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Developmental Biology

Visualisierung der Augenmorphogenese mittels Lightsheet-Mikroskopie mittels rx3:GFP Transgener Zebrafische

Published: April 05, 2021
doi:
10.3791/62296
,
1Department of Biology,University of Kentucky

Summary

Hier wird ein Protokoll für die Zeitrafferbildgebung der Augenmorphogenese mit einem handelsüblichen Lightsheet-Mikroskop und einer Bildverarbeitungs-Workstation zur Analyse der resultierenden Daten bereitgestellt. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren für die Anästhesie des Embryos, die Einbettung in Agarose mit niedriger Schmelztemperatur, die Suspension in der Bildgebungskammer, die Einrichtung der Bildgebungsparameter und schließlich die Analyse der Bilddaten mithilfe von Bildanalysesoftware.

Abstract

Die Entwicklung von Wirbeltierenaugen ist ein komplexer Prozess, der gegen Ende der Embryogastrulation beginnt und die präzise Koordination der Zellmigration, -proliferation und -differenzierung erfordert. Die Zeitraffer-Bildgebung bietet einzigartige Einblicke in das Verhalten von Zellen während der Augenentwicklung, da sie es uns ermöglicht, die Okulogenese in vivo zu visualisieren. Zebrafische sind ein hervorragendes Modell, um diesen Prozess aufgrund ihres hochgradig konservierten Wirbeltierauges und ihrer Fähigkeit, sich schnell und extern zu entwickeln und gleichzeitig optisch transparent zu bleiben, zu visualisieren. Zeitraffer-Bildgebungsstudien zur Entwicklung von Zebrafischaugen werden durch die Verwendung der transgenen Zebrafischlinie Tg(rx3:GFP) erheblich erleichtert. Im sich entwickelnden Vorderhirn markiert die rx3: GFP-Expression die Zellen des einzelnen Augenfeldes, und GFP wird weiterhin exprimiert, wenn das Augenfeld evaginatiert, um ein optisches Vesikel zu bilden, das dann invaginiert, um eine optische Tasse zu bilden. Die hochauflösende Zeitrafferbildgebung der rx3: GFP-Expression ermöglicht es uns daher, das Augenprimordium durch die Zeit zu verfolgen, während es sich zur Netzhaut entwickelt. Die Lightsheet-Mikroskopie ist eine ideale Methode, um die okuläre Morphogenese im Laufe der Zeit abzubilden, da sie dickere Proben für die Fluoreszenzbildgebung durchdringen, Photobleichen und Phototoxizität minimieren und mit hoher Geschwindigkeit abbilden kann. Hier wird ein Protokoll für die Zeitrafferbildgebung der Augenmorphogenese mit einem handelsüblichen Lightsheet-Mikroskop und einer Bildverarbeitungs-Workstation zur Analyse der resultierenden Daten bereitgestellt. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren für die Anästhesie des Embryos, die Einbettung in Agarose mit niedriger Schmelztemperatur, die Suspension in der Bildgebungskammer, die Einrichtung der Bildgebungsparameter und schließlich die Analyse der Bilddaten mithilfe von Bildanalysesoftware. Der resultierende Datensatz kann wertvolle Einblicke in den Prozess der Augenmorphogenese sowie in Störungen dieses Prozesses infolge genetischer Mutationen, Exposition gegenüber pharmakologischen Agenzien oder anderen experimentellen Manipulationen liefern.

Introduction

Die Embryonalentwicklung ist ein komplexer Prozess, der die präzise Koordination vieler verschiedener Ereignisse erfordert. Die Bildung des Wirbeltierauges beginnt im sich entwickelnden Vorderhirn, wo ein Teil der Zellen als Augenfeld spezifiziert ist. Diese Zellen evaginalieren in Richtung des Oberflächenektoderms, wodurch zwei bilaterale optische Vesikelentstehen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Der Kontakt mit dem Oberflächenektoderm induziert dann eine Invagination des optischen Vesikels in einen optischen Becher. Das Oberflächenektoderm führt zu den vorderen Strukturen des Auges, wie der Linse und der Hornhaut, während der Sehbecher die neuronale Netzhaut und das retinale pigmentierte Epithel 1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,12 hervorbringt. . Störungen in diesem Prozess können zu angeborenen Defekten wie Mikrophthalmie, Anaphthalmie und Kolobom (MAC) führen. Derzeit gibt es keine Möglichkeiten, diese Mängelzu beheben 3,5,6,7,9,10,11,12. Weitere Studien zu den Mechanismen der Augenmorphogenese und den Problemen, die zu MAC führen können, werden eine Wissensgrundlage liefern, die möglicherweise zu Behandlungen führen wird. Ein leistungsfähiges Werkzeug, um das dynamische Verhalten von Zellen während der Augenentwicklung zu untersuchen, ist die Zeitraffer-Bildgebung, mit der dieser Prozess in vivo und in Echtzeit visualisiert und charakterisiert werden kann.

Zebrafische (Danio rerio) sind ein hervorragendes Modell, um die frühe Augenentwicklung mit Hilfe der Zeitrafferbildgebung zu visualisieren. Sie haben ein hochkonserviertes Wirbeltierauge und besitzen die Fähigkeit, sich schnell und äußerlich zu entwickeln, während sie optisch transparentbleiben 1. Zebrafische bieten aufgrund dieser Eigenschaften, die Säugetiermodellen fehlen, eine großartige Ressource für die Zeitrafferbildgebung. Zeitraffer-Bildgebungsstudien zur Entwicklung von Zebrafischaugen werden durch die Verwendung der transgenen Zebrafischlinie Tg(rx3:GFP)13 erheblich erleichtert. Rx3 (Retinal homeobox protein 3) ist ein Transkriptionsfaktor, der für die Augenentwicklung essentiellist 14. Rx3 ist das erste der drei rx-Gene im Zebrafisch, das exprimiert wird, beginnend mit seiner Expression in der Mitte der Gastrulation, etwa 8 h nach der Befruchtung (hpf)15,16. Das rx3:GFP-Transgen kann im sich entwickelnden Vorderhirn ab dem 1-Somite-Stadium (ss), ca. 10 hpf 15,17,18,19,20, sichtbar gemacht werden. Im sich entwickelnden Vorderhirn markiert die rx3: GFP-Expression die Zellen des einzelnen Augenfeldes, und GFP (grün fluoreszierendes Protein) wird weiterhin durch den Rest der Augenmorphogenese exprimiert. Die hochauflösende Zeitrafferbildgebung der rx3: GFP-Expression ermöglicht es uns daher, das einzelne Augenfeld durch die Zeit zu verfolgen, während es sich zur Netzhaut17,18,20 entwickelt.

