Qui, viene fornito un protocollo per l’imaging time-lapse della morfogenesi oculare utilizzando un microscopio lightsheet disponibile in commercio e una workstation di elaborazione delle immagini per analizzare i dati risultanti. Questo protocollo descrive in dettaglio le procedure per l’anestesia embrionale, l’incorporamento nell’agarosio a bassa temperatura di fusione, la sospensione nella camera di imaging, l’impostazione dei parametri di imaging e infine l’analisi dei dati di imaging utilizzando un software di analisi delle immagini.
Lo sviluppo dell’occhio dei vertebrati è un processo complesso che inizia verso la fine della gastrulazione embrionale e richiede il coordinamento preciso della migrazione, proliferazione e differenziazione cellulare. L’immaginazione time-lapse offre una visione unica del comportamento delle cellule durante lo sviluppo dell’occhio perché ci consente di visualizzare l’oculogenesi in vivo. I pesci zebra sono un modello eccellente per visualizzare questo processo grazie al loro occhio vertebrato altamente conservato e alla loro capacità di svilupparsi rapidamente ed esternamente pur rimanendo otticamente trasparenti. Gli studi di imaging time-lapse sullo sviluppo dell’occhio di zebrafish sono notevolmente facilitati dall’uso della linea transgenica di zebrafish Tg (rx3: GFP). Nel proencefalo in via di sviluppo, l’espressione rx3: GFP segna le cellule del singolo campo oculare e la GFP continua ad essere espressa mentre il campo oculare evagina per formare una vescicola ottica, che poi si invagina per formare una coppa ottica. L’imaging time lapse ad alta risoluzione dell’espressione rx3: GFP, quindi, ci consente di tracciare l’occhio primordium nel tempo mentre si sviluppa nella retina. La microscopia Lightsheet è un metodo ideale per visualizzare la morfogenesi oculare nel tempo grazie alla sua capacità di penetrare campioni più spessi per l’imaging fluorescente, ridurre al minimo il fotosbiancamento e la fototossicità e l’immagine ad alta velocità. Qui, viene fornito un protocollo per l’imaging time-lapse della morfogenesi oculare utilizzando un microscopio lightsheet disponibile in commercio e una workstation di elaborazione delle immagini per analizzare i dati risultanti. Questo protocollo descrive in dettaglio le procedure per l’anestesia embrionale, l’incorporamento nell’agarosio a bassa temperatura di fusione, la sospensione nella camera di imaging, l’impostazione dei parametri di imaging e infine l’analisi dei dati di imaging utilizzando un software di analisi delle immagini. Il set di dati risultante può fornire preziose informazioni sul processo di morfogenesi oculare, nonché perturbazioni a questo processo a seguito di mutazioni genetiche, esposizione ad agenti farmacologici o altre manipolazioni sperimentali.
Lo sviluppo embrionale è un processo complesso che richiede il coordinamento preciso di molti eventi diversi. La formazione dell’occhio vertebrato inizia nel proencefalo in via di sviluppo, dove una parte delle cellule è specificata come campo oculare. Queste cellule evaginano verso l’ectoderma superficiale, dando origine a due vescicole ottiche bilaterali 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Il contatto con l’ectoderma superficiale induce quindi un’invaginazione della vescicola ottica in una tazza ottica. L’ectoderma superficiale darà origine alle strutture anteriori dell’occhio, come la lente e la cornea, mentre la coppa ottica darà origine alla retina neurale e all’epitelio pigmentato retinico 1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,12 . Le interruzioni in questo processo possono portare a difetti congeniti come microftalmia, anoftalmia e coloboma (MAC). Al momento, non ci sono opzioni per correggere questi difetti 3,5,6,7,9,10,11,12. Ulteriori studi sui meccanismi della morfogenesi oculare e sui problemi che possono portare alla MAC forniranno una base di conoscenza che potenzialmente porterà a trattamenti. Un potente strumento per indagare i comportamenti dinamici delle cellule durante lo sviluppo degli occhi è l’immaginazione time-lapse, che consente di visualizzare e caratterizzare questo processo in vivo e in tempo reale.
I pesci zebra (Danio rerio) sono un modello eccellente per visualizzare lo sviluppo oculare precoce utilizzando l’imaging time-lapse. Hanno un occhio vertebrato altamente conservato e possiedono la capacità di svilupparsi rapidamente ed esternamente pur rimanendo otticamente trasparenti1. I pesci zebra forniscono una grande risorsa per l’imaging time-lapse a causa di queste caratteristiche che mancano ai modelli di mammiferi. Gli studi di imaging time-lapse sullo sviluppo dell’occhio di zebrafish sono notevolmente facilitati dall’uso della linea transgenica di zebrafish Tg(rx3:GFP)13. Rx3 (Retinal homeobox protein 3) è un fattore di trascrizione essenziale per lo sviluppo dell’occhio14. Rx3 è il primo dei tre geni rx nel pesce zebra ad essere espresso, iniziando la sua espressione a metà gastrulazione, circa 8 ore dopo la fecondazione (hpf)15,16. Il transgene rx3:GFP può essere visualizzato nel proencefalo in via di sviluppo a partire dallo stadio 1 somite (ss), circa 10 hpf 15,17,18,19,20. Nel proencefalo in via di sviluppo, l’espressione rx3:GFP segna le cellule del singolo campo oculare e la GFP (proteina fluorescente verde) continua ad essere espressa attraverso il resto della morfogenesi oculare. L’imaging time lapse ad alta risoluzione dell’espressione rx3:GFP, quindi, ci consente di tracciare il singolo campo oculare nel tempo mentre si sviluppa nella retina 17,18,20.
Gli studi di imaging time-lapse sullo sviluppo del pesce zebra sono stati eseguiti principalmente utilizzando la microscopia confocale o Lightsheet. La microscopia confocale è vantaggiosa in quanto consente l’imaging preciso dei campioni lungo l’asse z e riduce il segnale di fondo fluorescente. Tuttavia, è limitato dalla quantità di tempo necessaria per acquisire un’immagine, dalla rigidità della posizione del campione e dalla sua propensione verso il fotosbiancamento e la fototossicità dei campioni vivi. La microscopia Lightsheet è un metodo ideale per visualizzare la morfogenesi oculare nel tempo grazie alla sua capacità di penetrare campioni più spessi per l’imaging fluorescente, una maggiore flessibilità nell’orientamento del campione, fotosbiancamento e fototossicità ridotti al minimo e l’imaging ad alta velocità 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 ,31. La risoluzione spaziale ottenibile con gli attuali sistemi di microscopia a foglio luminoso è di circa 250-500 nanometri (nm). Sebbene questo non sia significativamente diverso da quello che si può ottenere con la microscopia confocale, il campione può essere ruotato liberamente e ripreso da più angolazioni, migliorando sia la profondità che la risoluzione dell’immagine e offrendo una flessibilità molto maggiore per gli esperimenti di imaging time lapse in vivo rispetto alla piattaforma confocale27,32 . Per questi motivi, la microscopia Lightsheet sta rapidamente diventando il metodo preferito per gli studi di imaging time-lapse dello sviluppo del pesce zebra. Questo protocollo descrive le fasi di quantificazione dell’oculogenesi attraverso l’imaging del pesce zebra transgenico Rx3:GFP utilizzando un microscopio Lightsheet33 disponibile in commercio e descrive in dettaglio una pipeline per l’analisi delle immagini utilizzando la piattaforma software arivis.
In questo protocollo, il microscopio Lightsheet è stato utilizzato per eseguire l’imaging time-lapse dello sviluppo oculare e sono stati analizzati i dati risultanti. Il set di dati risultante può fornire preziose informazioni sul processo di morfogenesi oculare, nonché perturbazioni a questo processo a seguito di mutazioni genetiche, esposizione ad agenti farmacologici o altri parametri sperimentali. Qui il protocollo ha dimostrato come questo set di dati può essere ottenuto e ha fornito un esempio di come analizzare il volume del campo oculare attraverso lo sviluppo iniziale. Questi dati sono risultati riproducibili e coerenti (variazione inferiore al 10% in volume) tra le repliche biologiche, tenendo presente che lievi differenze nella stadiazione dell’embrione prima dell’inizio della corsa possono portare a qualche variazione nelle misurazioni del volume finale.
Bisogna fare attenzione nel posizionamento iniziale dell’embrione nel capillare e nel posizionare l’embrione incorporato davanti all’obiettivo. L’orientamento svolge un ruolo importante nell’impedire all’embrione di crescere e allontanarsi dalla visione dell’obiettivo. Gli embrioni hanno una forma rotonda a 10 hpf, il che rende difficile garantire un orientamento specifico nel capillare. Idealmente, il corpo dell’embrione sarà posizionato lateralmente nel capillare. Caricare più embrioni nel capillare aumenterà la probabilità di avere un embrione ben posizionato.
In questa procedura, l’embrione viene incorporato nell’agarosio per sospenderlo di fronte agli obiettivi di imaging e illuminazione. La scelta della corretta concentrazione dell’agarosio a bassa temperatura di fusione è fondamentale. Una concentrazione troppo alta restringerà l’embrione e gli impedirà di svilupparsi correttamente; una concentrazione troppo bassa farà sì che l’agarosi cada a pezzi e non tenga l’embrione. La concentrazione ottimale per questo protocollo è una concentrazione finale dell’1% a bassa temperatura di fusione agarosio30,31.
