三维类器官和球状体模型的染色和高分辨率成像

注意：在涉及试剂更换和以下过程中洗涤的步骤中，预计初始数量的3D结构损失≤25%。计划在每个测试条件下使用至少十个尺寸从 100 到 500 μm 的最终数量的 3D 结构来执行定性和定量图像分析。如有必要，对于较大的结构，切开 1 mL 移液器吸头的末端，以避免破坏结构。对于所有步骤，如果3D结构沉降时间过长，则可以在室温（RT）下以50× g 轻轻旋转细胞5分钟。根据所研究的问题，应考虑这种纺丝步骤的优缺点，因为离心会影响3D结构的形状。避免以 >100 × g 的速度旋转。 1. 3D细胞培养模型的收集和固定 注意：注意不要吸出3D结构，这些结构只会松散地连接到管壁上。 收获嵌入基质中的 3D 细胞培养模型注意：本节描述了从鼠Engelbreth-Holm-Swarm肉瘤（BME）的基底膜提取物滴中生长的3D结构的回收，但可能适用于其他基质。有关 ECM 的关键点，请参阅讨论。在不破坏3D基质的情况下从孔中取出培养基。将吸头的整个长度浸入磷酸盐缓冲盐水 （PBS）（以下简称 PBS-BSA 0.1% 溶液）中的 0.1% 牛血清白蛋白 （BSA） 中，然后将 1 mL 该溶液上下移液两次，用蛋白质（以下称为预包被的 1 mL 吸头）预涂 1 mL 移液器吸头的内部和外部。注意：此预涂层将防止细胞粘附在尖端上，并最大限度地减少任何损失。 通过反复填充PBS-BSA 0.1%溶液并清空试管，用蛋白质（以下称为预 包被离心 管）预涂离心机（15 mL）管的内部。注意：这将防止细胞粘附在试管上并最大限度地减少任何损失。 使用预包被的 1 mL 吸头，使用 1 mL 冰冷的 1x PBS 小心地重悬孔的 3D 结构，然后将含有 3D 结构的悬浮液轻轻转移到预包被离心管中。 轻轻加入 13 mL 冰冷的 1x PBS，让 3D 结构在冰上沉淀至少 10 分钟。注意：如果需要，在4°C下以50 ×g 旋转5分钟。 避免旋转> 100 × g，因为这会影响 3D 结构的形状。 除去上清液。使用预包被的 1 mL 吸头，将 3D 结构轻轻重悬于 1 mL 冰冷的 1x PBS 中。重复步骤1.1.4至1.1.5以获得没有任何3D基质残留物的均匀沉淀。注意：有效的基质去除受基质类型、3D 结构的数量和大小的影响，需要针对不同的培养条件进行优化。对于在BME中生长的3D结构，从基质去除中恢复通常需要45-60分钟。 使用预包被的 1 mL 吸头，将包含 3D 结构的 1 mL 1x PBS 悬浮液转移到预包被的 1.5 mL 离心管中，然后继续第 1.3 节。 收获浮动3D细胞培养模型使用预包被的 1 mL 吸头，小心地收集 3D 结构并将其转移到预包被的 1.5 mL 离心管中。让3D结构沉淀，或在室温下以50× g 旋转5分钟。 除去上清液。使用预包被的 1 mL 吸头，将 3D 结构重悬于 1 mL 的 1x PBS 中。继续第 1.3 节。 3D细胞培养模型的固定允许 3D 结构沉积。小心地除去上清液;在通风橱下，使用预包被的 1 mL 吸头将 3D 结构轻轻重悬于 1 mL 福尔马林中。注意：福尔马林含有甲醛，这是危险的。在化学罩中操作化学品。戴橡胶手套和安全护目镜。 在室温下孵育3D结构30分钟。注意：需要福尔马林30分钟的固定步骤才能对各种3D结构（大小，形状和来源不同）进行免疫染色。然而，一般来说，较长的固定时间（>3小时）更适合保存报告蛋白的荧光。 让 3D 结构沉淀，或在室温下以 50 × g 离心 5 分钟。 