Zeitraffer-Bildgebungsstudien zur Entwicklung von Zebrafischen wurden hauptsächlich mit konfokaler oder Lightsheet-Mikroskopie durchgeführt. Die konfokale Mikroskopie ist insofern von Vorteil, als sie die präzise Abbildung von Proben entlang der z-Achse ermöglicht und das fluoreszierende Hintergrundsignal reduziert. Es ist jedoch begrenzt durch die Zeit, die benötigt wird, um ein Bild aufzunehmen, die Steifigkeit der Probenposition und seine Neigung zum Photobleichen und zur Phototoxizität lebender Proben. Die Lightsheet-Mikroskopie ist eine ideale Methode zur Abbildung der okulären Morphogenese im Laufe der Zeit aufgrund ihrer Fähigkeit, dickere Proben für die Fluoreszenzbildgebung zu durchdringen, erhöhte Flexibilität in der Probenorientierung, minimierte Photobleiche und Phototoxizität und Bildgebung mit hoher Geschwindigkeit 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 ,31. Die mit aktuellen Lichtblatt-Mikrokopiersystemen erreichbare räumliche Auflösung beträgt ca. 250-500 Nanometer (nm). Obwohl sich dies nicht wesentlich von dem unterscheidet, was mit konfokaler Mikroskopie erreicht werden kann, kann die Probe frei gedreht und aus mehreren Winkeln abgebildet werden, was sowohl die Bildgebungstiefe als auch die Auflösung verbessert und eine viel größere Flexibilität für In-vivo-Zeitraffer-Bildgebungsexperimente bietet als die konfokale Plattform27,32 . Aus diesen Gründen wird die Lightsheet-Mikroskopie schnell zur bevorzugten Methode für Zeitraffer-Bildgebungsstudien der Zebrafischentwicklung. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Quantifizierung der Okkulologenese durch die Bildgebung von Rx3:GFP transgenen Zebrafischen mit einem kommerziell erhältlichen Lightsheet-Mikroskop33 und beschreibt eine Pipeline für die Bildanalyse mit der arivis Softwareplattform.

