הדמיה של מורפוגנזה עינית על ידי מיקרוסקופיה של גיליון אור באמצעות rx3:GFP דגי זברה מהונדסים
Summary
כאן, פרוטוקול מסופק להדמיה בהילוך מהיר של מורפוגנזה עינית באמצעות מיקרוסקופ יריעת אור זמין מסחרית ותחנת עבודה לעיבוד תמונה כדי לנתח את הנתונים המתקבלים. פרוטוקול זה מפרט את ההליכים להרדמה עוברית, הטבעה באגרוז בטמפרטורת התכה נמוכה, השעיה בתא ההדמיה, הגדרת פרמטרי ההדמיה, ולבסוף ניתוח נתוני ההדמיה באמצעות תוכנת ניתוח תמונות.
Abstract
התפתחות עיניים של בעלי חוליות היא תהליך מורכב שמתחיל לקראת סוף התפשטות העובר ודורש תיאום מדויק של נדידת תאים, התפשטות והתמיינות. דמיון בהילוך מהיר מציע תובנה ייחודית להתנהגות התאים במהלך התפתחות העין מכיוון שהוא מאפשר לנו לדמיין אוקולוגנזה in vivo. דגי זברה הם מודל מצוין להמחשת תהליך זה בשל עינו של בעלי החוליות השמורים ביותר שלהם ויכולתם להתפתח במהירות ובאופן חיצוני תוך שמירה על שקוף אופטי. מחקרי הדמיה בהילוך מהיר של התפתחות העין של דגי זברה מתאפשרים מאוד על ידי שימוש בקו דגי הזברה המהונדסים Tg(rx3:GFP). במוח הקדמי המתפתח, ביטוי rx3:GFP מסמן את התאים של שדה העין הבודדת, ו- GFP ממשיך לבוא לידי ביטוי כאשר שדה העין מתרבה ויוצר שלפוחית אופטית, אשר לאחר מכן משתנה ליצירת אופטית. הדמיית קיטועי זמן ברזולוציה גבוהה של ביטוי rx3:GFP, אם כן, מאפשרת לנו לעקוב אחר פרימורדיום העין לאורך זמן כשהוא מתפתח לרשתית. מיקרוסקופיית יריעות אור היא שיטה אידיאלית לצילום מורפוגנזה עינית לאורך זמן בשל יכולתה לחדור דגימות עבות יותר להדמיה פלואורסצנטית, למזער את ההלבנה והפוטוטוקסיות, ולדמות במהירות גבוהה. כאן, פרוטוקול מסופק להדמיה בהילוך מהיר של מורפוגנזה עינית באמצעות מיקרוסקופ יריעת אור זמין מסחרית ותחנת עבודה לעיבוד תמונה כדי לנתח את הנתונים המתקבלים. פרוטוקול זה מפרט את ההליכים להרדמה עוברית, הטבעה באגרוז בטמפרטורת התכה נמוכה, השעיה בתא ההדמיה, הגדרת פרמטרי ההדמיה, ולבסוף ניתוח נתוני ההדמיה באמצעות תוכנת ניתוח תמונות. מערך הנתונים המתקבל יכול לספק תובנות חשובות על תהליך המורפוגנזה של העין, כמו גם הפרעות לתהליך זה כתוצאה ממוטציה גנטית, חשיפה לסוכנים פרמקולוגיים או מניפולציות ניסיוניות אחרות.
Introduction
התפתחות עוברית היא תהליך מורכב הדורש תיאום מדויק של אירועים רבים ושונים. היווצרות העין של בעלי החוליות מתחילה במוח הקדמי המתפתח, שם חלק מהתאים מוגדרים כשדה העין. תאים אלה יתנשאו לכיוון האקטודרם של פני השטח, ויולידו שתי בועיות אופטיות דו-צדדיות 1,2,3,4,5,6,6,7,8,9,10. לאחר מכן, מגע עם האקטודרם של פני השטח גורם לאינווגינציה של השלפוחית האופטית לכוס אופטית. אקטודרם פני השטח יוליד את המבנים הקדמיים של העין, כגון העדשה והקרנית, ואילו הכוס האופטית תוליד את הרשתית העצבית ואת האפיתל בעל פיגמנט הרשתית 1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,12 . שיבושים בתהליך זה עלולים להוביל לפגמים מולדים כגון מיקרופתלמיה, אנופתלמיה וקולובומה (MAC). בשלב זה, אין אפשרויות לתקן פגמים אלה 3,5,6,7,9,9,10,11,12. מחקרים נוספים על המנגנונים של מורפוגנזה עינית והבעיות שיכולות להוביל ל- MAC יספקו בסיס של ידע שעשוי להוביל לטיפולים. אחד הכלים החזקים לחקור את ההתנהגויות הדינמיות של תאים במהלך התפתחות העין הוא דמיון בהילוך מהיר, המאפשר לדמיין ולאפיין את התהליך הזה ב-vivo ובזמן אמת.
