تصور التنشئة العينية بواسطة المجهر الضوئي باستخدام rx3: GFP الزرد المعدل وراثيا
Summary
هنا ، يتم توفير بروتوكول للتصوير بفاصل زمني لتشكل العين باستخدام مجهر لايت متاح تجاريا ومحطة عمل لمعالجة الصور لتحليل البيانات الناتجة. يفصل هذا البروتوكول إجراءات تخدير الجنين ، والتضمين في الأغاروز منخفض الانصهار ، والتعليق في غرفة التصوير ، وإعداد معلمات التصوير ، وأخيرا تحليل بيانات التصوير باستخدام برنامج تحليل الصور.
Abstract
تطور العين الفقارية هو عملية معقدة تبدأ بالقرب من نهاية المعدة الجنينية وتتطلب التنسيق الدقيق لهجرة الخلايا وانتشارها وتمايزها. يوفر تخيل الفاصل الزمني نظرة فريدة لسلوك الخلايا أثناء نمو العين لأنه يسمح لنا بتصور تكوين العين في الجسم الحي. الزرد هي نموذج ممتاز لتصور هذه العملية بسبب عينها الفقارية المحفوظة للغاية وقدرتها على التطور بسرعة وخارجيا مع الحفاظ على الشفافية البصرية. يتم تسهيل دراسات التصوير بالفاصل الزمني لتطور عين الزرد بشكل كبير باستخدام خط الزرد المعدل وراثيا Tg (rx3: GFP). في الدماغ الأمامي النامي ، يمثل تعبير rx3: GFP خلايا حقل العين الواحدة ، ويستمر التعبير عن GFP حيث يتفادى مجال العين لتشكيل حويصلة بصرية ، والتي تغزو بعد ذلك لتشكيل كوب بصري. وبالتالي ، فإن تصوير الفاصل الزمني عالي الدقة لتعبير rx3: GFP يسمح لنا بتتبع بدائية العين عبر الزمن أثناء تطورها إلى شبكية العين. يعد الفحص المجهري للصفائح الضوئية طريقة مثالية لتصوير مورفوجينيا العين بمرور الوقت بسبب قدرته على اختراق عينات أكثر سمكا للتصوير الفلوري ، وتقليل التبييض الضوئي والسمية الضوئية ، والصورة بسرعة عالية. هنا ، يتم توفير بروتوكول للتصوير بفاصل زمني لتشكل العين باستخدام مجهر لايت متاح تجاريا ومحطة عمل لمعالجة الصور لتحليل البيانات الناتجة. يفصل هذا البروتوكول إجراءات تخدير الجنين ، والتضمين في الأغاروز منخفض الانصهار ، والتعليق في غرفة التصوير ، وإعداد معلمات التصوير ، وأخيرا تحليل بيانات التصوير باستخدام برنامج تحليل الصور. يمكن أن توفر مجموعة البيانات الناتجة رؤى قيمة حول عملية تكوين العين ، بالإضافة إلى الاضطرابات في هذه العملية نتيجة للطفرة الجينية ، أو التعرض للعوامل الدوائية ، أو غيرها من التلاعب التجريبي.
Introduction
التطور الجنيني هو عملية معقدة تتطلب التنسيق الدقيق للعديد من الأحداث المختلفة. يبدأ تكوين عين الفقاريات في الدماغ الأمامي النامي ، حيث يتم تحديد جزء من الخلايا كحقل العين. سوف تتلاشى هذه الخلايا نحو الأديم الخارجي السطحي ، مما يؤدي إلى ظهور حويصلات بصرية ثنائية1،2،3،4،5،6،7،8،9،10. ثم يؤدي ملامسة الأديم الخارجي السطحي إلى غزو الحويصلة البصرية في كوب بصري. سيؤدي الأديم الخارجي السطحي إلى ظهور الهياكل الأمامية للعين ، مثل العدسة والقرنية ، في حين أن الكأس البصري سيؤدي إلى ظهور الشبكية العصبية والظهارة المصطبغة في الشبكية 1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,12 . يمكن أن تؤدي الاضطرابات في هذه العملية إلى عيوب خلقية مثل microphthalmia و anophthalmia و coloboma (MAC). في الوقت الحالي ، لا توجد خيارات لتصحيح هذه العيوب 3,5,6,7,9,10,11,12. مزيد من الدراسات لآليات تشكل العين والمشاكل التي يمكن أن تؤدي إلى MAC ستوفر أساسا للمعرفة التي من المحتمل أن تؤدي إلى العلاجات. إحدى الأدوات القوية للتحقيق في السلوكيات الديناميكية للخلايا أثناء نمو العين هي تخيل الفاصل الزمني ، مما يسمح بتصور هذه العملية وتمييزها في الجسم الحي وفي الوقت الفعلي.
الزرد (Danio rerio) هو نموذج ممتاز لتصور تطور العين المبكر باستخدام التصوير بفاصل زمني. لديهم عين فقارية محفوظة للغاية ولديهم القدرة على التطور بسرعة وخارجيا مع الحفاظ على الشفافية البصرية1. يوفر الزرد موردا كبيرا للتصوير بالفاصل الزمني بسبب هذه الخصائص التي تفتقر إليها نماذج الثدييات. يتم تسهيل دراسات التصوير بالفاصل الزمني لتطور عين الزرد بشكل كبير باستخدام خط الزرد المعدل وراثيا Tg(rx3:GFP)13. Rx3 (بروتين الشبكية المثلي 3) هو عامل نسخ ضروري لنمو العين14. Rx3 هو أول جين من جينات rx الثلاثة في الزرد التي يتم التعبير عنها ، بدءا من تعبيره في منتصف المعدة ، حوالي 8 ساعات بعد الإخصاب (hpf) 15,16. يمكن تصور الجين المحوري rx3:GFP في الدماغ الأمامي النامي بدءا من مرحلة السوميت الأولى (SS) ، حوالي 10 hpf 15,17,18,19,20. في الدماغ الأمامي النامي ، يشير تعبير rx3: GFP إلى خلايا مجال العين الواحدة ، ويستمر التعبير عن GFP (بروتين الفلورسنت الأخضر) من خلال ما تبقى من تكوين العين. وبالتالي ، فإن تصوير الفاصل الزمني عالي الدقة لتعبير rx3: GFP يسمح لنا بتتبع مجال العين الواحدة عبر الزمن أثناء تطوره إلى شبكية العين17،18،20.
تم إجراء دراسات التصوير بالفاصل الزمني لتطور أسماك الزرد في المقام الأول باستخدام المجهر البؤري أو Lightsheet. يعد الفحص المجهري البؤري مفيدا لأنه يسمح بالتصوير الدقيق للعينات على طول المحور z ويقلل من إشارة الخلفية الفلورية. ومع ذلك ، فإنه محدود بمقدار الوقت الذي يستغرقه الحصول على صورة ، وصلابة موضع العينة ، وميله نحو التبييض الضوئي والسمية الضوئية للعينات الحية. يعد الفحص المجهري للصفائح الضوئية طريقة مثالية لتصوير مورفوجينيا العين بمرور الوقت بسبب قدرته على اختراق عينات أكثر سمكا للتصوير الفلوري ، وزيادة المرونة في اتجاه العينة ، وتقليل التبييض الضوئي والسمية الضوئية إلى الحد الأدنى ، والتصوير بسرعة عالية 21،22،23،24،25،26،27،28،29،30 ، 31. تبلغ الدقة المكانية التي يمكن تحقيقها باستخدام أنظمة النسخ المجهرية الحالية للصفائح الضوئية حوالي 250-500 نانومتر (نانومتر). على الرغم من أن هذا لا يختلف اختلافا كبيرا عما يمكن الحصول عليه باستخدام المجهر البؤري ، إلا أنه يمكن تدوير العينة وتصويرها بحرية من زوايا متعددة ، مما يحسن عمق التصوير ودقته ، ويوفر مرونة أكبر بكثير لتجارب التصوير بالفاصل الزمني في الجسم الحي من المنصة البؤرية27,32 . لهذه الأسباب ، سرعان ما أصبح الفحص المجهري Lightsheet الطريقة المفضلة لدراسات التصوير بالفاصل الزمني لتطور أسماك الزرد. يصف هذا البروتوكول خطوات تحديد تكوين العين من خلال تصوير الزرد المعدل وراثيا Rx3:GFP باستخدام مجهر Lightsheet33 المتاح تجاريا ويفصل خط أنابيب لتحليل الصور باستخدام منصة برمجيات arivis.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول ، تم استخدام مجهر Lightsheet لإجراء تصوير بفاصل زمني لتطور العين وتم تحليل البيانات الناتجة. يمكن أن توفر مجموعة البيانات الناتجة رؤى قيمة حول عملية تكوين العين ، بالإضافة إلى الاضطرابات في هذه العملية نتيجة للطفرة الجينية ، أو التعرض للعوامل الدوائية ، أو غيرها من المعلمات التجريبية. هنا أوضح البروتوكول كيف يمكن الحصول على مجموعة البيانات هذه وقدم مثالا على كيفية تحليل حجم مجال العين من خلال التطوير المبكر. وقد وجد أن هذه البيانات قابلة للتكرار ومتسقة (أقل من 10٪ من التباين في الحجم) عبر النسخ المتماثلة البيولوجية، مع الأخذ في الاعتبار أن الاختلافات الطفيفة في تدريج الأجنة قبل بدء التشغيل يمكن أن تؤدي إلى بعض التباين في قياسات الحجم النهائية.
يجب توخي الحذر في الوضع الأولي للجنين في الشعيرات الدموية وفي وضع الجنين المضمن أمام الهدف. يلعب التوجيه دورا مهما في منع الجنين من النمو والخروج من وجهة نظر الهدف. الأجنة لها شكل دائري عند 10 hpf ، مما يجعل من الصعب ضمان اتجاه محدد في الشعيرات الدموية. من الناحية المثالية ، سيتم وضع جسم الجنين أفقيا في الشعيرات الدموية. تحميل أجنة متعددة في الشعيرات الدموية سيزيد من احتمال وجود جنين في وضع جيد.
في هذا الإجراء ، يتم تضمين الجنين في الأغاروز من أجل تعليقه أمام أهداف التصوير والإضاءة. اختيار التركيز الصحيح للأغاروز درجة حرارة الانصهار المنخفضة أمر بالغ الأهمية. التركيز العالي جدا سيضيق الجنين ويمنعه من التطور بشكل صحيح ؛ سيؤدي التركيز المنخفض جدا إلى انهيار الأغاروز وعدم الاحتفاظ بالجنين. التركيز الأمثل لهذا البروتوكول هو التركيز النهائي بنسبة 1٪ من درجة حرارة الانصهار المنخفضة agarose30,31.
عنصر آخر يجب مراعاته هو مستوى التشبع. مع نمو حقل العين وتمايزه ، تزداد قوة إشارة Rx3: GFP. لذلك ، عند تعيين معلمات التصوير الأولية ، يجب تقليل التعرض وطاقة الليزر لتقليل تشبع الصورة. سيمنع ذلك الصورة من التشبع الزائد حيث يصبح Rx3: GFP أكثر إشراقا بمرور الوقت. يمكن إجراء تعديلات لتصحيح التشبع الناقص في معالجة الصور ولكن لا يمكن تصحيح التشبع الزائد بعد الحصول على الصور.
هناك بعض التعديلات الإضافية التي يمكن إجراؤها على هذا البروتوكول والتي قد تكون مفيدة لبعض المشاريع التي لم يتم وصفها في هذه الورقة. على سبيل المثال، من الممكن إعداد التصوير Multiview في إعداد الحصول على الصورة. ستسمح هذه المعلمة بتصوير أجنة متعددة في مواقع مختلفة على طول المحور y بالتتابع في كل فاصل زمني. وفي حين أنه يضيف تعقيدا إلى مجموعة البيانات، فإنه سيزيد من معدل جمع البيانات. بالإضافة إلى ذلك ، من حيث معالجة الصور ، من الممكن تحديد مجال العين كميا بواسطة معلمات أخرى. هنا ، وصفنا كيفية قياس البيانات من حيث حجم مجال العين. بدلا من ذلك ، يمكن إنشاء خط أنابيب لتحديد كمية الخلايا الفردية وتتبعها أو تحديد معدل تهرب الحويصلة البصرية.
كما ذكرنا سابقا ، تم استخدام كل من المجهر البؤري و Lightsheet لإجراء دراسات التصوير بفاصل زمني لأسماك الزرد. تم اختيار Lightsheet خصيصا لهذا المشروع نظرا لقدرته الفائقة على التصوير من خلال عينة سميكة (>1 مم) ، ولأنه مجهز بوحدة حضانة للحفاظ على بيئة درجة حرارة مثالية لجنين الزرد ، ولأن قدرته على التصوير بمعدل أسرع من المجهر البؤري يسمح بالحصول على الصورة في الفترات الزمنية العديدة المطلوبة لهذا البروتوكول دون أي تلف مصاحب أو تبييض ضوئي للجنين21 ، 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. من المهم أيضا ملاحظة أن مجهر Lightsheet مجهز لتصوير الإشارة من الفلوروفورات المتعددة. يحتوي مجهر Lightsheet المستخدم في هذه الدراسة على خطوط إثارة ليزر الحالة الصلبة عند 405 و 445 و 488 و 515 و 561 و 638 نانومتر ، والتي يمكن أن تكون مفيدة لتصوير الأجنة المعدلة وراثيا التي تعبر عن أكثر من جين واحد من الفلورسنت.
في حين أن هذا البروتوكول يفصل تعليمات تحليل الحصول على الصور على وجه التحديد باستخدام نظام مجهر الإضاءة المزدوجة Lightsheet Z.1 وبرنامج تحليل arivis Vision4D ، هناك مجاهر Lightsheet أخرى متاحة تجاريا من صنع Leica و Olympus و Luxendo ، بالإضافة إلى برنامج تحليل الصور من قبل Imaris ، والتي يمكن استخدامها لتحقيق نتائج مماثلة. تم تحديد اختيار المعدات والبرامج لهذا البروتوكول من خلال التوافر في مؤسستنا.
باختصار ، من المتوقع أن يوفر هذا البروتوكول نقطة انطلاق قوية لإجراء التصوير بالفاصل الزمني باستخدام المجهر Lightsheet ، ولتحديد كمية الصور لتطور العين المبكر في أسماك الزرد.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم الأبحاث الواردة في هذا المنشور من قبل مكتب مدير المعاهد الوطنية للصحة (NIH) تحت رقم الجائزة S10OD020067 وجائزة المعاهد الوطنية للصحة R01EY021769 (إلى A.C.M). نحن ممتنون لمساعدة دوغ هاريسون وجيم بيغلي في مركز التصوير للفنون والعلوم في جامعة كنتاكي ، ولوكاس فييرا فرانسيسكو وإيفلين م. تيرنبو لرعاية أسماك الزرد الخبيرة.
Materials
| 60mL Syringe Luer-Lok Tip | BD | 309653 |
| Agarose, Low Melting Temperature | Promega | V2111 |
| arivis Vision4D Software | arivis | https://www.arivis.com/en/imaging-science/arivis-vision4d |
| Dumoxel N3C Forceps | Dumont | 0203-N3C-PO |
| E3 fish buffer (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4) | ||
| Glass Capillary – Size 2 (~1mm) | Zeiss | Black/701904 |
| Heidelberger Extension Line 100cm | B. Braun | 4097262 |
| Light & Filter Set – Royal Blue | Night Sea | SFA-LFS-RB |
| Petri Dish (100 x 15 mm) | VWR | 25384-302 |
| Stereomicroscope Fluorescence Adapter | NightSea | |
| Teflon Tipped Plunger – Size 2 | Zeiss | #701997 |
| Tg(rx3:GFP) zebrafish | This line was established by Rembold et al.13 | |
| Tricaine (MS222) | Sigma | A-5040 |
| Z.1 Lightsheet | Zeiss | |
| Zen Software | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |
References
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Li, Z., Joseph, N. M., Easter, S. S. The morphogenesis of the zebrafish eye, including a fate map of the optic vesicle. Developmental Dynamics. 218 (1), 175-188 (2000).
- Chow, R. L., Lang, R. A. Early eye development in vertebrates. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 255-296 (2001).
- Wilson, S. W., Houart, C. Early steps in the development of the forebrain. Developmental Cell. 6 (2), 167-181 (2004).
- Picker, A., et al. Dynamic coupling of pattern formation and morphogenesis in the developing vertebrate retina. PLoS Biology. 7 (10), 1000214 (2009).
- Fuhrmann, S. Eye morphogenesis and patterning of the optic vesicle. Current Topics in Developmental Biology. 93, 61-84 (2010).
- Kwan, K. M., et al. Bin A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
- Heermann, S., Schütz, L., Lemke, S., Krieglstein, K., Wittbrodt, J. Eye morphogenesis driven by epithelial flow into the optic cup facilitated by modulation of bone morphogenetic protein. eLife. 4, 05216 (2015).
- Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schütz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt. Open Biology. 9 (2), (2019).
- Yoon, K. H., Fox, S. C., Dicipulo, R., Lehmann, O. J., Waskiewicz, A. J. Ocular coloboma: Genetic variants reveal a dynamic model of eye development. American Journal of Medical Genetics Part C: Seminars in Medical Genetics. 184 (3), 590-610 (2020).
- Sidhaye, J., Norden, C. Concerted action of neuroepithelial basal shrinkage and active epithelial migration ensures efficient optic cup morphogenesis. eLife. 6, 22689 (2017).
- Pillai-Kastoori, L., Wen, W., Morris, A. C. Keeping an eye on SOXC proteins. Developmental Dynamics. 244, 367-376 (2015).
- Rembold, M., et al. Individual cell migration serves as the driving force for optic vesicle evagination. Science. 313, 1130-1134 (2006).
- Loosli, F., et al. Loss of eyes in zebrafish caused by mutation of chokh/rx 3. EMBO Reports. 4 (9), 894-899 (2003).
- Chuang, J. C., Mathers, P. H., Raymond, P. A. Expression of three Rx homeobox genes in embryonic and adult zebrafish. Mechanisms of Development. 84 (1-2), 195-198 (1999).
- Cavodeassi, F., et al. Early stages of zebrafish eye formation require the coordinated activity of Wnt11, Fz5, and the Wnt/β-catenin pathway. Neuron. 47 (1), 43-56 (2005).
- Ivanovitch, K., Cavodeassi, F., Wilson, S. W. Precocious acquisition of neuroepithelial character in the eye field underlies the onset of eye morphogenesis. Developmental Cell. 27 (3), 293-305 (2013).
- Ebert, A. M., Childs, S. J., Hehr, C. L., Cechmanek, P. B., McFarlane, S. Sema6a and Plxna2 mediate spatially regulated repulsion within the developing eye to promote eye vesicle cohesion. Development (Cambridge). 141 (12), 2473-2482 (2014).
- Emerson, S. E., et al. Identification of target genes downstream of semaphorin6A/plexinA2 signaling in zebrafish. Developmental Dynamics. 246 (7), 539-549 (2017).
- Hehr, C. L., Halabi, R., McFarlane, S. Polarity and morphogenesis of the eye epithelium requires the adhesion junction associated adaptor protein Traf4. Cell Adhesion and Migration. 12 (5), 489-502 (2018).
- Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. Journal of Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Reynaud, E. G., Kržič, U., Greger, K., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy: More dimensions, more photons, and less photodamage. HFSP Journal. 2 (5), 266-275 (2008).
- Icha, J., et al. Using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (110), e53966 (2016).
- Keller, P. J., Dodt, H. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Pampaloni, F., Chang, B. J., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy (LSFM) for the quantitative imaging of cells and tissues. Cell and Tissue Research. 360 (1), 129-141 (2015).
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: A quantitative transition is underway. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (5), 327-339 (2014).
- Park, O. K., et al. 3D light-sheet fluorescence microscopy of cranial neurons and vasculature during zebrafish embryogenesis. Molecules and Cells. 38 (11), 975-981 (2015).
- Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nature Biotechnology. 34 (12), 1267-1278 (2016).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Keller, P. J., et al. Fast, high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nature Methods. 7 (8), 637-642 (2010).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: A review. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12 (1), 30-34 (2014).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)., 5th Edition. , (2007).
- Hirsinger, E., Steventon, B. A versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (1199), e55210 (2017).
- Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. Journal of Neurobiology. 37 (4), 622-632 (1998).
- Cavodeassi, F., Ivanovitch, K., Wilson, S. W. Eph/Ephrin signalling maintains eye field segregation from adjacent neural plate territories during forebrain morphogenesis. Development (Cambridge). 140 (20), 4193-4202 (2013).
- Muthu, V., Eachus, H., Ellis, P., Brown, S., Placzek, M. Rx3 and Shh direct anisotropic growth and specification in the zebrafish tuberal/anterior hypothalamus. Development (Cambridge). 143 (14), 2651-2663 (2016).
- Rojas-Muñoz, A., Dahm, R., Nüsslein-Volhard, C. chokh/rx3 specifies the retinal pigment epithelium fate independently of eye morphogenesis. Developmental Biology. 288 (2), 348-362 (2005).
