צביעה והדמיה ברזולוציה גבוהה של מודלים תלת מימדיים של אורגנואידים וכדוריים

הערה: יש לצפות לאובדן של ≤25% מהמספר הראשוני של מבנים תלת-ממדיים במהלך השלבים הכוללים שינויים מגיבים ושטיפה בהליך הבא. תכנן להשתמש במספר סופי של לפחות עשרה מבנים תלת-ממדיים, בגודל הנע בין 100 ל-500 מיקרומטר, לכל תנאי נבדק כדי לבצע ניתוחי תמונה איכותיים וכמותיים. במידת הצורך, עבור מבנים גדולים יותר, לחתוך את הקצוות של 1 מ”ל פיפטה טיפים כדי למנוע שבירת המבנים. עבור כל השלבים, אם שקיעת המבנה התלת-ממדי ארוכה מדי, ניתן לסובב תאים בעדינות במהירות של 50 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). בהתאם לנושא הנחקר, יש לשקול יתרונות/חסרונות של צעד מסתובב כזה, שכן צנטריפוגה יכולה לסכן את צורת המבנים התלת-ממדיים. הימנע מסתובב ב >100 × גרם. 1. איסוף וקיבוע מודלים תלת ממדיים של תרביות תאים הערה: היזהר לא לשאוף את המבנים התלת-ממדיים, שיהיו מחוברים רק באופן רופף לקיר הצינור. קצירת מודלים תלת ממדיים של תרביות תאים המשובצים במטריצההערה: סעיף זה מתאר את ההתאוששות של מבנים תלת-ממדיים שגדלו בטיפות של תמצית קרום מרתף מסרקומה של נחיל אנגלברט-הולם (BME), אך עשויים להיות מותאמים למטריצות אחרות. ראה את הדיון לנקודות מכריעות לגבי ECM.הסר את מדיום התרבית מהבארות מבלי להפריע למטריצה התלת-ממדית. צפו מראש את החלק הפנימי והחיצוני של קצה פיפטה במינון 1 מ”ל בחלבון (הנקרא להלן קצה מ”ל 1 מ “ל מצופה מראש ) על ידי טבילת הקצה לכל אורכו באלבומין סרום בקר 0.1% (BSA) במי מלח חוצצי פוספט (PBS) (הנקרא תמיסה PBS-BSA 0.1% להלן) ופיפטוף 1 מ”ל של תמיסה זו למעלה ולמטה פעמיים.הערה: ציפוי מקדים זה ימנע מהתאים להידבק לקצה וימזער כל אובדן. מצפים מראש את החלק הפנימי של צינור צנטריפוגה (15 מ”ל) בחלבון (נקרא להלן צינור צנטריפוגה מצופה מראש ) על ידי מילוי חוזר ונשנה בתמיסת PBS-BSA 0.1% וריקון הצינור.הערה: פעולה זו תמנע מהתאים להידבק לצינור ותמזער כל אובדן. באמצעות קצה 1 מ”ל המצופה מראש, בזהירות להשעות מחדש את המבנים התלת-ממדיים של הבאר באמצעות 1 מ”ל של PBS 1x קר כקרח, ולהעביר בעדינות את המתלה המכיל את המבנים התלת-ממדיים לצינור הצנטריפוגה המצופה מראש. הוסיפו בעדינות 13 מ”ל של PBS 1x קר כקרח, ואפשרו למבנים התלת-ממדיים לשקוע על קרח למשך 10 דקות לפחות.הערה: במידת הצורך, סחור במשך 5 דקות ב- 50 × גרם ב- 4 ° C. הימנע מסתובב >100 × גרם, כמו זה יפגע את הצורה של מבנים 3D. הסר את supernatant. בעזרת קצה מ”ל 1 מ”ל מצופה מראש, השהה מחדש בעדינות את המבנים התלת-ממדיים ב-1 מ”ל של PBS 1x קר כקרח. חזור על שלבים 1.1.4 עד 1.1.5 כדי לקבל גלולה הומוגנית ללא שאריות מטריצה תלת-ממדית.