Protocol

Alle Experimente mit der Verwendung von Zebrafischen wurden in Übereinstimmung mit Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Kentucky festgelegt wurden. 1. Probenvorbereitung Stellen Sie ein sich paarendes Paar Tg (Rx3: GFP) Zebrafische in einem geschlossenen Quertank in der Nacht vor der Planung der Bildgebung auf. Am nächsten Morgen ziehen Sie das Tor, als die Lichter in der Fischanlage34,35 angehen.HINWEIS: Das ausgewählte Paarungspaar von Fischen sollte zwischen 4 Monaten und 2 Jahren alt sein und anhand von Körperform und Färbung leicht als männlich oder weiblich unterschiedenwerden können 35. Überprüfen Sie die Kreuze jede halbe Stunde auf Embryonen und notieren Sie, wann Embryonen zuerst im Boden des Kreuzbeckens sichtbar gemacht werden. Übertragen Sie die Embryonen in eine Petrischale und halten Sie die Embryonen für ca. 10 h bei 28,5 ° C, um sich zum 1-2 Somitestadium (ss) zu entwickeln. Beginnen Sie mit der Bildgebung im 1-2 Somite-Stadium (ss). Um auf das Vorhandensein von Somiten zu untersuchen, beobachten Sie die Embryonen unter einem Stereoskop bei 10 hpf und zählen Sie die Anzahl der Somiten1.HINWEIS: Alle Embryonen, die über das einzelne Somitestadium hinausgehen, sollten für dieses Experiment nicht verwendet werden. Aus den Embryonen, die sich im Einzelsomitestadium befinden, wird die GFP-Expression mit einem Fluoreszenzadapter in Kombination mit einem Stereomikroskop untersucht, um das Vorhandensein des Rx3:GFP-Transgens zu bestätigen. Sobald 3-5 GFP-positive Individuen identifiziert wurden, verwenden Sie eine feine Pinzette, um die Embryonen zu dechorionieren, und übertragen Sie sie in eine kleine Petrischale mit E3-Embryopuffer mit einer Glaspipette35. Anästhesieren Sie die Embryonen, indem Sie sie in einen 0,5 ml E3-Embryopuffer (pH 7) mit 0,168 mg/ml Tricain (MS222) in einem Mikrozentrifugenröhrchen35,36 übertragen. Spontane Muskelbewegungen beginnen bereits mit 17 hpf37. Stellen Sie sicher, dass Embryonen über diesen Zeitpunkt hinaus betäubt werden. Betten Sie die Embryonen in 1% niedriger Schmelztemperatur Agarose in 0,168 mg / ml Tricain und E3 ein.HINWEIS: Dies ist die optimale Konzentration von Agarose mit niedriger Schmelztemperatur, damit der Embryo an Ort und Stelle gehalten werden kann, aber biegsam genug bleibt, um das Wachstum des Embryos über den Bildgebungszeitverlaufzu ermöglichen 30,31. Bereiten Sie eine 10 ml Lösung aus 2% niedriger Schmelztemperatur Agarose im E3-Puffer vor. Erhitzen Sie es in einem Mikrowellenherd, um Agarose in Intervallen von 15 s aufzulösen, um zu verhindern, dass die Lösung überkocht. Lassen Sie die Lösung so abkühlen, dass sie ohne Beschwerden hält, aber nicht so sehr, dass sie sich verfestigt und den Embryonen keinen Schaden zufügt. Sobald die Agarose ausreichend abgekühlt ist, fügen Sie 0,5 ml zu den Embryonen in der Tube von Tricain in E3 hinzu und pipettieren Sie vorsichtig die Lösung und die Embryonen, um sie zu mischen. Ziehen Sie die Embryonen in der Agaroselösung mit einer 1-mm-Glaskapillare und einem Kolben aus Polytetrafluorethylen (PTFE) in die Kapillare hoch. Stellen Sie sicher, dass Sie insgesamt 3-5 Embryonen (mehrere Embryonen) in die Kapillare ziehen, um die Wahrscheinlichkeit eines gut positionierten Embryos zu erhöhen.HINWEIS: Aufgrund der runden Natur der Embryonen zu diesem Zeitpunkt ist es schwierig, eine bestimmte Ausrichtung in der Kapillare zu gewährleisten. Idealerweise wird der Körper des Embryos seitlich in der Kapillare positioniert, was eine möglichst einfache Positionierung innerhalb des Mikroskops ermöglicht. Lassen Sie die Agarose über einen Zeitraum von 30-60 s bei Raumtemperatur erstarren. Geben Sie die Kapillare in ein Becherglas mit 0,168 mg/ml Tricain in den E3-Puffer, bis sie zur Abbildung bereit ist (Abbildung 1A).HINWEIS: Die überschüssige 2% Agaroselösung mit niedriger Schmelztemperatur kann in zukünftigen Experimenten erstarren und anschließend wieder erwärmt werden. Legen Sie die Kapillare in den Probenhalter (Abbildung 1B-F), wie in Schritt 2.5 beschrieben. 2. Zeiss Lightsheet Z.1 einrichten Schalten Sie jede Komponente des Mikroskops und des Computers in der folgenden Reihenfolge ein: 1) System, 2) PC, dann 3) Inkubation (Abbildung 2A). Platzieren Sie das 20-fache Abbildungsobjektiv und das 10-fache Beleuchtungsobjektiv in der Mikroskopkammer. Passen Sie die Zieleinstellungen in der Zen-Software-Benutzeroberfläche auf der Registerkarte ” Verwalten” an. Schieben Sie die Kammer (Abbildung 2C) mit dem Rohr nach außen in das Gehäuse auf der Schiene (Abbildung 2B). Der Schlauch wird an die entsprechenden Anschlüsse auf der rechten Seite angeschlossen, wie in Abbildung 2E dargestellt. Befestigen Sie die Verlängerungsleitung mit dem Luer-Lock-Mechanismus an der Spritze (Abbildung 2D); Füllen Sie es mit Tricain in E3 und legen Sie es in die Halterung, die rechts am Mikroskop35 angebracht ist. Verbinden Sie die Verlängerung, die an der mit Tricain in E3 gefüllten Spritze befestigt ist, unten rechts in der Kammer mit dem Luer-Lock-Mechanismus. Drücken Sie den Kolben, um die Kammer mit dem Tricain/E3-Puffer zu füllen. Schließen Sie die Tür zur Kammer. Legen Sie die Kapillare mit der Probe in den Kapillarprobenhalter. Der Kapillarprobenhalter besteht aus zwei Gummihülsen, einer Metallprobenhalterscheibe, einem Metallstiel und einer Metallkappe (Abbildung 1B). Klicken Sie mit dem Metallmantel in die Mitte der Metallscheibe (Abbildung 1C). Legen Sie die beiden Gummistopfen in die Hülle, wobei die Schlitze den Enden der Scheide zugewandt sind, gefolgt von der Kapillare. Schieben Sie die Kapillare durch die Mitte der Gummistopfen. Befestigen Sie es mit der Metallkappe, sobald sich der Marker an der Basis des Metallmantels befindet (Abbildung 1D). Legen Sie den Kapillarprobenhalter auf die Oberseite des Mikroskops, wobei die weißen Markierungen ausgerichtet sind (Abbildung 1E,F). Schließen Sie den Deckel. Klicken Sie auf der Softwareoberfläche auf die Schaltfläche Kapillare suchen (Abbildung 3A). Verwenden Sie das ErgoDrive-Bedienfeld, ein manuelles Gerät, das die Kapillarausrichtung steuert (Abbildung 3E), um die Kapillare zu bewegen und direkt über dem Objektiv zu positionieren (Abbildung 3B). Öffnen Sie den Deckel und drücken Sie vorsichtig auf den Kolben, bis der Agaroseabschnitt, der den Embryo enthält, unter dem Kapillarboden hängt und sich vor dem Objektiv befindet (Abbildung 3C). Deaktivieren Sie Kapillare suchen, und klicken Sie auf die Schaltfläche “Beispiel suchen ” (Abbildung 3A). Dadurch wird der Blick von der Webcam der Probenkammer auf das Mikroskopobjektiv umgeschaltet (Abbildung 3D). Verwenden Sie diese Ansicht, um die Position der Probe genauer einzustellen. Deaktivieren Sie Beispiel suchen (Abbildung 3A). Wechseln Sie zur Registerkarte Akquisition. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen für Z-Stack und Time Series. Wählen Sie im Fenster Parameter für den Erfassungsmodus die Einstellung Dual Side Lightsheet aus, und aktivieren Sie die Kontrollkästchen für Online Dual Side Fusion und Pivot Scanning. Wählen Sie im Fenster Kanäle die Option 488 Kanal aus, stellen Sie die Laserleistung auf 1 und die Belichtungszeit auf 7,5 ms ein. Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche Fortlaufend , um eine Live-Ansicht des Embryos zu erhalten. Verwenden Sie das ErgoDrive-Bedienfeld, um die Position des Embryos anzupassen, bis das Augenfeld direkt der Kamera zugewandt ist. Fahren Sie fort, die linken und rechten Lichtblätter in den Channels-Parametern anzupassen, bis das Augenfeld ausreichend scharf ist. Stellen Sie die Z-Stack-Parameter über das ErgoDrive-Bedienfeld ein, um sich durch die Z-Ebene zu bewegen. Stellen Sie die erste und die letzte Z-Position um 500 μm über das letzte detektierbare Fluoreszenzsignal hinaus. Dies lässt Raum für das Augenfeld, um im Rahmen zu bleiben, während der Embryo während der Zeitraffer-Bildgebungssitzung wächst. Nachdem Sie den Bereich des Z-Stacks eingestellt haben, klicken Sie auf die Schaltfläche Optimal, um die Schrittweite auf 0,477 μm, die optimale Einstellung, einzustellen. Stellen Sie die Inkubationsparameter ein, indem Sie das Kontrollkästchen für die Peltier-Einheit aktivieren, um die Temperatur bei 28 ° C zu halten. Wählen Sie im Fenster Zeitreihe die Frequenz und das Zeitintervall für die Aufnahme von Bildern aus. In diesem Protokoll wurden die Parameter so eingestellt, dass sie alle 5 Minuten abbilden, für insgesamt 166 Intervalle. Klicken Sie auf die Schaltfläche Experiment starten . Wählen Sie den Ordner aus, in dem der Bildsatz gespeichert werden soll. Legen Sie das Bildpräfix fest und klicken Sie auf Speichern , um die Bildgebung zu starten.HINWEIS: Das Mikroskop durchläuft nun jedes eingestellte Bild im angegebenen Intervall. Nachdem die Zeitraffer-Bildgebungssitzung abgeschlossen ist, senden Sie die Stufe an die Belastungsposition, und entfernen Sie den Kapillarprobenhalter. Nehmen Sie den Kapillarprobenhalter in der umgekehrten Reihenfolge, in der er zusammengesetzt wurde, auseinander und verwenden Sie den Kolben, um die Probe und überschüssige Agarose aus der Kapillare zu entfernen. Öffnen Sie die Kammertür. Verwenden Sie die Spritze, um die Kammerflüssigkeit aus der Kammer zu entfernen, trennen und entfernen Sie die Kammer, spülen Sie sie dann mit Wasser ab und trocknen Sie sie an der Luft. 3. Bildanalyse Öffnen Sie das Softwareprogramm arivis Vision4D. Klicken Sie auf Datei und wählen Sie dann Datei importieren. Wählen Sie alle CZI-Dateien aus der Zeitraffer-Imaging-Sitzung aus und öffnen Sie sie. Das nächste Fenster mit den Optionen zum Importieren der Dateien wird geöffnet. Wählen Sie Z-Stapel als Rahmen aus, um die Z-Stapel in der erhaltenen Reihenfolge zu sortieren. Sobald die Dateien importiert wurden, speichert die Software als einzelne .sis-Datei. Um den Speicherort für die zu speichernde Datei anzugeben, wählen Sie den Ordner aus, bevor Sie auf Importieren klicken. Nachdem die Datei importiert wurde, ist arivis nun bereit, ein Video der Zeitrafferbilder zu rendern. Klicken Sie auf den 4D Viewer Cube in der unteren linken Ecke und das Scale Bar-Symbol (Abbildung 4D-E). Klicken Sie auf das Videosymbol, um die Storyboard-Taskleiste an den unteren Bildschirmrand zu bringen (Abbildung 4C). Wählen Sie in der Storyboard-Taskleiste Keyframe-Sequenz hinzufügen aus (Abbildung 4F). Geben Sie die Dauer des Videos in Sekunden an, deaktivieren Sie das Kontrollkästchen Drehung erstellen und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Zeitverlauf verwenden, um die spezifischen Zeitpunkte in das Video aufzunehmen. Die Software zeigt diese Parameter rechts neben der Storyboard-Taskleiste an, um jederzeit Anpassungen vornehmen zu können. Speichern Sie das Storyboard, um dieselben Parameter auf mehrere Bildsätze anzuwenden (Abbildung 4F). Klicken Sie auf Film exportieren , um ein Video der Zeitrafferbildgebung zu speichern (Abbildung 4F). Geben Sie die Filmexporteinstellungen an, einschließlich Dateiname und Speicherort, Videoformat (.mp4), Videoauflösung (1.080 p), Bildrate (60 FPS) und Datenauflösung (1.297 x 1.297 x 784). Fügen Sie hier bei Bedarf Zeitstempel hinzu. Sobald diese Parameter gesetzt sind, wählen Sie Record (Aufzeichnung ) (Abbildung 4F). Die Schritte 3.4 und 3.5 können mit einer Änderung an Schritt 3.4 wiederholt werden, um Rotationsvideos zu bestimmten Zeitpunkten zu erstellen. Wenn Sie dem Storyboard eine Keyframe-Sequenz hinzufügen, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Drehung erstellen , und deaktivieren Sie das Kontrollkästchen Zeitprogression verwenden. Befolgen Sie dann die gleichen Anweisungen wie in Schritt 3.5. Um ein hochauflösendes Bild in beliebiger Ausrichtung zu einem beliebigen Zeitpunkt zu rendern, wählen Sie das Kamerasymbol im 4D-Viewer, um ein hochauflösendes Bild zu erhalten (Abbildung 4C). Um eine Pipeline für die Analyse zu erstellen, wählen Sie das Flask-Symbol , um auf das Bedienfeld “Analyse ” zuzugreifen (Abbildung 4B). Klicken Sie im Bedienfeld Analyse auf das Dropdown-Menü Analysevorgänge. Als Beispiel veranschaulicht das Protokoll im Folgenden die Reihenfolge der Vorgänge für eine Volumenanalysepipeline. Führen Sie jeden Schritt der Pipeline einzeln aus oder machen Sie ihn rückgängig, um die einzelnen Parameter zu optimieren (Tabelle 1). Klicken Sie auf das blaue Dreieck oben in der Pipeline, damit die Pipeline ausgeführt werden kann.HINWEIS: Dies dauert je nach Geschwindigkeit des Computers einige Zeit. Sobald die Pipeline optimiert wurde, kann die Pipeline problemlos exportiert und nach arivis importiert und in einer Batch-Analyse auf mehrere Datensätze angewendet werden. Um auf die Chargenanalyse zuzugreifen, klicken Sie auf der Registerkarte Analyse auf Chargenanalyse. Nachdem die Pipeline ausgeführt wurde, wird ein Fenster mit allen gefundenen Objekten angezeigt. Greifen Sie manuell über das Tabellensymbol darauf zu (Abbildung 4B). Klicken Sie oben in diesem Fenster auf das Feld Feature-Spalten , um eine Liste der Features aufzurufen, die Informationen über das Objekt von Interesse bereitstellen können. Für die Analyse des Augenfeldvolumens umfassen diese Funktionen Oberfläche, Volumen (Volumen, VoxelCount), Intensitäten #1 (Mittelwert), Attribute (ID, Typ) und Zeitpunkt (Erste). Klicken Sie auf Exportieren , um die Daten in eine Tabelle zu exportieren.