轻轻取出福尔马林，并用 1 mL 的 1x PBS 代替。在1x PBS中重复此洗涤步骤两次。将样品储存在4°C，然后继续第2节或第3节。注意：该方案可以在此处暂停，细胞可以保持在4°C以进行长期储存（>1年）。 2.3D 3D细胞培养模型的全贴片染色、成像和分析 注意：由于类器官松散地附着在管壁上，请轻柔地处理它们，因为以下所有试剂更换都可能导致样品损失。在开始之前，请确保有正确的染色对照。阳性和阴性对照可以是细胞，其中已知感兴趣的蛋白质分别过度表达或不存在。孵育不含一抗的样品，以确定观察到的信号是否是由于二抗的非特异性结合引起的。由于某些细胞倾向于显示高水平的自发荧光，因此使用没有二抗的对照来确定观察到的荧光是否来自背景自发荧光。免疫标记和荧光报告基因可视化可以结合使用。 3D 全封片染色通过补充1x PBS与0.1%-1%的非离子表面活性剂（参见 材料表），1%二甲基亚砜，1%BSA和1%驴血清（或来自饲养二抗的动物）来制备透化封闭（PB）溶液。注意：根据靶标的定位仔细优化非离子表面活性剂的浓度：膜（0-0.5%），细胞质（0.5-1%）和细胞核（1%）。该溶液可在 4°C 下储存长达 1 个月。BSA通常适用于阻断步骤，但在高背景噪声的情况下，请进行经验测试，以获得给定抗体组合的最佳结果。 使用预包被的 1 mL 吸头将类器官从 1.5 mL 离心管转移到 0.5 mL 管中。让类器官沉淀，轻轻取出 1x PBS，然后用 0.5 mL PB 溶液代替。在室温下以温和的水平搅拌（30-50rpm）孵育类器官1小时。 让类器官沉淀，轻轻除去PB溶液，并在1mL PBS-BSA 0.1%中洗涤两次3分钟。注意：等待3分钟会使结构在管底部沉淀。 轻轻除去 PBS-BSA 0.1%，并加入 250 μL 以适当浓度稀释在 PB：1x PBS （1：10） 溶液中的一抗。要制备 10 mL PB：1x PBS （1：10） 溶液，请将 1 mL PB 溶液稀释在 9 mL 1x PBS 中。在4°C下温和的水平搅拌（30-50rpm）孵育2-3天。注意：适当的抗体孵育时间对于合适的抗体渗透至关重要，因为3D结构有时会达到大尺寸。 让类器官沉淀，并轻轻去除一抗溶液。每次洗涤在PBS-BSA 0.1%中洗涤5次3分钟，然后在1 mL PBS-BSA 0.1%中洗涤2次，每次洗涤15分钟，轻轻水平搅拌。 在 PB：1x PBS （1：10） 溶液中加入 250 μL 以 1：250 稀释的二抗。在4°C下温和水平搅拌（30-50rpm）孵育24小时。对于此步骤，保护样品免受光照。 加入250μL在PB：1x PBS（1：10）溶液中以1：1000稀释的Hoechst 33342（20μM储备溶液），并在4°C下温和水平搅拌（30-50rpm）再孵育2小时。 让类器官沉淀，并轻轻除去含有二抗+Hoechst 33342的溶液。在 1 mL 的 1x PBS 中洗涤类器官 5 次，每次洗涤 3 分钟，然后在 1 mL 的 1x PBS 中洗涤 2 次，每次洗涤 15 分钟，轻轻搅拌 （30-50 rpm）。注意：广泛清洗样品以避免背景噪音或信号丢失至关重要。 将样品储存在4°C的PBS中，直到图像采集。继续第 2.2 节。注意：协议可以在此处暂停，样品可以在4°C下储存数月，避光。 共聚焦成像的样品制备使用预包被的 1 mL 吸头，小心地将类器官转移到 96 孔黑色聚苯乙烯微孔板中每孔 50 μL 的 1x PBS 中。继续执行步骤 2.2.3 或第 2.3 节。