ソフトウェアは単一の.sisファイルとして保存します。保存するファイルの場所を指定するには、[ インポート] をクリックする前にフォルダを選択します。 ファイルがインポートされると、arivis はタイムラプス画像のビデオをレンダリングする準備が整いました。左下隅にある4D ビューアキューブとスケールバーアイコンをクリックします(図4D-E)。ビデオアイコンをクリックして、ストーリーボードタスクバーを画面の一番下に移動します(図4C)。 ストーリーボードタスクバーで、「キーフレームシーケンスを追加」を選択します(図4F)。ビデオの継続時間を秒単位で指定し、[回転を作成] ボックスのチェックを外し、[時間の進行状況を使用] をオンにして、ビデオに特定のタイムポイントを含めます。ソフトウェアは、これらのパラメータをストーリーボードタスクバーの右側に表示し、いつでも調整できます。ストーリーボードを保存して、同じパラメーターを複数のイメージ セットに適用します (図 4F)。 [ムービーのエクスポート]をクリックして、タイムラプスイメージングのビデオを保存します(図4F)。ファイル名と場所、ビデオ形式(.mp4)、ビデオ解像度(1,080 p)、フレームレート(60 FPS)、データ解像度(1,297 x 1,297 x 784)など、ムービーの書き出し設定を指定します。必要に応じて、ここにタイムスタンプを追加します。これらのパラメータを設定したら、[記録]を選択します(図4F)。 ステップ3.4と3.5を繰り返して、ステップ3.4に変更して、特定の時点で回転ビデオを作成できます。ストーリーボードにキーフレームシーケンスを追加するときは、「 回転を作成 」ボックスにチェックを入れ、「 時間の進行を使用」のチェックを外します。次に、ステップ 3.5 と同じ指示に従います。 個々の時点で任意の向きで高解像度の画像をレンダリングするには、4D Viewerでカメラ アイコンを選択して高解像度の画像を取得します(図4C)。 分析用のパイプラインを作成するには、[フラスコ] アイコンを選択して [分析] パネルにアクセスします (図 4B)。[解析]パネルで、[解析操作]ドロップダウンメニューをクリックします。例として、このプロトコルは、ボリューム分析パイプラインの一連の操作を以下に示します。パイプラインの各ステップを個別に実行または元に戻して、各パラメーターを微調整します (表 1)。 パイプラインの上部にある青い三角形をクリックして、パイプラインを実行できるようにします。メモ: コンピュータの速度によっては、この処理に時間がかかります。パイプラインが最適化されると、パイプラインを簡単に arivis にエクスポートおよびインポートし、バッチ分析で複数のデータセットに適用できます。 バッチ分析にアクセスするには、[分析] タブの [バッチ分析] をクリックします。 パイプラインの実行後、ウィンドウがプルアップされ、見つかったすべてのオブジェクトが表示されます。 テーブル アイコンから手動でアクセスします(図4B)。このウィンドウの上部にある [ フィーチャ列] というラベルの付いたボックスをクリックして、目的のオブジェクトに関する情報を提供できるフィーチャのリストを表示します。眼球体積分析では、これらの機能には、表面積、体積 (体積、ボクセルカウント)、強度 #1 (平均)、属性 (Id、タイプ)、およびタイム ポイント (最初) が含まれます。[エクスポート ] をクリックして、データをスプレッドシートにエクスポートします。