Representative Results

Der hier angezeigte Datensatz wurde mit dem oben beschriebenen Protokoll abgebildet. Ein Tg(Rx3:GFP)-Embryo wurde beginnend im 1-Somit-Stadium (ss) bis 24 hpf, einem Gesamtzeitraum von 14 h, aufgenommen, wobei die Bilder in Abständen von 5 Minuten aufgenommen wurden. Die Zeitrafferbildgebung ermöglicht eine einfache Auswahl und einen einfachen Vergleich jedes Zeitpunkts, der einen Phänotyp von Interesse zeigt. Abbildung 5 zeigt eine Reihe von hochauflösenden Bildern, die aus dem dorsalen Blickwinkel zu ausgewählten Entwicklungszeitpunkten gerendert wurden. Die in arivis Vision4D ausgeführte Pipeline baut eine Maske, die das sich entwickelnde Auge darstellt, wie es durch Fluoreszenzsignal identifiziert wird. In Abbildung 5 und Videos 1-6 kann die Maske im Vergleich zur fluoreszierenden Darstellung des sich entwickelnden Auges visualisiert werden. Zusätzlich werden in Tabelle 2 die Volumendaten des sich entwickelnden Auges an jedem Bildgebungspunkt angezeigt. Dieser Datensatz enthält den Segmentnamen, die ID, das Volumen in μm 3 und die Voxelzahl, die mittlere Fluoreszenzintensität des Objekts, den Zeitpunkt, zu dem das Objekt identifiziert wurde, und die Oberfläche des Objekts in μm2. Es ist wichtig zu beachten, dass, wenn sich das Augenfeld in zwei optische Vesikel trennt (beginnend mit Timepoint 64), eine dritte Region verbleibt, die Rx3: GFP-positiv im Vorderhirn ist, was zum Hypothalamus38,39,40 beiträgt (Abbildung 5D-M). Dies zeigt sich in den in Tabelle 2 dargestellten Volumendaten (ab Timepoint 71 gelb hervorgehoben) und kann leicht von den optischen Vesikeln getrennt werden, da es im Volumen viel kleiner ist als jedes optische Vesikel. Abbildung 1: Probenvorbereitung. (A) Positionierung der Embryonen in einer Glaskapillare. Der Pfeil zeigt auf einen Embryo in der Kapillare. (B) Kapillar- und Kapillarhalterteile aus Glas. (C) Teilweise montierter Kapillarhalter. (D) Vollständig montierter Kapillarhalter. (E) Lightsheet-Montagekammer. Der Pfeil zeigte die weiße Linie an, mit der der Kapillarhalter ausgerichtet wurde. (F) Kapillarhalter, der ordnungsgemäß im Lichtblatt montiert ist. Der Pfeil zeigt die passenden weißen Linien an, die die richtige Ausrichtung des Kapillarhalters anzeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 2: Lightsheet-Imaging-Setup. (A) Schalttafel zum Einschalten von Lightsheet, Computer und Inkubationseinheit. Die Zahlen geben die Reihenfolge der Operationen an. (B) Lightsheet-Objektivkammer. (C) Bildgebende Kammer. (D) Spritze und Schläuche, die mit der Bildgebungskammer verbunden werden. (E) Die Bildgebungskammer, die ordnungsgemäß in der Objektivkammer positioniert ist, wobei alle Röhren mit den entsprechenden Anschlüssen rechts verbunden sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 3: Beispielpositionierung . (A) Suchen Sie die Schaltflächen Kapillare und Beispiel suchen in der Zen-Software, wie durch die Pfeile angegeben. (B) Die Positionierung auf der Glaskapillare. Der Pfeil zeigt die Kante der Glaskapillare an, die sich direkt über der Linse des Objektivs befindet. (C) Die Embryosuspension über die Glaskapillare hinaus. Der Pfeil zeigte den Embryo an, der in Agarose unter der Glaskapillare vor der Linse des Objektivs schwebte. (D) Blick auf den Embryo durch das Ziel. (E) Das Bedienfeld von ErgoDrive. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 4: Wichtige Symbole für die Navigation in arivis Vison4D. In jedem Bereich ist die Symbolfunktion von links nach rechts gekennzeichnet. (a) Öffnen, Speichern, Schließen. (b) Analysebereich, Tabelle Objekte anzeigen, Track-Editor öffnen. (C) Kopieren Sie den aktuellen Viewer-Inhalt als Bild in die Zwischenablage, schalten Sie Lesezeichen ein, Erstellen Sie ein hochauflösendes Bild für die aktuelle Ansicht, Toggle Storyboard. (d) Maßfeld anzeigen, Orientierungskreuz anzeigen, Legende anzeigen, Maßstabsleiste anzeigen. (e) Als 2D-Betrachter anzeigen, als Galerie-Betrachter anzeigen, als 4D-Viewer anzeigen, als Info-Viewer anzeigen, als Projektions-Viewer anzeigen. F) Aktualisieren Sie alle Keyframes, fügen Sie einen Keyframe hinzu, fügen Sie eine Keyframe-Sequenz hinzu, fügen Sie einen Keyframe ein, entfernen Sie alle Keyframes, exportieren Sie den Film, laden Sie das Storyboard, speichern Sie das Storyboard, passen Sie die Zielzeit des gesamten Films an, erster Keyframe, Wiedergabe, Pause, Stopp, letzter Keyframe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 5: Hochauflösende Bilder und Augenfeldmasken. (A-M) Eine Reihe von hochauflösenden Bildern, die von den dorsalen Aussichtspunkten aus gerendert wurden; (A’-M’) maskiert das Augenfeld für jeden entsprechenden Zeitpunkt. Jeder Bildsatz wird nach dem Zeitpunkt notiert, zu dem er ab Beginn der Bildgebung aufgenommen wurde, und dem entsprechenden Entwicklungsstadium entweder im Somitstadium (ss) oder Stunden nach der Befruchtung (hpf). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Video 1: Zeitraffervideo des Tg(rx3:GFP)-Zebrafisch-Embryos von 1 ss-24 hpf. Bitte klicken Sie mit der rechten Maustaste hier, um das Video herunterzuladen (Link speichern unter). Video 2: Zeitraffer-Video des Tg(rx3:GFP)-Zebrafisch-Embryos von 1 ss-24 hpf mit dem von der arivis Vision4D-Pipeline identifizierten Augenfeld. Bitte klicken Sie mit der rechten Maustaste hier, um das Video herunterzuladen (Link speichern unter).  Video 3: 360° Drehung eines Tg(rx3:GFP) Zebrafisch-Embryos bei 1 ss. Bitte klicken Sie mit der rechten Maustaste hier, um das Video herunterzuladen (Link speichern unter).  Video 4: 360° Drehung einer Tg(rx3:GFP) Zebrafisch Embryo Augenfeldmaske bei 1 SS. Bitte klicken Sie mit der rechten Maustaste hier, um das Video herunterzuladen (Link speichern unter).  Video 5: 360°-Drehung eines Tg(rx3:GFP)-Zebrafischembryos bei 24 hpf. Bitte klicken Sie mit der rechten Maustaste hier, um das Video herunterzuladen (Link speichern unter).  Video 6: 360° Drehung einer Tg(rx3:GFP) Zebrafisch Embryo Augenfeldmaske bei 24 Hpf. Bitte klicken Sie mit der rechten Maustaste hier, um das Video herunterzuladen (Link speichern unter).  Tabelle 1: arivis Vision4D Pipeline zur Volumenanalyse des sich entwickelnden Augenfeldes. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen. Tabelle 2: Volumen und Oberfläche des sich entwickelnden Augenfeldes, aufgenommen von arivis Vision4D. Die Reihen, die sich auf den präsumtiven Hypothalamus beziehen, sind gelb hervorgehoben, um sie von den optischen Vesikeln zu unterscheiden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Discussion