注意：在此阶段，样品可以避光并在4°C下储存数周。 空地注意：清除步骤是可选的，可用于免疫标记类器官或检测内源性荧光。清除可引起3D结构收缩，但除具有大腔的球形单层类器官4外，不会改变一般形态。对于这些囊性类器官，跳过清除步骤，并进行深层组织成像6。通过在磁力搅拌器上混合至少过夜，制备含有 50% v/v 甘油、11% v/v 蒸馏水和 45% w/v 果糖的 2.5 M 甘油-果糖清除溶液，直到溶液完全溶解并均匀。在4°C黑暗中储存长达1个月。 在不接触类器官的情况下尽可能多地去除 1x PBS。取下末端后，使用 1 mL 移液器吸头加入 200 μL 的澄清溶液，并轻轻重悬以防止形成气泡。在室温下孵育至少12小时，然后继续第3节。注意：由于清除溶液是粘性的，因此难以处理少量。为便于处理，请确保溶液处于室温状态，然后缓慢移液。为了获得最佳清除效果，在成像前让样品在澄清溶液中沉淀至少24小时。如果在采集时3D结构是漂浮的，请在室温下以<100× g 进行可选的旋转10分钟，或留出更多时间（一到几天）让它们沉淀。如果方案避光并在4°C（数周）或-20°C（数月）下储存，则可以在此步骤中暂停，然后再进行成像。 图像采集和分析注意：对 3D 结构进行成像需要图像切片技术。使用共聚焦显微镜，并且与空气相比，更喜欢具有更高数值孔径（NA）的浸没物镜。根据3D结构的大小、图像重建（拼接）和用于分析的解决方案选择放大物镜（10x、20x、40x）。 选择采集模式时，请考虑用于定义Z轴堆叠步骤的物镜的焦深;允许最佳 3D 渲染。注意：图像分析解决方案各不相同，需要根据所使用的软件调整分析。例如，该分析协议是在高内涵分析软件上建立的（有关详细信息，请参见 材料表 和 补充图1 ），并提供有关3D重建对象中的对象分割，属性计算和细胞群选择的数据。 3. 3D 细胞培养模型的 2D 切片、染色、成像和分析 注意：3D细胞培养模型的大小各不相同。继续执行第 3.1 或 3.2 节以实现高效的石蜡包埋（图 2）。在进行任何洗涤和试剂更换之前，留出足够的时间进行 3D 结构沉降。小心不要吸出漂浮在管底部的类器官。有关石蜡包埋，请参阅 图 2 以获取指导。 大 （Ø ≥ 400 μm） 3D 细胞培养模型的石蜡包埋在包埋前一天，将两个装有石蜡（石蜡浴）的150 mL烧瓶预热，每个样品一个小的金属包埋模具，并将细镊子预热至65°C。 使用预包被的 1 mL 吸头，小心地将 1x PBS 中的类器官转移到带有聚四氟乙烯内衬瓶盖的平底玻璃管中。让类器官沉淀，小心地去除 1x PBS，并用 70% 乙醇代替。孵育至少30分钟。 让类器官沉淀，并小心地除去70%的乙醇。用 1 mL 即用型伊红 Y 溶液替换。轻弹试管，染色至少30分钟。小心地除去伊红溶液，并在三次连续洗涤中用 1 mL 100% 乙醇脱水类器官，每次 ~30 分钟。注意：乙醇是一种易燃易挥发的液体，会引起严重的眼睛和呼吸道刺激。在通风橱中操作它，并戴上防护眼镜。 小心地除去 100% 乙醇，并在化学罩下，用 1 mL 二甲苯连续洗涤 3 次清除类器官，每次 ~30 分钟。注意：二甲苯是一种有毒的液体易燃物，其蒸气可能会引起刺激。在通风橱中操作它。避免直接接触皮肤，并戴橡胶手套和护目镜。 在化学罩下，通过将一块活检垫（先前浸泡在二甲苯中）放入盒式磁带的一个隔室内来准备白色微孪生组织盒。使用预包被的 2 mL 塑料巴斯德移液器小心地将 3D 结构转移到活检垫上。用另一个浸泡在二甲苯中的活检垫覆盖它们以防止类器官移动，然后关闭盒式磁带。 如果处理了多个样品，请将暗盒放入二甲苯浴中以等待进一步处理。将所有样品转移到盒中后，将盒式磁带置于预热的石蜡浴中，在65°C下30分钟。 将盒式磁带转移到新鲜的预热石蜡浴中过夜。 石蜡浸渍后，取预热的包埋模具，将加热的石蜡加入其中。将包含3D结构的活检垫放入模具中，轻轻搅拌直至所有类器官落到模具底部。使用预热的细镊子非常小心地将3D结构放置在模具的中心。继续第 3.3 节。注意：注意不要用镊子破坏 3D 结构;推，但不要捏它们。 小 （Ø ≤ 400 μm） 3D 细胞培养模型的石蜡包埋在包埋前一天，将两个装有石蜡（石蜡浴）的150 mL烧瓶预热，每个样品一个小的金属包埋模具，并将细镊子预热至65°C。 小心地从类器官悬浮液中取出 1x PBS。在 1 mL 的 1x Tris 缓冲盐水 （TBS） 中轻轻洗涤 3 次。在不接触类器官的情况下尽可能多地去除 1x TBS。注意：小心不要吸出样品。如有必要，在室温下以50 x g 进行5分钟的旋转。 剩余的磷酸盐痕迹会干扰以下步骤，特别是阻止凝胶聚合。因此，在任何处理步骤中都不要使用PBS溶液。对于此步骤，使用包含盒、试剂#1（透明液体）和试剂#2（有色液体）的商业试剂盒来促进石蜡包埋程序，而不会丢失微小片段（参见 材料表）。按照套件说明进行操作。盒式磁带预先组装了已经就位的衬纸和电路板插件。 将 2 滴试剂 #2 加入试管中，轻敲试管轻轻混合。加入 2 滴试剂 #1，再次轻拍混合，使凝胶凝固。使用细镊子，从管中取出凝胶，然后将其放入盒的孔中。 在通风橱下，通过将暗盒置于连续的浴中使样品脱水，如下所示（使用150mL烧瓶，每次浴使用新鲜乙醇或二甲苯）：乙醇70%，30分钟;乙醇96%，30分钟;乙醇100%，洗涤三次，每次30分钟;二甲苯，洗涤三次，每次30分钟。 将盒式磁带置于65°C的预热石蜡浴中30分钟，然后将它们转移到新鲜的预热石蜡浴中过夜。石蜡浸渍后，取预热的包埋模具，加入加热的石蜡。打开凝胶盒，用细镊子小心地取出凝胶，然后将含有3D结构的凝胶放在包埋模具的中心。继续第 3.3 节。 石蜡包埋的常见步骤轻轻地将模具转移到冷区，让石蜡凝固成薄层，这将保持3D结构在适当的位置。在模具顶部添加组织盒，并添加热石蜡以覆盖此塑料盒。完全凝固后取下模具，然后继续第 3.4 节。注意：石蜡块可以在室温下储存多年。 图 2：大型和小型体外 3D 细胞培养模型的石蜡包埋程序概述。（A）石蜡包埋的标准程序。固定和脱水后，用伊红染色3D结构以方便其可视化（左上和左下）。使用 2 mL 巴斯德移液管（中间）小心地将 3D 结构放置在盒中的活检垫（蓝色）上。石蜡浸渍后，使用镊子将3D结构轻轻地放入液体石蜡中，并在活检垫中轻轻搅拌。在此步骤中，小型3D结构会丢失，因为它们无法从焊盘中释放（右下角：嵌入失败）。仅嵌入大型 3D 结构（右上：成功嵌入）。箭头指向 3D 文化。（B）标准石蜡包埋方案的替代方案。在固定小的3D结构后，使用商业试剂盒将细胞保持在凝胶中，并促进它们在石蜡浸渍后转移到模具中（右：成功包埋）。 请点击此处查看此图的大图。 块切片和染色使用标准切片机切割 4 μm 切片，并进行标准的组织学和免疫组织化学技术。继续第 3.5 节。注意：使用特定的滑块（见 材料表）以获得更好的截面附着力。载玻片可以在室温或4°C下储存多年。 图像采集和分析使用数字玻片扫描仪或正置显微镜进行成像，并使用快速数字定量分析平台分析数据，该平台可逐个细胞报告整个3D结构切片的形态学和多重表达数据（详见 补充图2 ）。注意：该组常规使用20倍物镜。