הערה: הסרת מטריצה יעילה מושפעת מסוג המטריצה, המספר והגודל של מבנים תלת-ממדיים ודורשת אופטימיזציה לתנאי תרבות שונים. עבור מבנים תלת-ממדיים הגדלים ב-BME, ההתאוששות מהסרת המטריצה אורכת בדרך כלל 45-60 דקות. באמצעות קצה מצופה מראש של 1 מ”ל, העבר את מתלה PBS 1 מ”ל 1x המכיל את המבנים התלת-ממדיים לצינור צנטריפוגה מצופה מראש של 1.5 מ”ל, והמשך עם סעיף 1.3. קצירת מודלים צפים של תרביות תאים תלת-ממדיותבאמצעות קצה מצופה מראש 1 מ”ל, בזהירות לאסוף ולהעביר את המבנים 3D לצינור צנטריפוגה 1.5 מ”ל מצופה מראש. אפשר למבנים התלת-ממדיים לשקוע, או להסתובב במשך 5 דקות ב-50 × גרם ב-RT. הסר את supernatant. באמצעות קצה מ”ל 1 מ”ל מצופה מראש, להשעות מחדש את המבנים התלת-ממדיים ב-1 מ”ל של 1x PBS. המשך עם סעיף 1.3. קיבוע מודלים תלת ממדיים של תרביות תאיםאפשרו למבנים התלת-ממדיים לשקוע. בזהירות להסיר את supernatant; מתחת למכסה מנוע, יש להשהות מחדש בעדינות את המבנים התלת-ממדיים ב-1 מ”ל פורמלין באמצעות קצה מצופה מראש של 1 מ”ל.הערה: פורמלין מכיל פורמלדהיד, שהוא מסוכן. לתפעל את הכימיקל במכסה מנוע כימי. יש ללבוש כפפות גומי ומשקפי בטיחות. דגרו על המבנים התלת-ממדיים למשך 30 דקות ב-RT.הערה: שלב קיבוע של 30 דקות עם פורמלין נדרש עבור immunostaining של מגוון רחב של מבנים 3D (משתנה בגודל, צורה, ומקור). עם זאת, באופן כללי, זמני קיבוע ארוכים יותר (>3 שעות) מתאימים יותר לשימור הפלואורסצנטיות של חלבוני כתב. אפשרו למבנים התלת-ממדיים לשקוע, או להסתובב במשך 5 דקות ב-50 × גרם ב-RT. הסירו בעדינות את הפורמלין והחליפו אותו ב-1 מ”ל של 1x PBS. חזור על שלב כביסה זה ב- PBS 1x פעמיים. אחסן את הדגימות ב -4 מעלות צלזיוס, והמשך עם סעיף 2 או סעיף 3.הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן, ולשמור על התאים ב- 4 ° C לאחסון לטווח ארוך (> שנה). 2.3D צביעה של הר שלם, הדמיה וניתוח של מודלים תלת-ממדיים של תרביות תאים הערה: מכיוון שהאורגנואידים מחוברים באופן רופף לדופן הצינור, טפל בהם בעדינות מכיוון שכל השינויים הבאים מגיבים עלולים לגרום לאובדן דגימה. לפני שתתחיל, ודא את הזמינות של הפקדים הנכונים עבור צביעה. בקרות חיוביות ושליליות יכולות להיות תאים, שבהם החלבון המעניין ידוע כמתבטא יתר על המידה או נעדר, בהתאמה. דגירה על דגימות ללא הנוגדן הראשוני כדי לקבוע אם האות שנצפה נובע מקשירה לא ספציפית של הנוגדן המשני. מכיוון שתאים מסוימים נוטים להציג רמות גבוהות של אוטופלואורסצנטיות, השתמש בפקדים נטולי נוגדנים משניים כדי לקבוע אם הפלואורסצנטיות שנצפתה מגיעה מאוטופלואורסצנטיות ברקע. ניתן לשלב תיוג חיסוני והדמיית כתב פלואורסצנטי. צביעה תלת ממדית של הר שלםהכינו את תמיסת חסימת החדירה (PB) על ידי תוספת PBS 1x עם 0.1%-1% של חומר פעילי שטח לא יוני (ראו טבלת חומרים), 1% דימתיל-סולפוקסיד, 1% BSA ו-1% נסיוב חמורים (או מהחיה שבה גידלו את הנוגדנים המשניים).הערה: מטב בזהירות את ריכוז חומר פעילי השטח הלא יוני בהתאם למיקום של המטרה: ממברנה (0-0.5%), ציטופלסמה (0.5-1%) וגרעין (1%). ניתן לאחסן תמיסה זו בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודש אחד. BSA בדרך כלל עובד טוב עבור שלב החסימה, אבל במקרה של רעשי רקע גבוהים, לבצע בדיקה אמפירית כדי לקבל את התוצאות הטובות ביותר האפשריות עבור שילוב נתון של נוגדנים. העבר את האורגנואידים מצינור הצנטריפוגה של 1.5 מ”ל לצינור של 0.5 מ”ל באמצעות קצה מצופה מראש של 1 מ”ל. תן למשקעים אורגנואידים, להסיר בעדינות את PBS 1x, ולהחליף אותו עם 0.5 מ”ל של תמיסת PB. דגרו על האורגנואידים בתסיסה אופקית עדינה (30-50 סל”ד) למשך שעה אחת ב-RT. תנו לאורגנואידים לשקוע, הסירו בעדינות את תמיסת ה-PB ושטפו פעמיים ב-1 מ”ל PBS-BSA 0.1% למשך 3 דקות.הערה: המתנה של 3 דקות מאפשרת למבנים לשקוע בתחתית הצינור. הסר בעדינות את PBS-BSA 0.1%, והוסף 250 μL של נוגדן ראשוני מדולל בריכוז המתאים בתמיסת PB:1x PBS (1:10). כדי להכין 10 מ”ל של תמיסת PB:1x PBS (1:10), יש לדלל 1 מ”ל של תמיסת PB ב-9 מ”ל של 1x PBS. יש לדגור במשך 2-3 ימים עם תסיסה אופקית עדינה (30-50 סל”ד) ב-4°C.הערה: זמן דגירה מתאים של נוגדנים הוא קריטי לחדירת נוגדנים מתאימה מכיוון שמבנים תלת ממדיים יכולים לפעמים להגיע לגדלים גדולים. הניחו לאורגנואידים לשקוע, והסירו בעדינות את תמיסת הנוגדנים העיקרית. יש לכבס 5x ב-PBS-BSA 0.1% למשך 3 דקות לכביסה ולאחר מכן פעמיים ב-1 מ”ל PBS-BSA 0.1% למשך 15 דקות לכביסה בתסיסה אופקית עדינה. הוסף 250 μL של נוגדן משני מדולל ב 1:250 בתמיסת PB:1x PBS (1:10). יש לדגור במשך 24 שעות ב-4°C עם תסיסה אופקית עדינה (30-50 סל”ד). בשלב זה, הגן על הדגימות מפני אור. הוסף 250 μL של Hoechst 33342 (20 μM תמיסת מלאי) מדולל ב 1:1000 בתמיסת PB:1x PBS (1:10), ודגור עוד שעתיים ב 4 ° C עם תסיסה אופקית עדינה (30-50 סל”ד). תן לאורגנואידים משקעים, והסר בעדינות את התמיסה המכילה נוגדן משני + Hoechst 33342. שטפו את האורגנואידים 5x ב-1 מ”ל של 1x PBS במשך 3 דקות לכל כביסה ולאחר מכן 2x ב-1 מ”ל של 1x PBS למשך 15 דקות לכל כביסה עם תסיסה אופקית עדינה (30-50 סל”ד).הערה: חיוני לשטוף באופן נרחב את הדגימות כדי למנוע רעשי רקע או אובדן אות. אחסן את הדגימות ב- PBS ב- 4 °C עד לרכישת תמונה. המשך עם סעיף 2.2.הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן, וניתן לאחסן את הדגימות ב -4 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים, מוגן מפני אור. הכנת דגימה להדמיה קונפוקליתבאמצעות קצה מ”ל 1 מ”ל מצופה מראש, בזהירות להעביר את האורגנואידים לתוך 50 μL של 1x PBS לכל באר microplate פוליסטירן שחור 96 באר. המשך לשלב 2.2.3 או סעיף 2.3.הערה: בשלב זה, הדגימה יכולה להיות מוגנת מפני אור ומאוחסנת ב 4 ° C במשך שבועות רבים. ניקויהערה: שלב הניקוי הוא אופציונלי וניתן להשתמש בו כדי לתייג אורגנואידים חיסוניים או לזהות פלואורסצנטיות אנדוגנית. ניקוי יכול לגרום להתכווצות מבנה תלת-ממדית, אך אינו משנה את המורפולוגיה הכללית למעט אורגנואידים חד-שכבתיים כדוריים עם לומןגדול 4. עבור אורגנואידים ציסטיים אלה, דלג על שלב הסליקה, ובצע הדמיה של רקמות עמוקות6.הכינו תמיסת ניקוי גליצרול-פרוקטוז בנפח 2.5 מ’ המכילה 50% גליצרול v/v, 11% v/v מים מזוקקים ו-45% פרוקטוז w/v על ידי ערבוב על מערבל מגנטי לפחות למשך הלילה עד שהתמיסה תהיה מסיסה והומוגנית לחלוטין. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C בחושך למשך עד חודש אחד. הסר כמה שיותר PBS 1x מבלי לגעת באורגנואידים. הוסף 200 μL של תמיסת הניקוי באמצעות קצה פיפטה 1 מ”ל לאחר הסרת הקצה, והשהה מחדש בעדינות כדי למנוע היווצרות של בועות. לדגור ב- RT לפחות 12 שעות, ולהמשיך עם סעיף 3.הערה: מכיוון שפתרון הסליקה צמיג, קשה לטפל בנפחים קטנים. כדי להקל על הטיפול, ודא שהפתרון נמצא ב- RT, ופיפטה לאט. לניקוי מיטבי, יש לאפשר לדגימה לשקוע בתמיסת הניקוי לפחות 24 שעות לפני ההדמיה. אם מבנים תלת-ממדיים צפים בזמן הרכישה, בצע סיבוב אופציונלי למשך 10 דקות ב- <100 × גרם ב- RT, או המתן זמן רב יותר (יום עד מספר ימים) כדי לאפשר להם לשקוע. ניתן להשהות את הפרוטוקול בשלב זה לפני שתמשיך להדמיה אם הוא מוגן מפני אור ומאוחסן ב -4 ° C (במשך שבועות) או -20 ° C (במשך חודשים). רכישה וניתוח של תמונותהערה: טכנולוגיית חתך תמונות תידרש כדי לצלם מבנים תלת-ממדיים.השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי, והעדיף מטרות טבילה עם צמצם מספרי גבוה יותר (NA) בהשוואה לאוויר. בחר מטרות הגדלה (10x, 20x, 40x) בהתאם לגודל מבנים תלת ממדיים, שחזור תמונה (תפירה) ופתרונות המשמשים לניתוח. בעת בחירת מצב הרכישה, קח בחשבון את עומק המיקוד של המטרה המשמשת להגדרת השלב עבור ערימת Z; לאפשר עיבוד תלת-ממדי אופטימלי.הערה: פתרונות ניתוח תמונה משתנים, ויהיה צורך להתאים את הניתוח לתוכנה שבה נעשה שימוש. לדוגמה, פרוטוקול ניתוח זה התבסס על תוכנת ניתוח תוכן גבוהה (ראו טבלת חומרים ואיור משלים 1 לפרטים) ומספק נתונים על פילוח אובייקטים, חישוב תכונות ובחירת אוכלוסיית תאים בתוך אובייקט משוחזר תלת-ממדי. 3. חתך דו-ממדי, צביעה, הדמיה וניתוח של מודלים תלת-ממדיים של תרביות תאים הערה: מודלים תלת-ממדיים של תרביות תאים משתנים בגודלם. המשך עם סעיף 3.1 או 3.2 להטמעת פרפין יעילה (איור 2). יש להקדיש מספיק זמן לשיקוע מבנה תלת-ממדי לפני שטיפות ושינויים מגיבים. היזהר לא לשאוף את האורגנואידים כי יהיה צף בתחתית הצינור. להטמעת פרפין, עיינו באיור 2 לקבלת הדרכה. שיבוץ פרפין של מודלים גדולים (Ø ≥ 400 μm) של תרביות תאים תלת-ממדיותביום שלפני ההטבעה, חממו מראש שתי צלוחיות של 150 מ”ל מלאות בפרפין (אמבטיות פרפין), תבנית הטבעה מתכתית קטנה לכל דגימה, ומלקחיים עדינים ל -65 מעלות צלזיוס. בעזרת קצה מ”ל 1 מ”ל מצופה מראש, מעבירים בזהירות את האורגנואידים ב-PBS 1x לשפופרת זכוכית שטוחה עם פקק בקבוק מרופד פוליטטרה-פלואורואתילן. תן למשקעים אורגנואידים, להסיר בזהירות את PBS 1x, ולהחליף אותו עם 70% אתנול. יש לדגור במשך 30 דקות לפחות. תן אורגנואידים משקעים, בזהירות להסיר את 70% אתנול. החלף אותו עם 1 מ”ל של פתרון eosin Y מוכן לשימוש. יש להעיף את הצינור ולהכתים למשך 30 דקות לפחות. בזהירות להסיר את תמיסת eosin, ולייבש את אורגנואידים בשלוש שטיפות רצופות עם 1 מ”ל של 100% אתנול במשך ~ 30 דקות כל אחד.הערה: אתנול, נוזל דליק ונדיף, גורם לגירוי חמור בעיניים ובדרכי הנשימה. תמרנו אותו במכסה מנוע מנדף, והרכיבו משקפי מגן לעיניים. בזהירות להסיר את 100% אתנול, ותחת מכסה מנוע כימי, לנקות את האורגנואידים ב 3 שטיפות רצופות עם 1 מ”ל של xylene במשך ~ 30 דקות כל אחד.הערה: קסילן הוא נוזל רעיל דליק שאדיו עלולים לגרום לגירוי. תמרנו אותו במכסה מנוע. יש להימנע ממגע ישיר עם העור, וללבוש כפפות גומי ומשקפי מגן לעיניים. מתחת למכסה מנוע כימי, הכינו קלטת רקמת מיקרו-טווין לבנה על ידי הנחת חתיכת כרית ביופסיה (שהייתה ספוגה בעבר בקסילן) בתוך אחד התאים של הקלטת. מעבירים בזהירות את המבנים התלת-ממדיים באמצעות פיפטת פסטר פלסטיק 2 מ”ל מצופה מראש לכרית הביופסיה. כסו אותם בכרית ביופסיה נוספת ספוגה בקסילן כדי למנוע מהאורגנואידים לזוז, וסגרו את הקלטת. אם מעובדים מספר דגימות, הניחו את הקלטת באמבט קסילן כדי להמתין לעיבוד נוסף. לאחר שכל הדגימות מועברות לקלטות, הניחו את הקלטות באמבט פרפין שחומם מראש למשך 30 דקות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס. מעבירים את הקלטות לאמבט פרפין טרי שחומם מראש למשך הלילה. לאחר הספגת פרפין, לוקחים תבנית הטבעה שחוממה מראש, ומוסיפים לה את הפרפין המחומם. הכניסו את כרית הביופסיה המכילה את המבנים התלת-ממדיים לתבנית, ועוררו אותה בעדינות עד שכל האורגנואידים צונחים לתחתית התבנית. בזהירות רבה מניחים את המבנים התלת-ממדיים במרכז התבנית באמצעות מלקחיים עדינים שחוממו מראש. המשך עם סעיף 3.3.הערה: היזהר לא להפריע למבנים התלת-ממדיים עם המלקחיים; לדחוף, אבל לא לצבוט אותם. שיבוץ פרפין של מודלים קטנים (Ø ≤ 400 μm) של תרביות תאים תלת-ממדיותביום שלפני ההטבעה, חממו מראש שתי צלוחיות של 150 מ”ל מלאות בפרפין (אמבטיות פרפין), תבנית הטבעה מתכתית קטנה לכל דגימה, ומלקחיים עדינים ל -65 מעלות צלזיוס. הסר בזהירות את PBS 1x ממתלה האורגנואידים. בצעו בעדינות 3 שטיפות ב-1 מ”ל של 1x Tris-buffered salt (TBS). הסר כמה שיותר 1x TBS מבלי לגעת באורגנואידים.הערה: היזהר לא לשאוף את המדגם. במידת הצורך, בצע סיבוב של 5 דקות ב- 50 x g ב- RT. עקבות פוספט שנותרו יפריעו לשלבים הבאים, בעיקר מניעת פילמור ג’ל. לכן, אל תשתמש בפתרונות PBS במהלך כל שלב עיבוד. עבור שלב זה, ערכה מסחרית, המכילה קלטות, מגיב #1 (נוזל שקוף), ומגיב #2 (נוזל צבעוני), שימשה כדי להקל על הליך משובץ פרפין מבלי לאבד שברים זעירים (ראה טבלה של חומרים). יש לפעול בהתאם להוראות הערכה. הקלטות מורכבות מראש עם ניירות גיבוי ותוספות לוח כבר במקום. הוסף 2 טיפות של מגיב #2 לתוך הצינור, וערבב בעדינות על ידי הקשה על הצינור. הוסף 2 טיפות של מגיב #1, וערבב שוב על ידי הקשה כדי להפוך את הג’ל להתמצק. בעזרת המלקחיים העדינים, מוציאים את הג’ל מהצינור ומניחים אותו בבאר הקלטת. מתחת למכסה המנוע, יש לייבש את הדגימה על ידי הצבת הקלטת באמבטיות עוקבות כדלקמן (השתמש בצלוחיות 150 מ”ל, והשתמש באתנול טרי או קסילן לכל אמבטיה): אתנול 70%, 30 דקות; אתנול 96%, 30 דקות; אתנול 100%, שלוש כביסות, 30 דקות כל אחת; קסילן, שלוש כביסות, 30 דקות כל אחת. הניחו את הקלטות באמבט פרפין שחומם מראש למשך 30 דקות בחום של 65°C, והעבירו אותן לאמבט פרפין טרי שחומם מראש למשך הלילה. לאחר הספגת פרפין, לוקחים תבנית הטבעה שחוממה מראש, ומוסיפים אליה פרפין מחומם. פתחו את הקלטת, עקרו בזהירות את הג’ל בעזרת מלקחיים עדינים, והניחו את הג’ל המכיל את המבנים התלת ממדיים על מרכז תבנית ההטבעה. המשך עם סעיף 3.3. שלבים נפוצים להטמעת פרפיןמעבירים בעדינות את התבנית לאזור קר כדי לאפשר לפרפין להתמצק בשכבה דקה, שתשמור על המבנים התלת ממדיים במיקום המתאים. מוסיפים קסטת טישו על גבי התבנית, ומוסיפים פרפין חם כדי לכסות את קסטת הפלסטיק הזו. הסר את התבנית ברגע שהיא מוצקה לחלוטין, והמשך בסעיף 3.4.הערה: קוביות פרפין ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר במשך שנים. איור 2: סקירה כללית של הליך הטמעת פרפין של מודלים תלת-ממדיים של תרביות תאים תלת-ממדיות גדולות וקטנות במבחנה.(A) הליך סטנדרטי לשיבוץ פרפין. לאחר קיבוע והתייבשות, מבנים תלת ממדיים מוכתמים עם eosin כדי להקל על הדמיה שלהם (למעלה ולמטה משמאל). מבנים תלת ממדיים ממוקמים בזהירות על כרית הביופסיה (כחול) בקלטת באמצעות צינור פסטר 2 מ”ל (באמצע). לאחר ספיגת פרפין, המבנים התלת-ממדיים מושלכים בעדינות לתוך הפרפין הנוזלי באמצעות מלקחיים ונסערים בעדינות בכרית הביופסיה. מבנים תלת-ממדיים קטנים הולכים לאיבוד במהלך שלב זה מכיוון שלא ניתן לשחרר אותם מהפד (מימין למטה: הטבעה כושלת). רק מבנים תלת-ממדיים גדולים יוטמעו (מימין למעלה: הטבעה מוצלחת). ראשי חץ מצביעים על תרבויות תלת-ממדיות. (B) חלופה לפרוטוקול שיבוץ פרפין סטנדרטי. לאחר קיבוע מבנים תלת ממדיים קטנים, ערכה מסחרית משמשת לשמירה על תאים בג’ל ולהקל על העברתם לתבנית לאחר ספיגת פרפין (מימין: הטבעה מוצלחת). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. חתך בלוקים וצביעהחתכו חתכים של 4 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום סטנדרטי, ובצעו טכניקות היסטולוגיות ואימונוהיסטוכימיות סטנדרטיות. המשך עם סעיף 3.5.הערה: שקופיות ספציפיות (ראה טבלת חומרים) שימשו להדבקה טובה יותר של מקטעים. ניתן לאחסן את המגלשות בטמפרטורת החדר או ב -4 מעלות צלזיוס במשך שנים. רכישה וניתוח של תמונותבצע הדמיה באמצעות סורק שקופיות דיגיטלי או מיקרוסקופ זקוף, ונתח נתונים באמצעות פלטפורמה לניתוח כמותי דיגיטלי מהיר המדווח על נתוני ביטוי מורפולוגיים ומרובבים על בסיס תא אחר תא על פני חלקים שלמים של מבנה תלת-ממדי (ראה איור משלים 2 לפרטים).הערה: המטרה 20x נמצאת בשימוש שגרתי על-ידי קבוצה זו.