דגי זברה (Danio rerio) הם מודל מצוין להמחשת התפתחות עיניים מוקדמת באמצעות הדמיה של קיטועי זמן. יש להם עין בעלת חוליות שמורה מאוד ויש להם את היכולת להתפתח במהירות ובאופן חיצוני תוך שמירה על שקוף אופטי1. דגי זברה מספקים משאב נהדר להדמיה בהילוך מהיר בשל מאפיינים אלה שחסרים למודלים של יונקים. מחקרי הדמיה בהילוך מהיר של התפתחות העין של דגי זברה מתאפשרים מאוד על ידי שימוש בקו דגי הזברה המהונדסים Tg(rx3:GFP)13. Rx3 (חלבון הומיאובוקס רשתית 3) הוא גורם שעתוק החיוני להתפתחות העין14. Rx3 הוא הראשון מבין שלושת הגנים rx בדג הזברה שמתבטא, ומתחיל את הביטוי שלו באמצע גסטרולציה, כ-8 שעות לאחר ההפריה (hpf)15,16. ניתן לדמיין את הטרנסג’ן rx3:GFP במוח הקדמי המתפתח החל משלב הסומייט 1 (ss), כ-10 כ-10 כ”ס 15,17,18,19,20. במוח הקדמי המתפתח, ביטוי rx3:GFP מסמן את התאים של שדה העין הבודדת, ו-GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) ממשיך לבוא לידי ביטוי דרך שארית מורפוגנזה עינית. הדמיית הקפאת זמן ברזולוציה גבוהה של ביטוי rx3:GFP, אם כן, מאפשרת לנו לעקוב אחר שדה העין הבודדת לאורך זמן כשהוא מתפתח לרשתית 17,18,20.
מחקרי הדמיה בהילוך מהיר של התפתחות דגי זברה בוצעו בעיקר באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית או אור. למיקרוסקופיה קונפוקלית יש יתרון בכך שהיא מאפשרת הדמיה מדויקת של דגימות לאורך ציר ה-z ומפחיתה את אות הרקע הפלואורסצנטי. עם זאת, הוא מוגבל על ידי כמות הזמן שלוקח לרכוש תמונה, קשיחות מיקום המדגם, והנטייה שלו כלפי פוטו-הלבנה ופוטוטוקסיות של דגימות חיות. מיקרוסקופיית יריעות אור היא שיטה אידיאלית לצילום מורפוגנזה של עיניים לאורך זמן בשל יכולתה לחדור דגימות עבות יותר להדמיה פלואורסצנטית, גמישות מוגברת בכיוון הדגימה, הלבנת תמונות מינימלית ופוטוטוקסיות, והדמיה במהירות גבוהה 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 ,31. הרזולוציה המרחבית הניתנת להשגה עם מערכות מיקרוסקופיות יריעות אור נוכחיות היא כ-250-500 ננומטר (ננומטר). למרות שזה לא שונה באופן משמעותי ממה שניתן להשיג במיקרוסקופיה קונפוקלית, ניתן לסובב את הדגימה באופן חופשי ולדמות אותה ממספר זוויות, מה שמשפר הן את עומק ההדמיה והן את הרזולוציה, ומציע גמישות רבה יותר לניסויי הדמיה בהילוך מהיר בזמן in vivo מאשר הפלטפורמה הקונפוקלית27,32 . מסיבות אלה, מיקרוסקופיית Lightsheet הופכת במהירות לשיטה המועדפת למחקרי הדמיה בהילוך מהיר של התפתחות דגי זברה. פרוטוקול זה מתאר את השלבים של כימות אוקולוגנזה באמצעות הדמיה של דג זברה מהונדס Rx3:GFP באמצעות מיקרוסקופ Lightsheet33 הזמין מסחרית ומפרט צינור לניתוח תמונה באמצעות פלטפורמת התוכנה arivis.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה, מיקרוסקופ Lightsheet שימש לביצוע הדמיה בהילוך מהיר של התפתחות העיניים והנתונים שהתקבלו נותחו. מערך הנתונים המתקבל יכול לספק תובנות חשובות על תהליך המורפוגנזה של העין, כמו גם הפרעות לתהליך זה כתוצאה ממוטציה גנטית, חשיפה לחומרים פרמקולוגיים או פרמטרים ניסיוניים אחרים. כאן הפרוטוקול הדגים כיצד ניתן להשיג מערך נתונים זה וסיפק דוגמה כיצד לנתח את נפח שדה העין באמצעות פיתוח מוקדם. נתונים אלה נמצאו ניתנים לשחזור ועקביים (פחות מ-10% שונות בנפח) על פני שכפולים ביולוגיים, תוך התחשבות בכך שהבדלים קלים בהיערכות העוברים לפני תחילת הריצה יכולים להוביל לשונות מסוימת במדידות הנפח הסופיות.
יש להקפיד על המיקום הראשוני של העובר בנימים ובמיקום העובר המוטבע מול המטרה. האוריינטציה ממלאת תפקיד חשוב במניעת צמיחת העובר ויציאה מתוך השקפת המטרה. לעוברים יש צורה עגולה של 10 כ”ס, מה שמקשה על הבטחת כיוון מסוים בנימים. באופן אידיאלי, גוף העובר ימוקם לרוחב בנימים. העמסת עוברים מרובים בנימים תגדיל את הסבירות לבעלות על עובר ממוקם היטב.
בהליך זה, העובר מוטבע באגרוז על מנת להשעות אותו מול מטרות ההדמיה וההארה. בחירת הריכוז הנכון של אגרוז טמפרטורת ההיתוך הנמוכה היא קריטית. ריכוז גבוה מדי יגביל את העובר וימנע ממנו להתפתח כראוי; ריכוז נמוך מדי יגרום לכך שהאגרוז יתפרק ולא יחזיק את העובר. הריכוז האופטימלי לפרוטוקול זה הוא ריכוז סופי של 1% טמפרטורת התכה נמוכה של אגרוז30,31.
אלמנט נוסף שיש לקחת בחשבון הוא רמת הרוויה. ככל ששדה העין גדל ומבדיל, עוצמת האות Rx3:GFP מתעצמת. לכן, בעת הגדרת פרמטרי ההדמיה הראשוניים, יש להפחית את החשיפה ואת עוצמת הלייזר כדי להמעיט בתמונה. פעולה זו תמנע מהתמונה להפוך לרווית יתר ככל שה-Rx3:GFP יתבהר עם הזמן. ניתן לבצע שינויים כדי לתקן את התת-קרקעיות בעיבוד תמונה, אך לא ניתן לתקן את ה-oversaturation לאחר רכישת התמונות.
ישנם כמה שינויים נוספים שניתן לבצע בפרוטוקול זה שעשויים להיות יתרון לפרויקטים מסוימים שאינם מתוארים במאמר זה. לדוגמה, ניתן להגדיר הדמיה Multiview בהגדרת רכישת התמונה. פרמטר זה יאפשר למספר עוברים במיקומים שונים לאורך ציר ה-y להצטלם באופן רציף בכל מרווח זמן. תוך הוספת מורכבות למערך הנתונים, זה יגדיל את קצב איסוף הנתונים. בנוסף, במונחים של עיבוד תמונה, ניתן לכמת את שדה העין על ידי פרמטרים אחרים. כאן תיארנו כיצד לכמת את הנתונים במונחים של נפח שדה העין. לחלופין, ניתן ליצור צינור כדי לכמת ולעקוב אחר תאים בודדים או לקבוע את קצב התאדות השלפוחית האופטית.
