3차원 오가노이드 및 스페로이드 모델의 염색 및 고해상도 이미징

참고: 다음 절차에서 시약 변경 및 세척과 관련된 단계에서 초기 3D 구조 수의 ≤25%가 손실될 것으로 예상해야 합니다. 정성적 및 정량적 이미지 분석을 수행하기 위해 테스트된 조건당 크기가 100에서 500μm 사이인 최소 10개의 3D 구조의 최종 수를 사용하도록 계획합니다. 필요한 경우 더 큰 구조의 경우 구조가 파손되지 않도록 1mL 피펫 팁의 끝을 자릅니다. 모든 단계에서 3D 구조 침강이 너무 길면 실온(RT)에서 5분 동안 50× g 으로 셀을 부드럽게 회전시킬 수 있습니다. 조사된 문제에 따라 원심분리가 3D 구조의 모양을 손상시킬 수 있으므로 이러한 방사 단계의 장점/단점을 고려해야 합니다. >100 × g에서 회전하지 마십시오. 1. 3D 세포 배양 모델의 수집 및 고정 알림: 튜브 벽에 느슨하게 부착되는 3D 구조물을 흡입하지 않도록 주의하십시오. 매트릭스에 내장된 3D 세포 배양 모델 수집참고: 이 섹션에서는 쥐 Engelbreth-Holm-Swarm 육종(BME)에서 기저막 추출물 방울로 성장한 3D 구조의 회복에 대해 설명하지만 다른 매트릭스에 적용될 수 있습니다. ECM과 관련된 중요한 사항에 대해서는 토론을 참조하십시오.3D 매트릭스를 방해하지 않고 웰에서 배양 배지를 제거합니다. 팁의 전체 길이를 인산완충식염수(PBS)(이하 PBS-BSA 0.1% 용액이라고 함)의 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)에 담그고 이 용액 1mL를 위아래로 두 번 피펫팅하여 1mL 피펫 팁의 내부와 외부를 단백질(이하 사전 코팅된 1mL 팁이라고 함)로 프리코팅합니다.알림: 이 사전 코팅은 셀이 팁에 달라붙는 것을 방지하고 손실을 최소화합니다. PBS-BSA 0.1% 용액을 반복적으로 채우고 튜브를 비워 원심분리기(15mL) 튜브 내부를 단백질(이하 사전 코팅된 원심분리 튜브 라고 함)로 프리코팅합니다.알림: 이렇게 하면 셀이 튜브에 달라붙는 것을 방지하고 손실을 최소화할 수 있습니다. 사전 코팅된 1mL 팁을 사용하여 얼음처럼 차가운 1x PBS 1mL를 사용하여 웰의 3D 구조를 조심스럽게 재현탁하고 3D 구조가 포함된 현탁액을 사전 코팅된 원심분리 튜브로 부드럽게 옮깁니다. 얼음처럼 차가운 1x PBS 13mL를 부드럽게 추가하고 3D 구조물이 최소 10분 동안 얼음 위에 침전되도록 합니다.참고: 필요한 경우 4°C에서 50× g 으로 5분 동안 회전합니다. 100 × g> 회전하면 3D 구조의 모양이 손상되므로 피하십시오. 상청액을 제거하십시오. 미리 코팅된 1mL 팁을 사용하여 얼음처럼 차가운 1x PBS 1mL에 3D 구조물을 부드럽게 재현탁합니다. 1.1.4 – 1.1.5단계를 반복하여 3D 매트릭스 잔류물이 없는 균질한 펠릿을 얻습니다.참고: 효율적인 매트릭스 제거는 매트릭스 유형, 3D 구조의 수 및 크기에 영향을 받으며 다양한 배양 조건에 맞게 최적화해야 합니다. BME에서 성장한 3D 구조의 경우 매트릭스 제거에서 복구하는 데 일반적으로 45-60분이 걸립니다. 사전 코팅된 1mL 팁을 사용하여 3D 구조가 포함된 1mL 1x PBS 현탁액을 사전 코팅된 1.5mL 원심분리 튜브로 옮기고 섹션 1.3을 진행합니다. 부유식 3D 세포 배양 모델 수확사전 코팅된 1mL 팁을 사용하여 3D 구조를 조심스럽게 수집하여 사전 코팅된 1.5mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 3D 구조물이 침전되도록 하거나 RT에서 50× g 으로 5분 동안 회전합니다. 상청액을 제거하십시오. 미리 코팅된 1mL 팁을 사용하여 1mL의 1x PBS에 3D 구조를 재현탁합니다. 섹션 1.3을 진행합니다. 3D 세포 배양 모델 고정3D 구조물이 침전되도록 합니다. 조심스럽게 상청액을 제거하십시오. 흄 후드 아래에서 사전 코팅된 1mL 팁을 사용하여 포르말린 1mL에 3D 구조물을 부드럽게 재현탁합니다.알림: 포르말린에는 위험한 포름알데히드가 포함되어 있습니다. 화학 후드에서 화학 물질을 조작하십시오. 고무 장갑과 보안경을 착용하십시오. RT에서 30분 동안 3D 구조물을 배양합니다.참고: 포르말린을 사용한 30분 고정 단계는 광범위한 3D 구조(크기, 모양 및 기원이 다양함)의 면역 염색에 필요합니다. 그러나 일반적으로 더 긴 고정 시간(>3시간)이 리포터 단백질의 형광을 보존하는 데 더 적합합니다. 3D 구조물이 침전되도록 하거나 RT에서 50× g 으로 5분 동안 회전시킵니다. 포르말린을 부드럽게 제거하고 1mL의 1x PBS로 교체합니다. 1x PBS에서 이 세척 단계를 두 번 반복합니다. 샘플을 4°C에서 보관하고 섹션 2 또는 섹션 3으로 진행합니다.참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있으며 셀은 장기 보관(>1년)을 위해 4°C에서 유지할 수 있습니다. 2.3D 3D 세포 배양 모델의 전체 마운트 염색, 이미징 및 분석 알림: 오가노이드가 튜브 벽에 느슨하게 부착되어 있으므로 다음의 모든 시약 변경으로 인해 샘플이 손실될 수 있으므로 조심스럽게 다루십시오. 시작하기 전에 염색을위한 올바른 컨트롤의 가용성을 확인하십시오. 양성 및 음성 대조군은 관심있는 단백질이 각각 과발현되거나 부재하는 것으로 알려진 세포 일 수있다. 관찰된 신호가 2차 항체의 비특이적 결합에 의한 것인지 확인하기 위해 1차 항체 없이 샘플을 인큐베이션한다. 일부 세포는 높은 수준의 자가형광을 나타내는 경향이 있으므로 2차 항체가 없는 대조군을 사용하여 관찰된 형광이 배경 자가형광에서 나오는지 확인합니다. 면역표지와 형광 리포터 시각화를 결합할 수 있습니다. 3D 전체 마운트 염색1x PBS에 0.1%-1%의 비이온성 계면활성제( 재료 표 참조), 1% 디메틸설폭사이드, 1% BSA 및 1% 당나귀 혈청(또는 2차 항체가 제기된 동물로부터)을 보충하여 투과화 차단(PB) 용액을 준비합니다.참고: 표적의 국소화에 따라 비이온성 계면활성제의 농도를 조심스럽게 최적화하십시오: 막(0-0.5%), 세포질(0.5-1%) 및 핵(1%). 이 용액은 4°C에서 최대 1개월 동안 보관할 수 있습니다. BSA는 일반적으로 블로킹 단계에서 잘 작동하지만 배경 잡음이 높은 경우 주어진 항체 조합에 대해 가능한 최상의 결과를 얻기 위해 경험적 테스트를 수행하십시오. 사전 코팅된 1mL 팁을 사용하여 1.5mL 원심분리 튜브에서 0.5mL 튜브로 오가노이드를 옮깁니다. 오가노이드 침전물을 넣고 1x PBS를 부드럽게 제거한 다음 0.5mL의 PB 용액으로 교체합니다. RT에서 1 시간 동안 부드러운 수평 교반 (30-50 rpm)으로 유기체를 배양하십시오. 오가노이드 침전물을 넣고 PB 용액을 부드럽게 제거한 다음 1mL PBS-BSA 0.1%에서 3분 동안 두 번 세척합니다.알림: 3분 동안 기다리면 구조물이 튜브 바닥에 침전될 수 있습니다. PBS-BSA 0.1%를 부드럽게 제거하고 PB:1x PBS(1:10) 용액에 적절한 농도로 희석된 250μL의 1차 항체를 추가합니다. 10mL의 PB:1x PBS(1:10) 용액을 준비하려면 PB 용액 1mL를 1x PBS 9mL에 희석합니다. 4°C에서 부드러운 수평 교반(30-50rpm)으로 2-3일 동안 배양합니다.참고: 3D 구조가 때때로 큰 크기에 도달할 수 있으므로 적절한 항체 침투를 위해서는 적절한 항체 배양 시간이 중요합니다. 오가노이드가 침전되도록 하고, 1차 항체 용액을 부드럽게 제거한다. 세척 당 3 분 동안 PBS-BSA 0.1 %에서 5 회 세척 한 다음 부드러운 수평 교반으로 세척 당 15 분 동안 1L PBS-BSA 0.1 %에서 2 회 세척하십시오. PB:1x PBS(1:10) 용액에 1:250으로 희석된 2차 항체 250μL를 추가합니다. 부드러운 수평 교반 (30-50 rpm)으로 4 ° C에서 24 시간 동안 배양하십시오. 이 단계에서는 샘플을 빛으로부터 보호하십시오. PB:1x PBS(1:10) 용액에 1:1000으로 희석한 Hoechst 33342(20μM 원액) 250μL를 추가하고 부드러운 수평 교반(30-50rpm)으로 4°C에서 2시간 더 배양합니다. 오가노이드 침전물을 침전시키고, 2차 항체 + Hoechst 33342를 함유하는 용액을 부드럽게 제거한다. 오가노이드를 세척당 3분 동안 1mL의 1x PBS에 5x 세척한 다음 부드러운 수평 교반(30-50rpm)으로 세척당 15분 동안 1x PBS 1mL에 2x 세척합니다.알림: 배경 소음이나 신호 손실을 방지하기 위해 샘플을 광범위하게 세척하는 것이 중요합니다. 이미지 획득 때까지 샘플을 4°C에서 PBS에 보관한다. 섹션 2.2를 진행합니다.참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있으며 샘플은 빛으로부터 보호되어 몇 개월 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다. 컨포칼 이미징을 위한 샘플 준비미리 코팅된 1mL 팁을 사용하여 오가노이드를 96웰 블랙 폴리스티렌 마이크로플레이트의 웰당 1x PBS 50μL에 조심스럽게 옮깁니다. 2.2.3단계 또는 섹션 2.3을 진행합니다.참고: 이 단계에서 샘플을 빛으로부터 보호하고 4°C에서 몇 주 동안 보관할 수 있습니다. 지우기참고: 투명화 단계는 선택 사항이며 오가노이드를 면역표지하거나 내인성 형광을 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 클리어링은 3D 구조 수축을 유발할 수 있지만 큰 루멘을 가진 구형 단층 오가노이드를 제외하고는 일반적인 형태를 변경하지 않습니다4. 이러한 낭성 오가노이드의 경우 투명화 단계를 건너뛰고 심부 조직 이미징을 수행합니다6.용액이 완전히 용해되고 균질해질 때까지 적어도 밤새 자기 교반기에서 혼합하여 50% v/v 글리세롤, 11% v/v 증류수 및 45% w/v 과당을 포함하는 2.5M 글리세롤-과당 제거 용액을 준비합니다. 4 ° C에서 어두운 곳에서 최대 1 개월 동안 보관하십시오. 유기체를 만지지 않고 가능한 한 많은 1x PBS를 제거하십시오. 끝을 제거한 후 1mL 피펫 팁을 사용하여 투명액 200μL를 추가하고 거품이 형성되지 않도록 부드럽게 재현탁합니다. RT에서 최소 12시간 동안 배양하고 섹션 3을 진행합니다.알림: 클리어링 용액은 점성이 있기 때문에 소량의 처리가 어렵습니다. 취급을 용이하게하려면 용액이 RT에 있는지 확인하고 천천히 피펫팅하십시오. 최적의 투명화를 위해 이미징하기 전에 샘플이 투명화 용액에 최소 24시간 동안 침전되도록 하십시오. 획득 시 3D 구조물이 떠 있는 경우 RT에서 <100× g 으로 10분 동안 선택적 스핀을 수행하거나 침전물이 될 때까지 더 많은 시간(1일에서 며칠)을 허용합니다. 프로토콜이 빛으로부터 보호되고 4°C(몇 주) 또는 -20°C(수개월)에서 보관되는 경우 이미징을 진행하기 전에 이 단계에서 일시 중지할 수 있습니다. 이미지 수집 및 분석참고: 3D 구조를 이미지화하려면 이미지 절단 기술이 필요합니다.컨포칼 현미경을 사용하고 공기에 비해 개구수(NA)가 높은 침수 대물렌즈를 선호합니다. 3D 구조의 크기, 이미지 재구성(스티칭) 및 분석에 사용되는 솔루션에 따라 배율 대물렌즈(10x, 20x, 40x)를 선택합니다. 획득 모드를 선택할 때 Z 스태킹 단계를 정의하는 데 사용되는 대물렌즈의 초점 심도를 고려하십시오. 최적의 3D 렌더링을 허용합니다.참고: 이미지 분석 솔루션은 다양하며 사용된 소프트웨어에 맞게 분석을 조정해야 합니다. 예를 들어, 이 분석 프로토콜은 고함량 분석 소프트웨어( 자세한 내용은 재료 표 및 보충 그림 1 참조)에서 설정되었으며 3D 재구성 개체 내에서 개체 분할, 속성 계산 및 세포 집단 선택에 대한 데이터를 제공합니다. 3. 3D 세포 배양 모델의 2D 절단, 염색, 이미징 및 분석 참고: 3D 세포 배양 모델의 크기는 다양합니다. 효율적인 파라핀 임베딩을 위해 섹션 3.1 또는 3.2를 진행합니다(그림 2). 세척 및 시약 변경 전에 3D 구조 침강을 위한 충분한 시간을 허용하십시오. 튜브 바닥에 떠 있는 유기체를 흡입하지 않도록 주의하십시오. 파라핀 임베딩에 대해서는 그림 2 를 참조하십시오. 대형(Ø ≥ 400μm) 3D 세포 배양 모델의 파라핀 임베딩매립 전날, 파라핀(파라핀 배스)으로 채워진 2개의 150mL 플라스크, 샘플당 작은 금속 매립 몰드, 미세 집게를 65°C로 예열합니다. 사전 코팅된 1mL 팁을 사용하여 1x PBS의 오가노이드를 폴리테트라플루오로에틸렌 안감 병 뚜껑이 있는 평평한 바닥 유리관에 조심스럽게 옮깁니다. 오가노이드 침전물을 제거하고 1x PBS를 조심스럽게 제거한 다음 70% 에탄올로 교체합니다. 최소 30분 동안 배양합니다. 오가노이드 침전물을 침전시키고, 70% 에탄올을 조심스럽게 제거한다. 즉시 사용 가능한 에오신 Y 용액 1mL로 교체하십시오. 튜브를 튕기고 최소 30분 동안 염색합니다. 에오신 용액을 조심스럽게 제거하고 오가노이드를 1mL의 100% 에탄올로 각각 ~30분 동안 세 번 연속 세척하여 탈수합니다.알림: 가연성 및 휘발성 액체 인 에탄올은 심한 눈과 호흡기 자극을 유발합니다. 흄 후드에서 조작하고 보호용 눈 고글을 착용하십시오. 100% 에탄올을 조심스럽게 제거하고 화학 후드 아래에서 각각 ~30분 동안 1mL의 크실렌으로 3회 연속 세척하여 오가노이드를 제거합니다.알림: 크실렌은 증기가 자극을 유발할 수 있는 독성이 있는 액체 가연성 물질입니다. 흄 후드에서 조작하십시오. 피부에 직접 닿지 않도록 하고 고무 장갑과 보호용 눈 고글을 착용하십시오. 화학 후드 아래에서 카세트의 구획 중 하나에 생검 패드 (이전에 크실렌에 담근 것)를 배치하여 흰색 마이크로 트윈 조직 카세트를 준비합니다. 사전 코팅된 2mL 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 3D 구조물을 생검 패드로 조심스럽게 옮깁니다. 오가노이드가 움직이지 않도록 크실렌에 적신 다른 생검 패드로 덮고 카세트를 닫습니다. 여러 샘플이 처리되는 경우 카세트를 크실렌 욕조에 넣어 추가 처리를 기다립니다. 모든 샘플이 카세트로 옮겨지면 카세트를 예열된 파라핀 수조에 65°C에서 30분 동안 넣습니다. 카세트를 신선한 예열 파라핀 욕조에 밤새 옮깁니다. 파라핀 함침 후, 예열 된 임베딩 몰드를 취하고, 가열 된 파라핀을 첨가한다. 3D 구조가 포함된 생검 패드를 금형에 넣고 모든 유기체가 금형 바닥에 떨어질 때까지 부드럽게 저어줍니다. 예열 된 미세 집게를 사용하여 3D 구조를 금형 중앙에 매우 조심스럽게 배치합니다. 섹션 3.3을 진행합니다.알림: 집게로 3D 구조를 방해하지 않도록주의하십시오. 밀지 만 꼬집지 마십시오. 소형(Ø ≤ 400 μm) 3D 세포 배양 모델의 파라핀 임베딩매립 전날, 파라핀(파라핀 배스)으로 채워진 2개의 150mL 플라스크, 샘플당 작은 금속 매립 몰드, 미세 집게를 65°C로 예열합니다. 오가노이드 현탁액에서 1x PBS를 조심스럽게 제거합니다. 1x 트리스 완충 식염수(TBS) 1mL에 3회 부드럽게 세척합니다. 오가노이드를 만지지 않고 가능한 한 많은 1x TBS를 제거하십시오.참고: 샘플을 흡입하지 않도록 주의하십시오. 필요한 경우 RT에서 50 x g에서 5 분 스핀을 수행하십시오. 남아있는 인산염은 다음 단계를 방해하여 특히 겔 중합을 방지합니다. 따라서 처리 단계에서 PBS 솔루션을 사용하지 마십시오. 이 단계에서는 카세트, 시약 #1(투명 유체) 및 시약 #2(유색 유체)가 포함된 상용 키트를 사용하여 잠재적으로 작은 조각을 잃지 않고 파라핀 포매 절차를 용이하게 했습니다( 재료 표 참조). 키트 지침을 따릅니다. 카세트는 이미 제자리에 있는 백킹 용지와 보드 인서트로 사전 조립되어 있습니다. 시약 #2 2방울을 튜브에 넣고 튜브를 두드려 부드럽게 섞습니다. 시약 #1 2방울을 넣고 두드려 다시 섞어 젤이 굳어지도록 합니다. 가는 집게를 사용하여 튜브에서 젤을 제거하고 카세트의 우물에 놓습니다. 흄 후드 아래에서 다음과 같이 카세트를 연속 수조에 넣어 샘플을 탈수시킵니다(150mL 플라스크를 사용하고 각 수조에 신선한 에탄올 또는 크실렌 사용): 에탄올 70%, 30분; 에탄올 96 %, 30 분; 에탄올 100 %, 3 회 세척, 각각 30 분; 크실렌, 3회 세척, 각 30분. 카세트를 65°C에서 30분 동안 예열된 파라핀 배스에 넣고 밤새 신선한 예열된 파라핀 배스로 옮깁니다. 파라핀 함침 후, 예열 된 임베딩 몰드를 취하고, 가열 된 파라핀을 첨가한다. 카세트를 열고 미세한 집게로 젤을 조심스럽게 빼낸 다음 3D 구조가 포함된 젤을 매립 몰드의 중앙에 놓습니다. 섹션 3.3을 진행합니다. 파라핀 임베딩의 일반적인 단계금형을 차가운 지역으로 부드럽게 옮겨 파라핀이 얇은 층으로 응고되도록 하여 3D 구조를 적절한 위치에 유지합니다. 금형 위에 티슈 카세트를 추가하고 뜨거운 파라핀을 추가하여이 플라스틱 카세트를 덮습니다. 금형이 완전히 고형화되면 제거하고 섹션 3.4를 진행합니다.알림: 파라핀 블록은 실온에서 수년간 보관할 수 있습니다. 그림 2: 크고 작은 체외 3D 세포 배양 모델의 파라핀 임베딩 절차 개요.(A) 파라핀 포매를위한 표준 절차. 고정 및 탈수 후 3D 구조는 시각화를 용이하게하기 위해 에오신으로 염색됩니다 (왼쪽 상단 및 하단). 3D 구조는 2mL 파스퇴르 피펫(가운데)을 사용하여 카세트의 생검 패드(파란색)에 조심스럽게 배치됩니다. 파라핀 함침 후, 3D 구조는 집게를 사용하여 액체 파라핀에 부드럽게 떨어 뜨리고 생검 패드에서 부드럽게 교반합니다. 작은 3D 구조는 패드에서 해제할 수 없으므로 이 단계에서 손실됩니다(오른쪽 하단: 임베딩 실패). 대형 3D 구조만 포함됩니다(오른쪽 상단: 성공적인 임베딩). 화살촉은 3D 문화권을 가리킵니다. (B) 표준 파라핀 임베딩 프로토콜에 대한 대안. 작은 3D 구조를 고정한 후 상용 키트를 사용하여 세포를 젤에 유지하고 파라핀 함침 후 금형으로 쉽게 옮길 수 있습니다(오른쪽: 성공적인 임베딩). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 블록 절단 및 염색표준 마이크로톰을 사용하여 4μm 절편을 절단하고 표준 조직학적 및 면역조직화학적 기술을 수행한다. 섹션 3.5를 진행합니다.참고: 특정 슬라이드( 재료 표 참조)는 섹션의 더 나은 접착을 위해 사용되었습니다. 슬라이드는 실온 또는 4 ° C에서 수년간 보관할 수 있습니다. 이미지 수집 및 분석디지털 슬라이드 스캐너 또는 정립 현미경을 사용하여 이미징을 수행하고, 전체 3D 구조 섹션에 걸쳐 세포별로 형태학적 및 다중화된 발현 데이터를 보고하는 빠른 디지털 정량 분석을 위한 플랫폼을 사용하여 데이터를 분석합니다(자세한 내용은 보충 그림 2 참조).참고: 20x 목표는 이 그룹에서 일상적으로 사용됩니다.