使用rx3：GFP转基因斑马鱼通过光片显微镜可视化眼部形态发生

所有涉及使用斑马鱼的实验都是根据肯塔基大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）制定的协议进行的。 1. 样品制备 在计划成像的前一天晚上，在门控杂交池中设置一对Tg（Rx3：GFP）斑马鱼的交配。第二天早上，当34，35号鱼设施的灯亮起时，拉上大门。注意：选择的交配鱼应在4个月至2岁之间，并且根据体型和颜色35很容易区分为雄性或雌性。 每半小时检查一次胚胎的杂交，并注意胚胎在交叉罐底部首次可见的时间。将胚胎转移到培养皿中，并将胚胎保持在28.5°C约10小时以发育到1-2 somite阶段（ss）。在1-2 somite阶段（ss）开始成像。 为了筛查体质的存在，在10 hpf的立体镜下观察胚胎，并计算体质的数量1。注意：任何超过单个somite阶段的胚胎都不应用于此实验。 在处于单个体温阶段的胚胎中，使用荧光适配器与立体显微镜结合筛选GFP表达，以确认Rx3：GFP转基因的存在。一旦确定了3-5个GFP阳性个体，使用细镊子将胚胎去皮化，并用玻璃移液器35将它们转移到含有E3胚胎缓冲液的小培养皿中。 通过将胚胎转移到含有0.168mg / mL三卡因（MS222）的0.5mL E3胚胎缓冲液（pH 7）中在微量离心管35，36中来麻醉胚胎。自发肌肉运动早在17 hpf37就开始了。确保对胚胎进行麻醉，以成像超过此时间点。 将胚胎嵌入1%低熔点温度琼脂糖中，在0.168mg / mL三卡因和E3中。注意：这是低熔化温度琼脂糖的最佳浓度，允许胚胎保持在原位，但保持足够的柔韧性，允许胚胎在成像时间过程中生长30，31。 在E3缓冲液中制备10mL 2%低熔点温度琼脂糖溶液。在微波炉中加热，每隔15秒溶解琼脂糖，以防止溶液沸腾。让溶液足够冷却以保持而不会感到不适，但不要太多以使其固化，并且不会对胚胎造成伤害。一旦琼脂糖足够冷却，在E3中向Tricaine管中的胚胎中加入0.5mL，并轻轻移液溶液和胚胎以混合。 使用1mm玻璃毛细管和聚四氟乙烯（PTFE）柱塞，将琼脂糖溶液中的胚胎拉入毛细管中。确保总共将3-5个胚胎（多个胚胎）拉入毛细管中，以增加拥有良好位置的胚胎的可能性。注意：由于胚胎在此时间点的圆形性质，保证毛细管中的特定方向具有挑战性。理想情况下，胚胎的身体将横向定位在毛细管中，从而在显微镜内最容易定位。 让琼脂糖在室温下固化30-60秒。将毛细管置于0.168mg / mL Tricaine的烧杯中E3缓冲液中，直到准备好成像（图1A）。注意：过量的2%低熔点温度琼脂糖溶液可以固化，然后在未来的实验中重新加热。 将毛细管放入样品架（图1B-F）中，如步骤2.5中所述。 2. 蔡司光照表Z.1设置 按以下顺序打开显微镜和计算机的每个组件：1）系统，2）PC，然后3）孵育（图2A）。 将20倍成像物镜和10倍照明物镜放入显微镜室中。匹配“ 维护 ”选项卡下Zen软件界面中的目标设置。 将腔室（图2C）滑入履带上的外壳（图2B），管子朝外。卡套管连接到右侧的相应端口，如图 2E 所示。 使用鲁尔锁定机构将延长线连接到注射器上（图2D）;在E3中用三卡因填充它，并将其放在显微镜35右侧的支架中。使用鲁尔锁定机制将连接到E3中充满Tricaine的注射器上的延伸部分连接到腔室的右下角。推动柱塞，用三卡因/E3缓冲液填充腔室。关上房间的门。 将毛细管与样品一起放入毛细管样品架中。毛细管样品架包括两个橡胶套管、一个金属样品架盘、一个金属杆和一个金属盖（图1B）。单击金属刀鞘进入金属盘的中心（图1C）。将两个橡胶塞放入鞘中，狭缝朝向鞘的末端，然后是毛细管。将毛细管滑过橡胶塞的中间。一旦标记位于金属护套的底部，用金属盖将其固定到位（图1D）。 将毛细管样品架放在显微镜的顶部，白色标记对齐（图1E，F）。合上盖子。 单击软件界面上的 定位毛细管 按钮（图3A）。使用ErgoDrive控制面板（一种控制毛细管方向的手动设备）（图3E）移动毛细管并将其放置在物镜正上方（图3B）。 打开盖子，轻轻推动柱塞，直到含有胚胎的琼脂糖部分悬挂在毛细管底部下方并且位于物镜的前面（图3C）。 关闭 “定位毛细管 ”，然后单击“ 定位样品 ”按钮（图3A）。这将视图从样品室的网络摄像头切换到显微镜物镜（图3D）。使用此视图可以更精确地调整样品的位置。关闭 定位样品 （图3A）。 切换到“ 采集 ”选项卡。选中 Z 堆栈 和 时间序列的框。 在 “采集模式 参数”窗口中，选择“ 双面光照表 ”设置，然后选中“ 在线双面融合 ”和 “透视扫描”框。 在 通道 窗口中，选择 488通道，将激光功率设置为1，曝光时间设置为7.5毫秒。 接下来，单击“ 连续 ”按钮以获取胚胎的实时视图。使用ErgoDrive控制面板调整胚胎的位置，直到眼场直接面向相机。继续在通道参数中调整左右光照表，直到眼场充分聚焦。 使用 ErgoDrive 控制面板设置 Z-Stack 参数以在 Z 平面中移动。将第一个和最后一个 Z 位置设置为比最后一个可检测荧光信号高 500 μm 左右。这为眼场留出了空间，因为胚胎在整个延时成像过程中生长。设置 Z-Stack 的范围后，单击 “最佳 ”按钮将步长设置为 0.477 μm，这是最佳设置。 通过选中帕尔贴单元的框来设置 孵育 参数，以将温度保持在28°C。 在 时间序列 窗口中，选择采集图像的频率和时间间隔。在该协议中，参数设置为每5分钟成像一次，总共166个间隔。 点击 开始实验 按钮。选择要保存图像集的文件夹。设置映像前缀并点击 “保存” 以开始映像。注意：显微镜现在将以指定的间隔穿过每个图像集。 延时成像过程完成后，将载物台发送到加载位置，并取下毛细管样品架。按照与组装顺序相反的顺序拆开毛细管样品架，并使用柱塞从毛细管中除去样品和多余的琼脂糖。打开腔室门。使用注射器从腔室中取出腔室液体，断开并取出腔室，然后用水冲洗并风干。 3. 图像分析 打开阿里维斯Vision4D软件程序。 单击“ 文件”，然后选择“ 导入文件”。从延时成像会话中选择所有 .czi 文件并打开。下一个窗口打开，其中包含有关如何导入文件的选项;选择 Z 堆栈作为帧 ，以按获得的顺序对 z 堆栈进行排序。导入文件后，软件将另存为单个 .sis 文件。要指定要保存的文件的位置，请在单击“ 导入”之前选择文件夹。 导入文件后，arivis 现在已准备好渲染延时图像的视频。单击左下角的 4D 查看器立方体和比例尺图标（图 4D-E）。单击视频图标，将情节提要任务栏置于屏幕底部（图 4C）。 在 情节提要 任务栏中，选择“ 添加关键帧序列 ”（图 4F）。指定视频的持续时间（以秒为单位），取消选中 创建旋转 框，然后选中 使用时间进度 以在视频中包含特定时间点。该软件将这些参数显示在 情节提要 任务栏的右侧，以便随时进行任何调整。保存序列图像板以将相同的参数应用于多个图像集（图 4F）。 单击“ 导出影片 ”以保存延时成像的视频（图4F）。指定影片导出设置，包括文件名和位置、视频格式（.mp4）、视频分辨率 （1，080 p）、帧速率 （60 FPS） 和数据分辨率 （1，297 x 1，297 x 784）。如果需要，请在此处添加时间戳。设置这些参数后，选择 “记录 ”（图 4F）。 步骤3.4和3.5可以通过修改步骤3.4重复，以在特定时间点创建旋转视频。将关键帧序列添加到情节提要时，请选中 创建旋转 框，然后取消选中 使用时间进度。然后，按照步骤 3.5 中的相同说明进行操作。 要在任何单个时间点以任何方向渲染高分辨率图像，请在 4D 查看器中选择 “相机 ”图标以获得高分辨率图像（图 4C）。 要构建用于分析的管道，请选择 Flask 图标以访问“ 分析 ”面板（图 4B）。在 “分析 ”面板中，单击“ 分析操作 ”下拉菜单。例如，该协议在下面演示了体积分析管道的操作顺序。分别运行或撤消管道的每个步骤以微调每个参数（表 1）。 单击管道顶部的蓝色三角形以允许管道运行。注意：这将需要一些时间，具体取决于计算机的速度。优化管道后，可以轻松将管道导出和导入到 arivis，并在批处理分析中应用于多个数据集。 要访问批处理分析，请单击“ 分析 ”选项卡下的“批处理 分析 ”。 管道运行后，将拉出一个窗口，其中包含找到的所有对象。通过 表 图标手动访问此图标（图4B）。在此窗口的顶部，单击标记为“ 特征列” 的框以提取可提供有关感兴趣对象的信息的特征列表。对于眼场体积分析，这些特征包括表面积、体积（体积、体素计数）、强度 #1（平均值）、属性（ID、类型）和时间点（第一）。单击“ 导出 ”将数据导出到电子表格。