כפי שצוין קודם לכן, הן מיקרוסקופיה קונפוקלית והן מיקרוסקופיית Lightsheet שימשו לביצוע מחקרי הדמיה בהילוך מהיר של דגי זברה. Lightsheet נבחר במיוחד לפרויקט זה בשל יכולתו המעולה לצלם דרך דגימה עבה (>1 מ”מ), משום שהוא מצויד ביחידת דגירה כדי לשמור על סביבת טמפרטורה אידיאלית לעובר דג הזברה, ומכיוון שיכולתו לצלם בקצב מהיר יותר ממיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשרת רכישת תמונה במרווחי הזמן הרבים הנדרשים לפרוטוקול זה ללא נזק נלווה או הלבנת תמונות של העובר21, 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. חשוב גם לציין כי מיקרוסקופ Lightsheet מצויד כדי לדמות את האות ממספר פלואורופורים. למיקרוסקופ Lightsheet המשמש במחקר זה יש קווי עירור לייזר במצב מוצק ב-405, 445, 488, 515, 561 ו-638 ננומטר, שיכולים להיות שימושיים להדמיית עוברים מהונדסים המבטאים יותר מדיווח פלואורסצנטי אחד טרנסגן.
בעוד שפרוטוקול זה מפרט הוראות לניתוח רכישת תמונות באופן ספציפי באמצעות מערכת מיקרוסקופ התאורה הכפולה של Lightsheet Z.1 ותוכנת הניתוח arivis Vision4D, ישנם מיקרוסקופים אחרים של Lightsheet הזמינים מסחרית המיוצרים על ידי לייקה, אולימפוס ולוקסנדו, כמו גם תוכנת ניתוח תמונות על ידי אימריס, שיכולים לשמש להשגת תוצאות דומות. בחירת הציוד והתוכנה לפרוטוקול זה נקבעה על ידי הזמינות במוסד שלנו.
לסיכום, הצפי הוא שפרוטוקול זה יספק נקודת התחלה מוצקה לביצוע הדמיה של קיטועי זמן באמצעות מיקרוסקופיית Lightsheet, ולכימות תמונה של התפתחות עיניים מוקדמת בדגי זברה.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי משרד מנהל המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) תחת פרס מספר S10OD020067 ועל ידי פרס NIH R01EY021769 (ל- A.C.M.). אנו אסירי תודה על עזרתם של דאג הריסון וג’ים בגלי במרכז ההדמיה לאמנויות ומדעים באוניברסיטת קנטקי, וללוקאס ויירה פרנסיסקו ואוולין מ. טורנבאו על טיפול מומחה בדגי זברה.
Materials
| 60mL Syringe Luer-Lok Tip | BD | 309653 |
| Agarose, Low Melting Temperature | Promega | V2111 |
| arivis Vision4D Software | arivis | https://www.arivis.com/en/imaging-science/arivis-vision4d |
| Dumoxel N3C Forceps | Dumont | 0203-N3C-PO |
| E3 fish buffer (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4) | ||
| Glass Capillary – Size 2 (~1mm) | Zeiss | Black/701904 |
| Heidelberger Extension Line 100cm | B. Braun | 4097262 |
| Light & Filter Set – Royal Blue | Night Sea | SFA-LFS-RB |
| Petri Dish (100 x 15 mm) | VWR | 25384-302 |
| Stereomicroscope Fluorescence Adapter | NightSea | |
| Teflon Tipped Plunger – Size 2 | Zeiss | #701997 |
| Tg(rx3:GFP) zebrafish | This line was established by Rembold et al.13 | |
| Tricaine (MS222) | Sigma | A-5040 |
| Z.1 Lightsheet | Zeiss | |
| Zen Software | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |
References
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Li, Z., Joseph, N. M., Easter, S. S. The morphogenesis of the zebrafish eye, including a fate map of the optic vesicle. Developmental Dynamics. 218 (1), 175-188 (2000).
- Chow, R. L., Lang, R. A. Early eye development in vertebrates. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 255-296 (2001).
- Wilson, S. W., Houart, C. Early steps in the development of the forebrain. Developmental Cell. 6 (2), 167-181 (2004).
- Picker, A., et al. Dynamic coupling of pattern formation and morphogenesis in the developing vertebrate retina. PLoS Biology. 7 (10), 1000214 (2009).
- Fuhrmann, S. Eye morphogenesis and patterning of the optic vesicle. Current Topics in Developmental Biology. 93, 61-84 (2010).
- Kwan, K. M., et al. Bin A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
- Heermann, S., Schütz, L., Lemke, S., Krieglstein, K., Wittbrodt, J. Eye morphogenesis driven by epithelial flow into the optic cup facilitated by modulation of bone morphogenetic protein. eLife. 4, 05216 (2015).
- Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schütz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt. Open Biology. 9 (2), (2019).
- Yoon, K. H., Fox, S. C., Dicipulo, R., Lehmann, O. J., Waskiewicz, A. J. Ocular coloboma: Genetic variants reveal a dynamic model of eye development. American Journal of Medical Genetics Part C: Seminars in Medical Genetics. 184 (3), 590-610 (2020).
- Sidhaye, J., Norden, C. Concerted action of neuroepithelial basal shrinkage and active epithelial migration ensures efficient optic cup morphogenesis. eLife. 6, 22689 (2017).
- Pillai-Kastoori, L., Wen, W., Morris, A. C. Keeping an eye on SOXC proteins. Developmental Dynamics. 244, 367-376 (2015).
- Rembold, M., et al. Individual cell migration serves as the driving force for optic vesicle evagination. Science. 313, 1130-1134 (2006).
- Loosli, F., et al. Loss of eyes in zebrafish caused by mutation of chokh/rx 3. EMBO Reports. 4 (9), 894-899 (2003).
- Chuang, J. C., Mathers, P. H., Raymond, P. A. Expression of three Rx homeobox genes in embryonic and adult zebrafish. Mechanisms of Development. 84 (1-2), 195-198 (1999).
- Cavodeassi, F., et al. Early stages of zebrafish eye formation require the coordinated activity of Wnt11, Fz5, and the Wnt/β-catenin pathway. Neuron. 47 (1), 43-56 (2005).
- Ivanovitch, K., Cavodeassi, F., Wilson, S. W. Precocious acquisition of neuroepithelial character in the eye field underlies the onset of eye morphogenesis. Developmental Cell. 27 (3), 293-305 (2013).
- Ebert, A. M., Childs, S. J., Hehr, C. L., Cechmanek, P. B., McFarlane, S. Sema6a and Plxna2 mediate spatially regulated repulsion within the developing eye to promote eye vesicle cohesion. Development (Cambridge). 141 (12), 2473-2482 (2014).
- Emerson, S. E., et al. Identification of target genes downstream of semaphorin6A/plexinA2 signaling in zebrafish. Developmental Dynamics. 246 (7), 539-549 (2017).
- Hehr, C. L., Halabi, R., McFarlane, S. Polarity and morphogenesis of the eye epithelium requires the adhesion junction associated adaptor protein Traf4. Cell Adhesion and Migration. 12 (5), 489-502 (2018).
- Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. Journal of Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Reynaud, E. G., Kržič, U., Greger, K., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy: More dimensions, more photons, and less photodamage. HFSP Journal. 2 (5), 266-275 (2008).
- Icha, J., et al. Using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (110), e53966 (2016).
- Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Pampaloni, F., Chang, B. J., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy (LSFM) for the quantitative imaging of cells and tissues. Cell and Tissue Research. 360 (1), 129-141 (2015).
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: A quantitative transition is underway. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (5), 327-339 (2014).
- Park, O. K., et al. 3D light-sheet fluorescence microscopy of cranial neurons and vasculature during zebrafish embryogenesis. Molecules and Cells. 38 (11), 975-981 (2015).
- Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nature Biotechnology. 34 (12), 1267-1278 (2016).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Keller, P. J., et al. Fast, high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nature Methods. 7 (8), 637-642 (2010).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: A review. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12 (1), 30-34 (2014).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)., 5th Edition. , (2007).
- Hirsinger, E., Steventon, B. A versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (1199), e55210 (2017).
- Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. Journal of Neurobiology. 37 (4), 622-632 (1998).
- Cavodeassi, F., Ivanovitch, K., Wilson, S. W. Eph/Ephrin signalling maintains eye field segregation from adjacent neural plate territories during forebrain morphogenesis. Development (Cambridge). 140 (20), 4193-4202 (2013).
- Muthu, V., Eachus, H., Ellis, P., Brown, S., Placzek, M. Rx3 and Shh direct anisotropic growth and specification in the zebrafish tuberal/anterior hypothalamus. Development (Cambridge). 143 (14), 2651-2663 (2016).
- Rojas-Muñoz, A., Dahm, R., Nüsslein-Volhard, C. chokh/rx3 specifies the retinal pigment epithelium fate independently of eye morphogenesis. Developmental Biology. 288 (2), 348-362 (2005).
