Aquí, proporcionamos protocolos detallados, robustos y complementarios para realizar imágenes de tinción y resolución subcelular de modelos de cultivo celular tridimensionales fijos que van desde 100 μm hasta varios milímetros, lo que permite la visualización de su morfología, composición de tipo celular e interacciones.
Los modelos de cultivo celular tridimensional (3D) in vitro, como organoides y esferoides, son herramientas valiosas para muchas aplicaciones, incluido el desarrollo y el modelado de enfermedades, el descubrimiento de fármacos y la medicina regenerativa. Para explotar plenamente estos modelos, es crucial estudiarlos a nivel celular y subcelular. Sin embargo, caracterizar tales modelos de cultivo celular 3D in vitro puede ser técnicamente desafiante y requiere experiencia específica para realizar análisis efectivos. Aquí, este documento proporciona protocolos detallados, robustos y complementarios para realizar imágenes de tinción y resolución subcelular de modelos de cultivo celular 3D in vitro fijos que van desde 100 μm hasta varios milímetros. Estos protocolos son aplicables a una amplia variedad de organoides y esferoides que difieren en su célula de origen, morfología y condiciones de cultivo. Desde la recolección de estructuras 3D hasta el análisis de imágenes, estos protocolos se pueden completar en 4-5 días. Brevemente, las estructuras 3D se recolectan, fijan y luego pueden procesarse mediante incrustación de parafina y tinción histológica / inmunohistoquímica, o directamente inmunomarcadas y preparadas para la limpieza óptica y la reconstrucción 3D (200 μm de profundidad) mediante microscopía confocal.
En las últimas décadas, los avances en la biología de células madre y las tecnologías de cultivo 3D in vitro han anunciado una revolución en biología y medicina. Los modelos celulares de mayor complejidad en 3D se han vuelto muy populares, ya que permiten que las células crezcan e interactúen con un marco extracelular circundante, recapitulando estrechamente aspectos de los tejidos vivos, incluida su arquitectura, organización celular e interacciones, o incluso características de difusión. Como tal, los modelos de cultivo celular 3D pueden proporcionar información única sobre el comportamiento de las células en tejidos en desarrollo o enfermos in vitro. Los organoides y los esferoides son estructuras 3D multicelulares, que van desde varios micrómetros hasta milímetros, y son las estructuras 3D in vitro más prominentes. Ambos pueden cultivarse dentro de un andamio de soporte que incluye (i) hidrogeles derivados de animales (extracto de membrana basal, colágeno), plantas (alginato / agarosa) o sintetizados a partir de productos químicos, o (ii) matrices inertes que contienen poros para promover la proliferación y el crecimiento celular.
Los organoides y esferoides también pueden desarrollarse sin la presencia de un andamio de soporte al depender de las células para autoensamblarse en grupos. Esto se basa en diferentes técnicas, como el uso de materiales no adhesivos para inhibir la unión celular, la tensión superficial y la fuerza gravitacional (por ejemplo, técnicas de caída colgante) o la rotación circular constante de los vasos (por ejemplo, cultivo de hilanderas). En todos los casos, estas técnicas facilitan las interacciones célula-célula y célula-matriz para superar las limitaciones del cultivo celular monocapa tradicional1. Los términos “organoides” y “esferoides” se han utilizado indistintamente en el pasado, pero existen diferencias clave entre estos dos modelos de cultivo celular 3D. Los organoides son grupos celulares 3D in vitro derivados de células madre pluripotentes o células madre específicas de tejido, en los que las células se autoorganizan espontáneamente en progenitoras y tipos de células diferenciadas y que recapitulan al menos algunas funciones del órgano de interés2. Los esferoides comprenden una gama más amplia de estructuras 3D multicelulares formadas bajo condiciones no adherentes y pueden surgir de una gran diversidad de tipos de células, como líneas celulares inmortalizadas o células primarias3. Por lo tanto, inherentes a sus orígenes intrínsecos de células madre, los organoides tienen una mayor propensión al autoensamblaje, la viabilidad y la estabilidad que los esferoides.