Un altro elemento che dovrebbe essere preso in considerazione è il livello di saturazione. Man mano che il campo oculare cresce e si differenzia, la forza del segnale Rx3:GFP si intensifica. Pertanto, quando si impostano i parametri di imaging iniziali, l’esposizione e la potenza del laser devono essere ridotte per sottosaturare l’immagine. Ciò impedirà all’immagine di diventare sovrasatura man mano che la Rx3:GFP diventa più luminosa nel tempo. È possibile apportare modifiche per correggere la sottosaturazione nell’elaborazione delle immagini, ma la sovrasaturazione non può essere corretta dopo che le immagini sono state acquisite.
Ci sono alcune modifiche aggiuntive che possono essere apportate a questo protocollo che possono essere vantaggiose per alcuni progetti che non sono descritti in questo documento. Ad esempio, è possibile impostare l’imaging Multiview nella configurazione dell’acquisizione delle immagini. Questo parametro consentirebbe di visualizzare sequenzialmente più embrioni in posizioni diverse lungo l’asse y ad ogni intervallo di tempo. Pur aggiungendo complessità al set di dati, aumenterebbe la velocità di raccolta dei dati. Inoltre, in termini di elaborazione delle immagini, è possibile quantificare il campo oculare in base ad altri parametri. Qui, abbiamo descritto come quantificare i dati in termini di volume del campo oculare. In alternativa, potrebbe essere fatta una pipeline per quantificare e tracciare le singole cellule o determinare il tasso di evaginazione delle vescicole ottiche.
Come accennato in precedenza, sia la microscopia confocale che lightsheet sono state utilizzate per eseguire studi di imaging time-lapse del pesce zebra. Lightsheet è stato scelto appositamente per questo progetto per la sua superiore capacità di ripresa attraverso un campione spesso (>1 mm), perché è dotato di un’unità di incubazione per mantenere un ambiente di temperatura ideale per l’embrione di zebrafish e perché la sua capacità di visualizzare a una velocità più veloce rispetto alla microscopia confocale consente l’acquisizione di immagini ai numerosi intervalli di tempo richiesti per questo protocollo senza danni di accompagnamento o fotosbiancamento dell’embrione21, 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. È anche importante notare che il microscopio Lightsheet è attrezzato per visualizzare il segnale da più fluorofori. Il microscopio Lightsheet utilizzato in questo studio ha linee di eccitazione laser a stato solido a 405, 445, 488, 515, 561 e 638 nm, che potrebbero essere utili per l’imaging di embrioni transgenici che esprimono più di un transgene reporter fluorescente.
Mentre questo protocollo descrive le istruzioni per l’analisi dell’acquisizione delle immagini in particolare utilizzando il sistema di microscopi a doppia illuminazione Lightsheet Z.1 e il software di analisi arivis Vision4D, ci sono altri microscopi Lightsheet disponibili in commercio realizzati da Leica, Olympus e Luxendo, nonché il software di analisi delle immagini di Imaris, che potrebbero essere utilizzati per ottenere risultati simili. La selezione di apparecchiature e software per questo protocollo è stata determinata dalla disponibilità presso la nostra istituzione.
In sintesi, si prevede che questo protocollo fornirà un solido punto di partenza per condurre l’imaging time-lapse utilizzando la microscopia Lightsheet e per la quantificazione dell’immagine dello sviluppo precoce dell’occhio nel pesce zebra.
The authors have nothing to disclose.
La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dall’Office of The Director of the National Institutes of Health (NIH) con il numero di premio S10OD020067 e dal premio NIH R01EY021769 (ad A.C.M.). Siamo grati per l’assistenza di Doug Harrison e Jim Begley nell’Arts & Sciences Imaging Center dell’Università del Kentucky e a Lucas Vieira Francisco ed Evelyn M. Turnbaugh per la cura esperta del pesce zebra.
60mL Syringe Luer-Lok Tip | BD | 309653 |
Agarose, Low Melting Temperature | Promega | V2111 |
arivis Vision4D Software | arivis | https://www.arivis.com/en/imaging-science/arivis-vision4d |
Dumoxel N3C Forceps | Dumont | 0203-N3C-PO |
E3 fish buffer (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4) | ||
Glass Capillary – Size 2 (~1mm) | Zeiss | Black/701904 |
Heidelberger Extension Line 100cm | B. Braun | 4097262 |
Light & Filter Set – Royal Blue | Night Sea | SFA-LFS-RB |
Petri Dish (100 x 15 mm) | VWR | 25384-302 |
Stereomicroscope Fluorescence Adapter | NightSea | |
Teflon Tipped Plunger – Size 2 | Zeiss | #701997 |
Tg(rx3:GFP) zebrafish | This line was established by Rembold et al.13 | |
Tricaine (MS222) | Sigma | A-5040 |
Z.1 Lightsheet | Zeiss | |
Zen Software | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |