Hier wordt een protocol verstrekt voor time-lapse beeldvorming van oculaire morfogenese met behulp van een commercieel beschikbare lightsheet-microscoop en een beeldverwerkingswerkstation om de resulterende gegevens te analyseren. Dit protocol beschrijft de procedures voor embryo-anesthesie, inbedding in agarose bij lage smelttemperatuur, suspensie in de beeldvormingskamer, het instellen van de beeldvormingsparameters en ten slotte het analyseren van de beeldvormingsgegevens met behulp van beeldanalysesoftware.
De ontwikkeling van gewervelde ogen is een complex proces dat begint aan het einde van de embryo-gastrulatie en vereist de precieze coördinatie van celmigratie, proliferatie en differentiatie. Time-lapse imagining biedt uniek inzicht in het gedrag van cellen tijdens de ontwikkeling van de ogen, omdat het ons in staat stelt om oculogenese in vivo te visualiseren. Zebravissen zijn een uitstekend model om dit proces te visualiseren vanwege hun zeer geconserveerde gewervelde oog en hun vermogen om zich snel en extern te ontwikkelen terwijl ze optisch transparant blijven. Time-lapse beeldvormingsstudies van de ontwikkeling van zebravissen worden sterk vergemakkelijkt door het gebruik van de transgene zebravislijn Tg (rx3: GFP). In de zich ontwikkelende voorhersenen markeert rx3: GFP-expressie de cellen van het enkele oogveld en GFP blijft tot expressie komen als het oogveld evaginat om een optische blaasjes te vormen, die vervolgens invagineert om een optische cup te vormen. Hoge resolutie timelapse beeldvorming van rx3: GFP-expressie stelt ons daarom in staat om het oog primordium door de tijd te volgen terwijl het zich ontwikkelt tot het netvlies. Lightsheet-microscopie is een ideale methode om oculaire morfogenese in de loop van de tijd in beeld te brengen vanwege het vermogen om dikkere monsters voor fluorescerende beeldvorming te penetreren, fotobleaching en fototoxiciteit te minimaliseren en met een hoge snelheid te beeld te geven. Hier wordt een protocol verstrekt voor time-lapse beeldvorming van oculaire morfogenese met behulp van een commercieel beschikbare lightsheet-microscoop en een beeldverwerkingswerkstation om de resulterende gegevens te analyseren. Dit protocol beschrijft de procedures voor embryo-anesthesie, inbedding in agarose bij lage smelttemperatuur, suspensie in de beeldvormingskamer, het instellen van de beeldvormingsparameters en ten slotte het analyseren van de beeldvormingsgegevens met behulp van beeldanalysesoftware. De resulterende dataset kan waardevolle inzichten bieden in het proces van oculaire morfogenese, evenals verstoringen van dit proces als gevolg van genetische mutatie, blootstelling aan farmacologische agentia of andere experimentele manipulaties.
Embryonale ontwikkeling is een complex proces dat de precieze coördinatie van veel verschillende gebeurtenissen vereist. De vorming van het gewervelde oog begint in de zich ontwikkelende voorhersenen, waar een deel van de cellen wordt gespecificeerd als het oogveld. Deze cellen zullen evaginaateren naar het oppervlak ectoderm, wat aanleiding geeft tot twee bilaterale optische blaasjes 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Contact met het oppervlakte-ectoderm induceert vervolgens een invaginatie van het optische blaasje in een optische beker. Het oppervlakte-ectoderm zal aanleiding geven tot de voorste structuren van het oog, zoals de lens en het hoornvlies, terwijl de optische cup aanleiding zal geven tot het neurale netvlies en het retinale gepigmenteerde epitheel 1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,12 . Verstoringen in dit proces kunnen leiden tot aangeboren afwijkingen zoals microftalmie, anoftalmie en coloboom (MAC). Op dit moment zijn er geen opties om deze defecten te corrigeren 3,5,6,7,9,10,11,12. Verdere studies van de mechanismen van oculaire morfogenese en de problemen die kunnen leiden tot MAC zullen een basis van kennis bieden die mogelijk zal leiden tot behandelingen. Een krachtig hulpmiddel om het dynamische gedrag van cellen tijdens de oogontwikkeling te onderzoeken, is time-lapse imagining, waardoor dit proces in vivo en in realtime kan worden gevisualiseerd en gekarakteriseerd.
Zebravissen (Danio rerio) zijn een uitstekend model om vroege oculaire ontwikkeling te visualiseren met behulp van time-lapse beeldvorming. Ze hebben een sterk geconserveerd gewerveld oog en bezitten het vermogen om zich snel en extern te ontwikkelen terwijl ze optisch transparant blijven1. Zebravissen bieden een geweldige bron voor time-lapse beeldvorming vanwege deze kenmerken die zoogdiermodellen missen. Time-lapse beeldvormingsstudies van de ontwikkeling van zebravissen worden sterk vergemakkelijkt door het gebruik van de transgene zebravislijn Tg (rx3: GFP) 13. Rx3 (Retinal homeobox protein 3) is een transcriptiefactor die essentieel is voor de ontwikkeling van het oog14. Rx3 is de eerste van de drie rx-genen in de zebravis die tot expressie wordt gebracht en begint zijn expressie halverwege de gastrulatie, ongeveer 8 uur na de bevruchting (hpf)15,16. Het rx3:GFP transgen kan worden gevisualiseerd in de zich ontwikkelende voorhersenen vanaf de 1 somite fase (ss), ongeveer 10 hpf 15,17,18,19,20. In de zich ontwikkelende voorhersenen markeert rx3:GFP-expressie de cellen van het enkele oogveld en GFP (groen fluorescerend eiwit) blijft tot expressie komen door de rest van de oculaire morfogenese. Hoge resolutie timelapse beeldvorming van rx3: GFP-expressie stelt ons daarom in staat om het enkele oogveld door de tijd te volgen terwijl het zich ontwikkelt tot het netvlies 17,18,20.
Time-lapse beeldvormingsstudies van de ontwikkeling van zebravissen zijn voornamelijk uitgevoerd met behulp van confocale of Lightsheet-microscopie. Confocale microscopie is voordelig omdat het de nauwkeurige beeldvorming van monsters langs de z-as mogelijk maakt en het fluorescerende achtergrondsignaal vermindert. Het wordt echter beperkt door de hoeveelheid tijd die het kost om een afbeelding te verkrijgen, de stijfheid van de monsterpositie en de neiging tot fotobleaching en fototoxiciteit van levende monsters. Lightsheet-microscopie is een ideale methode om oculaire morfogenese in de loop van de tijd in beeld te brengen vanwege het vermogen om dikkere monsters te penetreren voor fluorescerende beeldvorming, verhoogde flexibiliteit in monsteroriëntatie, geminimaliseerde fotobleaching en fototoxiciteit en beeldvorming met een hoge snelheid 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 31. De ruimtelijke resolutie die haalbaar is met de huidige lichtplaatmicroscopiesystemen is ongeveer 250-500 nanometer (nm). Hoewel dit niet significant verschilt van wat kan worden verkregen met confocale microscopie, kan het monster vrij worden gedraaid en vanuit meerdere hoeken worden afgebeeld, waardoor zowel de beelddiepte als de resolutie worden verbeterd en veel meer flexibiliteit wordt geboden voor in vivo time-lapse beeldvormingsexperimenten dan het confocale platform27,32 . Om deze redenen wordt Lightsheet-microscopie snel de favoriete methode voor time-lapse beeldvormingsstudies van de ontwikkeling van zebravissen. Dit protocol beschrijft de stappen voor het kwantificeren van oculogenese door middel van de beeldvorming van Rx3: GFP transgene zebravissen met behulp van een in de handel verkrijgbare Lightsheet-microscoop33 en beschrijft een pijplijn voor beeldanalyse met behulp van het arivis-softwareplatform.
In dit protocol werd de Lightsheet-microscoop gebruikt om time-lapse-beeldvorming van oogontwikkeling uit te voeren en de resulterende gegevens werden geanalyseerd. De resulterende dataset kan waardevolle inzichten bieden in het proces van oculaire morfogenese, evenals verstoringen van dit proces als gevolg van genetische mutatie, blootstelling aan farmacologische agentia of andere experimentele parameters. Hier demonstreerde het protocol hoe deze dataset kan worden verkregen en gaf het een voorbeeld van hoe het volume van het oogveld door vroege ontwikkeling kan worden geanalyseerd. Deze gegevens bleken reproduceerbaar en consistent te zijn (minder dan 10% variatie in volume) tussen biologische replicaties, rekening houdend met het feit dat kleine verschillen in embryostadiëring voorafgaand aan het begin van de run kunnen leiden tot enige variatie in de uiteindelijke volumemetingen.
Voorzichtigheid is geboden bij de eerste positionering van het embryo in het capillair en bij het positioneren van het ingebedde embryo voor het doel. Oriëntatie speelt een belangrijke rol bij het voorkomen dat het embryo groeit en uit het zicht van het doel beweegt. De embryo’s hebben een ronde vorm bij 10 pkf, wat het een uitdaging maakt om een specifieke oriëntatie in het capillair te garanderen. Idealiter wordt het lichaam van het embryo zijdelings in het capillair geplaatst. Het laden van meerdere embryo’s in het capillair verhoogt de kans op een goed gepositioneerd embryo.
Bij deze procedure wordt het embryo ingebed in agarose om het op te hangen voor de beeldvormings- en verlichtingsdoelstellingen. Het kiezen van de juiste concentratie van de lage smelttemperatuur agarose is van cruciaal belang. Een te hoge concentratie zal het embryo vernauwen en verhinderen dat het zich goed ontwikkelt; een te lage concentratie zal ertoe leiden dat de agarose uit elkaar valt en het embryo niet vasthoudt. De optimale concentratie voor dit protocol is een eindconcentratie van 1% lage smelttemperatuur agarose30,31.
Een ander element waarmee rekening moet worden gehouden, is het verzadigingsniveau. Naarmate het oogveld groeit en differentieert, wordt de sterkte van het Rx3:GFP-signaal intenser. Daarom moeten bij het instellen van de initiële beeldparameters de belichting en het laservermogen worden verminderd om het beeld te onderverzadigen. Dit voorkomt dat het beeld oververzadigd raakt naarmate de Rx3:GFP na verloop van tijd helderder wordt. Er kunnen wijzigingen worden aangebracht om te corrigeren voor onderverzadiging in de beeldverwerking, maar oververzadiging kan niet worden gecorrigeerd nadat de afbeeldingen zijn verkregen.
Er zijn een paar extra wijzigingen die in dit protocol kunnen worden aangebracht die voordelig kunnen zijn voor sommige projecten die niet in dit artikel worden beschreven. Zo is het mogelijk om Multiview imaging in te stellen in de beeldacquisitie-set. Met deze parameter kunnen meerdere embryo’s op verschillende posities langs de y-as achtereenvolgens in beeld worden gebracht bij elk tijdsinterval. Hoewel het de dataset complexer maakt, zou het de snelheid van gegevensverzameling verhogen. Bovendien is het in termen van beeldverwerking mogelijk om het oogveld te kwantificeren door andere parameters. Hier hebben we beschreven hoe we de gegevens kunnen kwantificeren in termen van het oogveldvolume. Als alternatief kan een pijplijn worden gemaakt om individuele cellen te kwantificeren en te volgen of de snelheid van evaginatie van optische blaasjes te bepalen.
Zoals eerder vermeld, zijn zowel confocale als Lightsheet-microscopie gebruikt om time-lapse beeldvormingsstudies van zebravissen uit te voeren. Lightsheet werd specifiek gekozen voor dit project vanwege zijn superieure vermogen om door een dik (> 1 mm) monster te fotograferen, omdat het is uitgerust met een incubatie-eenheid om een ideale temperatuuromgeving voor het zebravisembryo te behouden, en omdat het vermogen om sneller te beeld te geven dan confocale microscopie zorgt voor beeldverwerving met de vele tijdsintervallen die nodig zijn voor dit protocol, geen begeleidende schade of fotobleaching van het embryo21, 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Het is ook belangrijk op te merken dat de Lightsheet-microscoop is uitgerust om het signaal van meerdere fluoroforen in beeld te brengen. De Lightsheet-microscoop die in deze studie wordt gebruikt, heeft solid state laser-excitatielijnen op 405, 445, 488, 515, 561 en 638 nm, wat nuttig kan zijn voor het afbeelden van transgene embryo’s die meer dan één fluorescerend reportertransgen tot expressie brengen.
Hoewel dit protocol instructies beschrijft voor beeldacquisitieanalyse, specifiek met behulp van het Lightsheet Z.1 Dual Illumination Microscope System en arivis Vision4D-analysesoftware, zijn er andere in de handel verkrijgbare Lightsheet-microscopen gemaakt door Leica, Olympus en Luxendo, evenals beeldanalysesoftware van Imaris, die kunnen worden gebruikt om vergelijkbare resultaten te bereiken. De selectie van apparatuur en software voor dit protocol werd bepaald door de beschikbaarheid bij onze instelling.
Samenvattend wordt verwacht dat dit protocol een solide startpunt zal bieden voor het uitvoeren van time-lapse beeldvorming met behulp van Lightsheet-microscopie en voor beeldkwantificering van vroege oogontwikkeling bij zebravissen.
The authors have nothing to disclose.
Onderzoek gerapporteerd in deze publicatie werd ondersteund door het Office of The Director van de National Institutes of Health (NIH) onder awardnummer S10OD020067 en door NIH award R01EY021769 (aan A.C.M.). We zijn dankbaar voor de hulp van Doug Harrison en Jim Begley in het Arts & Sciences Imaging Center aan de Universiteit van Kentucky, en lucas Vieira Francisco en Evelyn M. Turnbaugh voor deskundige zebravisverzorging.
60mL Syringe Luer-Lok Tip | BD | 309653 |
Agarose, Low Melting Temperature | Promega | V2111 |
arivis Vision4D Software | arivis | https://www.arivis.com/en/imaging-science/arivis-vision4d |
Dumoxel N3C Forceps | Dumont | 0203-N3C-PO |
E3 fish buffer (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4) | ||
Glass Capillary – Size 2 (~1mm) | Zeiss | Black/701904 |
Heidelberger Extension Line 100cm | B. Braun | 4097262 |
Light & Filter Set – Royal Blue | Night Sea | SFA-LFS-RB |
Petri Dish (100 x 15 mm) | VWR | 25384-302 |
Stereomicroscope Fluorescence Adapter | NightSea | |
Teflon Tipped Plunger – Size 2 | Zeiss | #701997 |
Tg(rx3:GFP) zebrafish | This line was established by Rembold et al.13 | |
Tricaine (MS222) | Sigma | A-5040 |
Z.1 Lightsheet | Zeiss | |
Zen Software | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |