Visualisation de la morphogenèse oculaire par microscopie Lightsheet à l’aide de rx3:GFP Transgenic Zebrafish

Toutes les expériences impliquant l’utilisation de poisson-zèbre ont été réalisées conformément aux protocoles établis par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université du Kentucky (IACUC). 1. Préparation de l’échantillon Installez une paire d’accouplement de poissons-zèbres Tg(Rx3:GFP) dans un réservoir croisé fermé la nuit avant que l’imagerie ne soit planifiée. Le lendemain matin, tirez la porte alors que les lumières s’allument dans l’installation de pêche34,35.REMARQUE: Le couple de poissons d’accouplement sélectionné doit être âgé de 4 mois à 2 ans et se distingue facilement comme mâle ou femelle en fonction de la forme du corps et de la coloration35. Vérifiez les croix toutes les demi-heures pour les embryons et notez à quelle heure les embryons sont visualisés pour la première fois dans le fond du réservoir transversal. Transférer les embryons dans une boîte de Pétri et maintenir les embryons à 28,5 °C pendant environ 10 h pour se développer au stade 1-2 somite (ss). Commencez à imager au stade 1-2 somite (ss). Pour dépister la présence de somites, observez les embryons sous un stéréoscope à 10 hpf et comptez le nombre de somites1.REMARQUE: Les embryons qui sont au-delà du stade unique de somite ne doivent pas être utilisés pour cette expérience. Parmi les embryons qui sont au stade unique de somite, dépister l’expression de GFP à l’aide d’un adaptateur de fluorescence en combinaison avec un stéréomicroscope pour confirmer la présence du transgène Rx3:GFP. Une fois que 3 à 5 personnes positives à la GFP ont été identifiées, utilisez des pinces fines pour déséchorioner les embryons et transférez-les dans une petite boîte de Pétri contenant un tampon embryonnaire E3 avec une pipetteen verre 35. Anesthésier les embryons en les transférant dans un tampon embryonnaire E3 de 0,5 mL (pH 7) contenant 0,168 mg/mL de Tricaïne (MS222) dans un tube de microcentrifugation35,36. Les mouvements musculaires spontanés commencent dès 17 hpf37. Assurez-vous que les embryons sont anesthésiés à l’image au-delà de ce point temporel. Incorporer les embryons dans 1% d’agarose à basse température de fusion dans 0,168 mg / mL de Tricaïne et E3.REMARQUE: Il s’agit de la concentration optimale d’agarose à basse température de fusion pour permettre à l’embryon d’être maintenu en place mais de rester suffisamment souple pour permettre la croissance de l’embryon au cours du temps d’imagerie30,31. Préparer une solution de 10 mL d’agarose à basse température de fusion à 2 % dans un tampon E3. Chauffez-le dans un four à micro-ondes pour dissoudre l’agarose à des intervalles de 15 s, pour éviter que la solution ne bouille. Laissez la solution refroidir suffisamment pour tenir sans inconfort, mais pas au point de se solidifier et de ne pas nuire aux embryons. Une fois que l’agarose est suffisamment froide, ajouter 0,5 mL aux embryons dans le tube de Tricaine dans E3 et pipeter doucement la solution et les embryons à mélanger. À l’aide d’un capillaire en verre de 1 mm et d’un piston en polytétrafluoroéthylène (PTFE), remontez les embryons de la solution d’agarose dans le capillaire. Assurez-vous de tirer un total de 3 à 5 embryons (embryons multiples) dans le capillaire pour augmenter la probabilité d’avoir un embryon bien positionné.REMARQUE: En raison de la nature ronde des embryons à ce moment-là, il est difficile de garantir une orientation spécifique dans le capillaire. Idéalement, le corps de l’embryon sera positionné latéralement dans le capillaire, ce qui permettra une plus grande facilité de positionnement dans le microscope. Laissez l’agarose se solidifier sur une période de 30 à 60 s à température ambiante. Placer le capillaire dans un bécher de 0,168 mg/mL de Tricaine dans un tampon E3 jusqu’à ce qu’il soit prêt à être photographié (Figure 1A).REMARQUE: L’excès de solution d’agarose à basse température de fusion de 2% peut être autorisé à se solidifier et ensuite réchauffé dans de futures expériences. Placer le capillaire dans le porte-échantillon (figure 1B-F) comme décrit à l’étape 2.5. 2. Configuration de Zeiss Lightsheet Z.1 Allumez chaque composant du microscope et de l’ordinateur dans l’ordre suivant : 1) Système, 2) PC, puis 3) Incubation (Figure 2A). Placez l’objectif d’imagerie 20x et l’objectif d’éclairage 10x dans la chambre du microscope. Faites correspondre les paramètres d’objectif dans l’interface zen Software sous l’onglet Maintenir . Faites glisser la chambre (Figure 2C) dans le boîtier sur la voie (Figure 2B) avec le tube tourné vers l’extérieur. Le tube se connecte aux orifices appropriés sur la droite, comme illustré à la figure 2E. Fixez la ligne d’extension à la seringue à l’aide du mécanisme de verrouillage (Figure 2D); remplissez-le de Tricaine en E3 et placez-le dans le support fixé à droite du microscope35. Connectez l’extension fixée à la seringue remplie de Tricaine en E3 en bas à droite de la chambre avec le mécanisme luer-lock. Poussez le piston pour remplir la chambre avec le tampon Tricaine/E3. Fermez la porte de la chambre. Placez le capillaire avec l’échantillon dans le porte-échantillon capillaire. Le porte-échantillon capillaire comprend deux manchons en caoutchouc, un disque porte-échantillon en métal, une tige en métal et un capuchon en métal (figure 1B). Cliquez sur la gaine métallique au centre du disque métallique (Figure 1C). Placez les deux bouchons en caoutchouc dans la gaine, les fentes faisant face aux extrémités de la gaine suivies du capillaire. Faites glisser le capillaire au milieu des bouchons en caoutchouc. Fixez-le en place avec le capuchon métallique une fois que le marqueur est à la base de la gaine métallique (Figure 1D). Placez le porte-échantillon capillaire sur le dessus du microscope, avec les marques blanches alignées (Figure 1E,F). Fermez le couvercle. Cliquez sur le bouton Localiser capillaire sur l’interface du logiciel (Figure 3A). Utilisez le panneau de commande ErgoDrive, un dispositif manuel qui contrôle l’orientation capillaire (Figure 3E), pour déplacer le capillaire et le positionner juste au-dessus de l’objectif (Figure 3B). Ouvrez le couvercle et appuyez doucement sur le piston jusqu’à ce que la section d’agarose contenant l’embryon soit suspendue sous le fond capillaire et se trouve devant l’objectif (Figure 3C). Désactivez Localiser les capillaires et cliquez sur le bouton Localiser l’échantillon (Figure 3A). Cela permet de basculer la vue de la webcam de la chambre d’échantillonnage vers l’objectif du microscope (Figure 3D). Utilisez cette vue pour ajuster plus précisément la position de l’échantillon. Désactivez Localiser l’échantillon (Figure 3A). Basculez vers l’onglet Acquisition . Cochez les cases Z-Stack et Time Series. Dans la fenêtre Paramètres du mode d’acquisition , choisissez le paramètre Dual Side Lightsheet et cochez les cases Fusion double face en ligne et Balayage pivotant. Dans la fenêtre Canaux , choisissez 488 canaux, réglez la puissance laser sur 1 et le temps d’exposition sur 7,5 ms. Ensuite, cliquez sur le bouton Continu pour obtenir une vue en direct de l’embryon. Utilisez le panneau de commande ErgoDrive pour régler la position de l’embryon jusqu’à ce que le champ oculaire soit directement face à la caméra. Continuez à régler les feuilles lumineuses gauche et droite dans les paramètres Canaux jusqu’à ce que le champ oculaire soit suffisamment mis au point. Définissez les paramètres Z-Stack à l’aide du panneau de commande ErgoDrive pour vous déplacer dans le plan Z. Réglez la première et la dernière position Z autour de 500 μm au-delà du dernier signal fluorescent détectable. Cela laisse de la place pour que le champ oculaire reste dans le cadre au fur et à mesure que l’embryon se développe tout au long de la séance d’imagerie en accéléré. Après avoir défini la plage du Z-Stack, cliquez sur le bouton Optimal pour définir la taille du pas à 0,477 μm, le réglage optimal. Réglez les paramètres d’incubation en cochant la case de l’unité Peltier pour maintenir la température à 28 °C. Dans la fenêtre Série chronologique , choisissez la fréquence et l’intervalle de temps pour acquérir des images. Dans ce protocole, les paramètres ont été réglés sur l’image toutes les 5 minutes, pour un total de 166 intervalles. Cliquez sur le bouton Démarrer l’expérience . Choisissez le dossier dans lequel enregistrer l’ensemble d’images. Définissez le préfixe de l’image et appuyez sur Enregistrer pour démarrer l’imagerie.REMARQUE: Le microscope va maintenant parcourir chaque ensemble d’images à l’intervalle spécifié. Une fois la séance d’imagerie time-lapse terminée, envoyez la scène à la position de charge et retirez le porte-échantillon capillaire. Démontez le porte-échantillon capillaire dans l’ordre inverse dans lequel il a été assemblé et utilisez le piston pour retirer l’échantillon et l’excès d’agarose du capillaire. Ouvrez la porte de la chambre. Utilisez la seringue pour retirer le liquide de la chambre, débranchez et retirez la chambre, puis rincez à l’eau et séchez à l’air. 3. Analyse d’images Ouvrez le logiciel arivis Vision4D. Cliquez sur Fichier, puis choisissez Importer un fichier. Sélectionnez tous les fichiers .czi de la session d’imagerie time-lapse et ouvrez-les. La fenêtre suivante s’ouvre avec les options sur la façon d’importer les fichiers; sélectionnez Z-stacks comme Frames pour ordonner les z-stacks dans l’ordre obtenu. Une fois les fichiers importés, le logiciel enregistre en un seul fichier .sis. Pour spécifier l’emplacement du fichier à enregistrer, sélectionnez le dossier avant de cliquer sur Importer. Une fois le fichier importé, arivis est maintenant prêt à restituer une vidéo des images time-lapse. Cliquez sur le cube de la visionneuse 4D dans le coin inférieur gauche et sur l’icône de la barre d’échelle (Figure 4D-E). Cliquez sur l’icône vidéo pour placer la barre des tâches Storyboard en bas de l’écran (Figure 4C). Dans la barre des tâches Storyboard , choisissez Ajouter une séquence d’images clés (Figure 4F). Spécifiez la durée de la vidéo en secondes, décochez la case Créer une rotation et cochez la case Utiliser la progression temporelle pour inclure les points temporels spécifiques dans la vidéo. Le logiciel affiche ces paramètres à droite de la barre des tâches Storyboard pour tout ajustement à tout moment. Enregistrez le storyboard pour appliquer les mêmes paramètres à plusieurs jeux d’images (Figure 4F). Cliquez sur Exporter le film pour enregistrer une vidéo de l’imagerie time-lapse (Figure 4F). Spécifiez les paramètres d’exportation du film, notamment le nom et l’emplacement du fichier, le format vidéo (.mp4), la résolution vidéo (1 080 p), la fréquence d’images (60 IPS) et la résolution des données (1 297 x 1 297 x 784). Ajoutez des horodatages ici, si vous le souhaitez. Une fois ces paramètres définis, choisissez Enregistrer (Figure 4F). Les étapes 3.4 et 3.5 peuvent être répétées avec la modification de l’étape 3.4 pour créer des vidéos de rotation à des moments spécifiques. Lorsque vous ajoutez une séquence d’images clés au storyboard, cochez la case Créer une rotation , puis décochez utiliser la progression temporelle. Ensuite, suivez les mêmes instructions qu’à l’étape 3.5. Pour restituer une image haute résolution à n’importe quelle orientation et à n’importe quel point temporel, sélectionnez l’icône Caméra dans la visionneuse 4D pour obtenir une image haute résolution (Figure 4C). Pour créer un pipeline à des fins d’analyse, choisissez l’icône Flacon pour accéder au panneau Analyse (Figure 4B). Dans le panneau Analyse , cliquez sur le menu déroulant Opérations d’analyse . À titre d’exemple, le protocole illustre ci-dessous la séquence d’opérations pour un pipeline d’analyse de volume. Exécutez ou annulez chaque étape du pipeline individuellement pour affiner chaque paramètre (Tableau 1). Cliquez sur le triangle bleu en haut du pipeline pour permettre au pipeline de s’exécuter.REMARQUE: Cela prendra un certain temps en fonction de la vitesse de l’ordinateur. Une fois le pipeline optimisé, il peut être facilement exporté et importé dans arivis et appliqué à plusieurs jeux de données dans une analyse par lots. Pour accéder à l’analyse par lots, cliquez sur Analyse par lots sous l’onglet Analyse . Une fois le pipeline exécuté, une fenêtre s’affiche avec tous les objets trouvés. Accédez-y manuellement via l’icône Tableau (Figure 4B). En haut de cette fenêtre, cliquez sur la case intitulée Colonnes de fonctionnalités pour afficher une liste de fonctionnalités pouvant fournir des informations sur l’objet d’intérêt. Pour l’analyse du volume du champ oculaire, ces caractéristiques incluent la surface, le volume (Volume, VoxelCount), les intensités #1 (moyenne), les attributs (Id, Type) et le point temporel (First). Cliquez sur Exporter pour exporter les données vers une feuille de calcul.