In diesem Protokoll wurde das Lightsheet-Mikroskop verwendet, um Zeitraffer-Bildgebung der Augenentwicklung durchzuführen und die resultierenden Daten wurden analysiert. Der resultierende Datensatz kann wertvolle Einblicke in den Prozess der Augenmorphogenese sowie Störungen dieses Prozesses infolge genetischer Mutationen, Exposition gegenüber pharmakologischen Wirkstoffen oder anderen experimentellen Parametern liefern. Hier demonstrierte das Protokoll, wie dieser Datensatz erhalten werden kann und lieferte ein Beispiel dafür, wie das Volumen des Augenfeldes durch frühe Entwicklung analysiert werden kann. Diese Daten erwiesen sich als reproduzierbar und konsistent (weniger als 10% Variation des Volumens) über biologische Replikate hinweg, wobei zu berücksichtigen ist, dass geringfügige Unterschiede in der Staging-Phase des Embryos vor Beginn des Durchlaufs zu einer gewissen Variation der endgültigen Volumenmessungen führen können.

Bei der anfänglichen Positionierung des Embryos in der Kapillare und bei der Positionierung des eingebetteten Embryos vor dem Ziel ist Vorsicht geboten. Die Orientierung spielt eine wichtige Rolle, um zu verhindern, dass der Embryo wächst und sich aus der Sicht des Ziels bewegt. Die Embryonen haben eine runde Form bei 10 hpf, was es schwierig macht, eine bestimmte Orientierung in der Kapillare zu gewährleisten. Idealerweise wird der Körper des Embryos seitlich in der Kapillare positioniert. Das Laden mehrerer Embryonen in die Kapillare erhöht die Wahrscheinlichkeit, einen gut positionierten Embryo zu haben.

Bei diesem Verfahren wird der Embryo in Agarose eingebettet, um ihn vor den Bildgebungs- und Beleuchtungszielen zu suspendieren. Die Wahl der richtigen Konzentration der Agarose mit niedriger Schmelztemperatur ist von entscheidender Bedeutung. Eine zu hohe Konzentration wird den Embryo einengen und verhindern, dass er sich richtig entwickelt; Eine zu geringe Konzentration führt dazu, dass die Agarose auseinanderfällt und den Embryo nicht hält. Die für dieses Protokoll optimale Konzentration ist eine Endkonzentration von 1% niedriger SchmelztemperaturAgarose 30,31.

Ein weiteres Element, das berücksichtigt werden sollte, ist der Sättigungsgrad. Wenn das Augenfeld wächst und sich differenziert, verstärkt sich die Stärke des Rx3:GFP-Signals. Daher sollten bei der Einstellung der anfänglichen Bildgebungsparameter die Belichtung und die Laserleistung reduziert werden, um das Bild zu untersättigen. Dadurch wird verhindert, dass das Bild übersättigt wird, da der Rx3:GFP im Laufe der Zeit heller wird. Es können Änderungen vorgenommen werden, um die Untersättigung in der Bildverarbeitung zu korrigieren, aber die Übersättigung kann nicht korrigiert werden, nachdem die Bilder aufgenommen wurden.

Es gibt einige zusätzliche Änderungen, die an diesem Protokoll vorgenommen werden können, die für einige Projekte, die in diesem Dokument nicht beschrieben werden, von Vorteil sein können. Beispielsweise ist es möglich, Multiview Imaging in der Bilderfassung einzurichten. Dieser Parameter würde es ermöglichen, mehrere Embryonen an verschiedenen Positionen entlang der y-Achse in jedem Zeitintervall sequentiell abzubilden. Während es den Datensatz komplexer macht, würde es die Rate der Datenerfassung erhöhen. Darüber hinaus ist es in Bezug auf die Bildverarbeitung möglich, das Augenfeld durch andere Parameter zu quantifizieren. Hier haben wir beschrieben, wie man die Daten in Bezug auf das Augenfeldvolumen quantifizieren kann. Alternativ könnte eine Pipeline erstellt werden, um einzelne Zellen zu quantifizieren und zu verfolgen oder die Rate der optischen Vesikelevagination zu bestimmen.

Wie bereits erwähnt, wurden sowohl konfokale als auch Lightsheet-Mikroskopie verwendet, um Zeitraffer-Bildgebungsstudien von Zebrafischen durchzuführen. Lightsheet wurde speziell für dieses Projekt ausgewählt, da es eine überlegene Fähigkeit hat, durch eine dicke (>1 mm) Probe zu fotografieren, weil es mit einer Inkubationseinheit ausgestattet ist, um eine ideale Temperaturumgebung für den Zebrafischembryo aufrechtzuerhalten, und weil seine Fähigkeit, schneller als die konfokale Mikroskopie abzubilden, eine Bildaufnahme in den zahlreichen Zeitintervallen ermöglicht, die für dieses Protokoll erforderlich sind, keine begleitende Beschädigung oder Photobleiche des Embryos21, 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Es ist auch wichtig zu beachten, dass das Lightsheet-Mikroskop so ausgestattet ist, dass es das Signal von mehreren Fluorophoren abbildet. Das in dieser Studie verwendete Lightsheet-Mikroskop verfügt über Festkörperlaser-Anregungslinien bei 405, 445, 488, 515, 561 und 638 nm, die für die Abbildung transgener Embryonen nützlich sein könnten, die mehr als ein fluoreszierendes Reportertransgen exprimieren.

Während dieses Protokoll Anweisungen für die Bildaufnahmeanalyse speziell mit dem Lightsheet Z.1 Dual Illumination Microscope System und der arivis Vision4D-Analysesoftware enthält, gibt es andere kommerziell erhältliche Lightsheet-Mikroskope von Leica, Olympus und Luxendo sowie Bildanalysesoftware von Imaris, mit denen ähnliche Ergebnisse erzielt werden können. Die Auswahl der Ausrüstung und Software für dieses Protokoll wurde durch die Verfügbarkeit in unserem Institut bestimmt.

Zusammenfassend wird erwartet, dass dieses Protokoll einen soliden Ausgangspunkt für die Durchführung von Zeitrafferbildern mit Lightsheet-Mikroskopie und für die Bildquantifizierung der frühen Augenentwicklung bei Zebrafischen bieten wird.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde vom Büro des Direktors der National Institutes of Health (NIH) unter der Preisnummer S10OD020067 und vom NIH-Preis R01EY021769 (an A.C.M.) unterstützt. Wir danken Doug Harrison und Jim Begley im Arts & Sciences Imaging Center der University of Kentucky und Lucas Vieira Francisco und Evelyn M. Turnbaugh für die fachkundige Pflege von Zebrafischen.

Materials

60mL Syringe Luer-Lok Tip BD 309653
Agarose, Low Melting Temperature Promega V2111
arivis Vision4D Software arivis https://www.arivis.com/en/imaging-science/arivis-vision4d
Dumoxel N3C Forceps Dumont 0203-N3C-PO
E3 fish buffer (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4)
Glass Capillary – Size 2 (~1mm) Zeiss Black/701904
Heidelberger Extension Line 100cm B. Braun 4097262
Light & Filter Set – Royal Blue Night Sea SFA-LFS-RB
Petri Dish (100 x 15 mm) VWR 25384-302
Stereomicroscope Fluorescence Adapter NightSea
Teflon Tipped Plunger – Size 2 Zeiss #701997
Tg(rx3:GFP) zebrafish This line was established by Rembold et al.13
Tricaine (MS222) Sigma A-5040
Z.1 Lightsheet Zeiss
Zen Software Zeiss https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html
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References

  1. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  2. Li, Z., Joseph, N. M., Easter, S. S. The morphogenesis of the zebrafish eye, including a fate map of the optic vesicle. Developmental Dynamics. 218 (1), 175-188 (2000).
  3. Chow, R. L., Lang, R. A. Early eye development in vertebrates. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 255-296 (2001).
  4. Wilson, S. W., Houart, C. Early steps in the development of the forebrain. Developmental Cell. 6 (2), 167-181 (2004).
  5. Picker, A., et al. Dynamic coupling of pattern formation and morphogenesis in the developing vertebrate retina. PLoS Biology. 7 (10), 1000214 (2009).
  6. Fuhrmann, S. Eye morphogenesis and patterning of the optic vesicle. Current Topics in Developmental Biology. 93, 61-84 (2010).
  7. Kwan, K. M., et al. Bin A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
  8. Heermann, S., Schütz, L., Lemke, S., Krieglstein, K., Wittbrodt, J. Eye morphogenesis driven by epithelial flow into the optic cup facilitated by modulation of bone morphogenetic protein. eLife. 4, 05216 (2015).
  9. Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schütz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt. Open Biology. 9 (2), (2019).
  10. Yoon, K. H., Fox, S. C., Dicipulo, R., Lehmann, O. J., Waskiewicz, A. J. Ocular coloboma: Genetic variants reveal a dynamic model of eye development. American Journal of Medical Genetics Part C: Seminars in Medical Genetics. 184 (3), 590-610 (2020).
  11. Sidhaye, J., Norden, C. Concerted action of neuroepithelial basal shrinkage and active epithelial migration ensures efficient optic cup morphogenesis. eLife. 6, 22689 (2017).
  12. Pillai-Kastoori, L., Wen, W., Morris, A. C. Keeping an eye on SOXC proteins. Developmental Dynamics. 244, 367-376 (2015).
  13. Rembold, M., et al. Individual cell migration serves as the driving force for optic vesicle evagination. Science. 313, 1130-1134 (2006).
  14. Loosli, F., et al. Loss of eyes in zebrafish caused by mutation of chokh/rx 3. EMBO Reports. 4 (9), 894-899 (2003).
  15. Chuang, J. C., Mathers, P. H., Raymond, P. A. Expression of three Rx homeobox genes in embryonic and adult zebrafish. Mechanisms of Development. 84 (1-2), 195-198 (1999).
  16. Cavodeassi, F., et al. Early stages of zebrafish eye formation require the coordinated activity of Wnt11, Fz5, and the Wnt/β-catenin pathway. Neuron. 47 (1), 43-56 (2005).
  17. Ivanovitch, K., Cavodeassi, F., Wilson, S. W. Precocious acquisition of neuroepithelial character in the eye field underlies the onset of eye morphogenesis. Developmental Cell. 27 (3), 293-305 (2013).
  18. Ebert, A. M., Childs, S. J., Hehr, C. L., Cechmanek, P. B., McFarlane, S. Sema6a and Plxna2 mediate spatially regulated repulsion within the developing eye to promote eye vesicle cohesion. Development (Cambridge). 141 (12), 2473-2482 (2014).
  19. Emerson, S. E., et al. Identification of target genes downstream of semaphorin6A/plexinA2 signaling in zebrafish. Developmental Dynamics. 246 (7), 539-549 (2017).
  20. Hehr, C. L., Halabi, R., McFarlane, S. Polarity and morphogenesis of the eye epithelium requires the adhesion junction associated adaptor protein Traf4. Cell Adhesion and Migration. 12 (5), 489-502 (2018).
  21. Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. Journal of Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
  22. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  23. Reynaud, E. G., Kržič, U., Greger, K., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy: More dimensions, more photons, and less photodamage. HFSP Journal. 2 (5), 266-275 (2008).
  24. Icha, J., et al. Using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (110), e53966 (2016).
  25. Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
  26. Pampaloni, F., Chang, B. J., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy (LSFM) for the quantitative imaging of cells and tissues. Cell and Tissue Research. 360 (1), 129-141 (2015).
  27. Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: A quantitative transition is underway. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (5), 327-339 (2014).
  28. Park, O. K., et al. 3D light-sheet fluorescence microscopy of cranial neurons and vasculature during zebrafish embryogenesis. Molecules and Cells. 38 (11), 975-981 (2015).
  29. Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nature Biotechnology. 34 (12), 1267-1278 (2016).
  30. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
  31. Keller, P. J., et al. Fast, high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nature Methods. 7 (8), 637-642 (2010).
  32. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: A review. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
  33. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12 (1), 30-34 (2014).
  34. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
  35. Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)., 5th Edition. , (2007).
  36. Hirsinger, E., Steventon, B. A versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (1199), e55210 (2017).
  37. Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. Journal of Neurobiology. 37 (4), 622-632 (1998).
  38. Cavodeassi, F., Ivanovitch, K., Wilson, S. W. Eph/Ephrin signalling maintains eye field segregation from adjacent neural plate territories during forebrain morphogenesis. Development (Cambridge). 140 (20), 4193-4202 (2013).
  39. Muthu, V., Eachus, H., Ellis, P., Brown, S., Placzek, M. Rx3 and Shh direct anisotropic growth and specification in the zebrafish tuberal/anterior hypothalamus. Development (Cambridge). 143 (14), 2651-2663 (2016).
  40. Rojas-Muñoz, A., Dahm, R., Nüsslein-Volhard, C. chokh/rx3 specifies the retinal pigment epithelium fate independently of eye morphogenesis. Developmental Biology. 288 (2), 348-362 (2005).

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Lightsheet MicroscopyOcular MorphogenesisRx3:GFPTransgenic ZebrafishEmbryo ImagingAgarose EmbeddingCapillary LoadingReal-time VisualizationTemporal ResolutionDevelopmental Biology

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Petersen, R. A., Morris, A. C. Visualizing Ocular Morphogenesis by Lightsheet Microscopy Using rx3:GFP Transgenic Zebrafish. J. Vis. Exp. (170), e62296, doi:10.3791/62296 (2021).
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