Sin embargo, en esencia, estos dos modelos son estructuras 3D compuestas por múltiples células, y las técnicas desarrolladas para estudiarlas son, por lo tanto, muy similares. Por ejemplo, se necesitan potentes enfoques de imagen a nivel de resolución de una sola célula para sondear la complejidad celular tanto de organoides como de esferoides. Aquí, al resumir la experiencia de este grupo y la de los líderes en el campo de los organoides4, este documento describe procedimientos detallados para realizar tinción bidimensional (2D) y 3D de montaje completo, imágenes y análisis de la composición celular y subcelular y la organización espacial de organoides y esferoides que van desde 100 μm hasta varios milímetros. De hecho, este procedimiento presenta dos tipos diferentes y complementarios de tinción y adquisición de imágenes para analizar una gran variedad de tamaños y tipos de modelos de cultivo celular 3D in vitro. El uso de uno (análisis 3D de montaje completo) u otro (análisis de sección 2D) dependerá del modelo estudiado y de las respuestas buscadas. El análisis 3D de montaje completo por microscopía confocal puede, por ejemplo, aplicarse para visualizar células en cultivo 3D de hasta 200 μm de profundidad, independientemente del tamaño total de la estructura 3D, mientras que el análisis de secciones 2D proporciona información sobre muestras de cualquier tamaño, aunque a nivel 2D. Este procedimiento se ha aplicado con éxito a través de una variedad de organoides4,5 y esferoides derivados de células humanas y murinas, procedentes de diferentes capas germinales embrionarias. La descripción general del procedimiento se muestra en la figura 1. Se indican las etapas principales, las relaciones entre ellas, los pasos decisivos y el momento esperado.
Figura 1: Descripción general esquemática del procedimiento. Los modelos de cultivo celular 3D in vitro se recogen y fijan, luego se preparan para la tinción 3D de montaje completo (opción a) o se incrustan en parafina para seccionamiento y tinción 2D (opción b). Para experimentos de tinción 3D de montaje completo, las estructuras 3D fijas se inmunomarcan siguiendo el paso de fijación. Se puede realizar un paso opcional de limpieza óptica para mejorar la calidad de imagen y la profundidad de la microscopía óptica al reducir la dispersión de la luz durante el procesamiento de imágenes. Las imágenes se capturan en un microscopio confocal invertido o en un sistema confocal de alto contenido y se analizan utilizando el software apropiado. Para la incrustación de parafina, las estructuras 3D se procesan directamente (opción b.1 para estructuras grandes ≥ 400 μm) o se incluyen en un gel (b.2; estructuras pequeñas ≤ 400 μm) para deshidratación e incrustación de parafina. Luego se cortan y tiñen los bloques de parafina (tinción histológica o inmunoquímica). Las imágenes de las secciones 2D se obtienen en un escáner de diapositivas digital o un microscopio vertical y se analizan en una plataforma de análisis de imágenes utilizando un análisis cuantitativo digital rápido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El cultivo celular es una herramienta indispensable para descubrir mecanismos biológicos fundamentales involucrados en el desarrollo, función, regeneración y alteración de tejidos y órganos, y enfermedades. Aunque el cultivo celular 2D monocapa ha predominado, investigaciones recientes se han desplazado hacia cultivos que generan estructuras 3D que reflejan más las respuestas celulares in vivo, debido en particular a la organización espacial adicional y los contactos célula-célula que influyen en la expresión génica y el comportamiento celular y, por lo tanto, podrían proporcionar datos más predictivos7. Sin embargo, quedan muchos desafíos, incluida la necesidad de técnicas de tinción e imágenes fáciles de usar para la visualización microscópica detallada y la evaluación de estructuras 3D complejas a nivel celular y subcelular. En ese contexto, se han proporcionado protocolos detallados, robustos y complementarios para realizar tinción e imágenes de resolución celular y subcelular de modelos de cultivo celular 3D in vitro fijos que van desde 100 μm hasta varios milímetros de tamaño.
Este procedimiento presenta dos estrategias diferentes para tratar una gran variedad de tamaños y tipos de modelos de cultivo celular 3D in vitro. La elección de uno (análisis 3D de montaje completo) u otro (análisis de sección 2D) dependerá del modelo utilizado y del problema investigado. El análisis 3D de montaje completo por microscopía confocal permite la visualización de células con un campo de profundidad de hasta 200 μm, independientemente del tamaño total de la estructura 3D, mientras que la sección 2D es aplicable a muestras de cualquier tamaño, pero la visualización sigue siendo 2D dimensional. A continuación se presentan algunas sugerencias para la solución de problemas y consideraciones técnicas.
La pérdida de estructuras 3D durante el flujo de trabajo es el inconveniente más común. Pueden permanecer adheridos a las puntas y tubos, por lo que las puntas y tubos de recubrimiento previo con solución PBS-BSA al 0,1% son clave. Además, es crucial dejar que las estructuras 3D sedimenten entre los cambios de reactivo y realizar todo el pipeteo con mucho cuidado. Como se mencionó en el procedimiento, para todos los pasos, si la sedimentación de la estructura 3D es demasiado larga, las células se pueden girar suavemente a 50 × g durante 5 minutos a RT. Dependiendo del objetivo del estudio, se deben considerar las ventajas / desventajas de tal paso de hilado, ya que la centrifugación puede comprometer la forma de las estructuras 3D. Además, se debe tener cuidado para preservar esta morfología durante la etapa de fijación porque los organoides quísticos tienden a colapsar. La fijación de estructuras de menos de 400 μm de tamaño debe evitar cambios estructurales.
Para un inmunomarcaje óptimo, la recuperación de organoides de sus matrices 3D es un paso crucial. La matriz 3D puede impedir la penetración adecuada de anticuerpos o conducir a una alta tinción de fondo debido a la unión no específica a la matriz. La eliminación de la MCE puede alterar la morfología de los segmentos externos de los organoides (especialmente en el caso de pequeñas protuberancias celulares que se extienden desde estructuras 3D estudiadas) y dificultar parcialmente los análisis. Para tales estructuras 3D, la matriz se puede conservar durante todo el procedimiento; Sin embargo, las condiciones de cultivo deben adaptarse cuidadosamente para cultivar células en una cantidad mínima de matriz para evitar una penetración insuficiente de soluciones y anticuerpos y para evitar pasos sucesivos de lavado destinados a reducir el ruido de fondo excesivo 6,8.
El paso de limpieza óptica descrito en este protocolo en la sección de tinción de montaje completo 3D es pertinente para la obtención de imágenes de estructuras 3D de hasta 150-200 μm de profundidad en lugar de 50-80 μm sin aclaración. En comparación con otras metodologías de limpieza que a menudo requieren varias semanas y utilizan agentes de limpieza tóxicos, eneste protocolo se utilizó un paso de limpieza rápido y seguro previamente publicado 4,9. Además, este paso de limpieza es reversible, y se pueden agregar nuevos anticuerpos a la tinción inicial sin pérdida de resolución o brillo4. Sin embargo, dependiendo del modelo de cultivo celular 3D estudiado, una profundidad de 150-200 μm podría no ser suficiente para obtener imágenes de la estructura 3D de manera informativa, y este protocolo de limpieza puede causar cambios en la morfología general de organoides esféricos monocapa con grandes lúmenes4. Los usuarios deben diseñar cuidadosamente su experimento y, si es necesario, optimizar el tiempo de la etapa de permeabilización / bloqueo (para permitir la penetración de anticuerpos y solución), la etapa de limpieza (para penetrar más profundo que 200 μm, las muestras deben estar totalmente despejadas) y la adquisición de imágenes. Las dos tecnologías más frecuentes disponibles en las instalaciones básicas serían la microscopía de lámina de luz y la microscopía confocal. Los usuarios deberán elegir cuidadosamente una tecnología basada en el tamaño de sus estructuras 3D y su pregunta biológica10. Sin embargo, en comparación con la microscopía confocal, la resolución de microscopía de lámina de luz obtenida para tales estructuras profundas sigue siendo subóptima para obtener la resolución subcelular.
Aquí, se ha informado de un proceso detallado y robusto que se dedica a la incorporación de parafina de muestras individuales. Curiosamente, Gabriel et al. desarrollaron recientemente un protocolo que incorpora cultivos celulares 3D en parafina con un mayor rendimiento. Utilizaron un molde de polidimetilsiloxano (PDMS) para confinar 96 estructuras 3D en un patrón de micromatriz en un bloque, proporcionando nuevas perspectivas para estudios sobre modelos tumorales 3D que abarcan más grupos, puntos de tiempo, condiciones de tratamiento y réplicas11. Sin embargo, este método requiere amplias habilidades y maquinaria, especialmente para la fabricación del premolde utilizado para crear moldes PDMS.
En resumen, este artículo describe dos enfoques diferentes, complementarios y adaptables que permiten la adquisición de información precisa y cuantitativa sobre la composición arquitectónica y celular de los modelos celulares 3D. Ambos parámetros son cruciales para estudiar procesos biológicos como la heterogeneidad celular intratumoral y su papel en la resistencia a los tratamientos.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por el Premio a la Innovación Robert J. Arceci # 604303 de St Baldrick.
Equipment | |||
Biopsy pad Q Path blue | VWR | 720-2254 | |
Cassettes macrostar III Blc couv. Char. x1500 | VWR | 720-2233 | |
Cassette microtwin white | VWR | 720-2183 | |
Chemical hood | Erlab | FI82 5585-06 | |
Filter tips 1000 µL | Star lab Tip-One | S1122-1730 | |
Fine forceps | Pyramid innovation | R35002-E | |
Flat-bottom glass tubes with PTFE lined 2 mL | Fisher Scientific | 11784259 | Excellent for environmental samples, pharmaceuticals and diagnostic reagents. PTFE is designed for the ultimate in product safety. PTFE provides totally inert inner seal and surface facing the sample or product. |
Glass bottom dish plate 35 mm | Ibedi | 2018003 | |
Horizontal agitation | N-BIOTEK | NB-205 | |
Incubator prewarmed to 65 °C | Memmert Incubator | LAB129 | |
Inox molds 15×15 | VWR | 720-1918 | |
Microscope Slides Matsunami TOMO-11/90 | Roche diagnostics | 8082286001 | these slides are used for a better adhesion of sections |
Microtome | Microm Microtech France | HM340E | |
Panoramic scan II | 3dhistech | 2397612 | |
Paraffin embedding equipment | Leica | EG1150C | |
Plastic pipette Pasteur 2 mL | VWR | 612-1681 | |
Q Path flacon 150mL cape blanc x250 | VWR | 216-1308 | Good for environmental samples, pharmaceuticals and diagnostic reagents. Polypropylene (PP) are rigid, solid, provide excellent stress crack and impact resistance and have a good oil and alcohol barrier and chemical resistance. PE-lined cap is stress crack resistant and offers excellent sealing characteristics. |
Set of micropipettors (p200, p1000) | Thermo Scientific | 11877351 (20-200) 11887351(p1000) | |
OPERA PHENIX | PerkinElmer | HH14000000 | |
SP5 inverted confocal microscope | Leica | LSM780 | |
Tissue cassette | VWR | 720-0228 | |
Zeiss Axiomager microscope | Leica | SIP 60549 | |
Reagent | |||
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030-100G | |
Cytoblock (kit) | Thermofisher Scientific | 10066588 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 57648266 | CAUTION: toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
Eosin aqueous 1% | Sigma-Aldrich | HT110316 | |
Ethanol 96% | VWR | 83804.360 | CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles. |
Ethanol 100% | VWR | 20821.365 | CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles. |
Formalin 4% | Microm Microtech France | F/40877-36 | CAUTION: Formalin contains formaldehyde which is hazardous. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles. |
Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
Gill hematoxylin type II | Microm Microtech France | F/CP813 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | 500 mL |
Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | CAUTION: Suspected of causing genetic defects. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles. |
Normal donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | 10 mL |
Paraffin Wax tek III | Sakura | 4511 | |
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1 X | Gibco | 14190-094 | |
Tris-Buffered Saline (TBS) 10X | Microm Microtech France | F/00801 | 100 mL |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | CAUTION: Triton X100 is hazardous. Avoid contact with skin and eyes. |
Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | CAUTION: Xylene is toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
Solutions | |||
Clearing solution | Glycerol-Fructose clearing solution is 60% (vol/w) glycerol and 2.5 M fructose. To prepare 10 mL of this solution, mix 6 mL of glycerol and 4.5 g of fructose. Complete to 10 mL with dH2O. Use a magnetic stirrer overnight. Refractive index = 1.4688 at room temperature (RT: 19–23 °C). Store at 4 °C in dark for up to 1 month. | ||
PBS-BSA 0,1% solution | To prepare 0,1% (vol/wt) PBS-BSA 0,1% solution, dissolve 500 mg of BSA in 50 mL of PBS-1X (store at 4°C for up to 2 weeks). And dilute 1mL of this solution into 9mL of PBS-1X. This solution can be used to precoat the tip and centrifugation tube. | ||
Permeabilisation-blocking solution (PB solution) | The PBSDT blocking solution is PBS-1X supplemented with 0.1% – 1% Tritonx-100 (depending on the protein localization membrane/nucleus), 1% DMSO, 1% BSA and 1% donkey serum (or from the animal in which the secondary antibodies were raised). This solution can be stored at 4°C for up to 1 month. | ||
PB:PBS-1X (1:10) solution | PB:PBS-1X (1:10) solution is a 10 time diluted PB solution. To prepare 10 mL of this solution dilute 1 mL of PB solution in 9 mL of PBS-1X. | ||
Software | |||
Halo software | Indicalabs | NM 87114 | |
Harmony software | PerkinElmer | HH17000010 |