Viene presentato un protocollo di iniezione (agroiniezione) a base di Agrobacterium per l’inoculazione del virus del mosaico a coda di volpe e dei virus del mosaico della canna da zucchero in piantine di mais. L’inoculazione in questo modo porta a infezioni virali, silenziamento genico indotto da virus di geni marcatori e sovraespressione virale di GFP.
Gli approcci di inoculazione basati su Agrobacterium sono ampiamente utilizzati per introdurre vettori virali nei tessuti vegetali. Questo studio descrive un protocollo per l’iniezione di piantine di mais vicino al tessuto meristematico con Agrobacterium che trasporta un vettore virale. Per ottimizzare questo metodo sono stati utilizzati cloni del virus del mosaico a coda di volpe ricombinante (FoMV) progettati per il silenziamento genico e l’espressione genica è stato utilizzato per includere un virus del mosaico della canna da zucchero ricombinante (SCMV) progettato per l’espressione genica. Frammenti di geni o sequenze codificanti di interesse sono inseriti in un genoma virale infettivo modificato che è stato clonato nel vettore binario del plasmide T-DNA pCAMBIA1380. I costrutti plasmidici risultanti vengono trasformati in Agrobacterium tumefaciens ceppo GV3101. Piantine di mais di 4 giorni possono essere iniettate vicino al nodo coleoptilare con batteri risospesi in soluzione di MgSO4. Durante l’infezione da Agrobacterium, il T-DNA che trasporta il genoma virale viene trasferito alle cellule di mais, consentendo la trascrizione del genoma dell’RNA virale. Mentre il virus ricombinante si replica e si diffonde sistemicamente in tutta la pianta, si possono osservare sintomi virali e cambiamenti fenotipici derivanti dal silenziamento dei geni bersaglio lesione mimica 22 (les22) o fitoene desaturasi (pds) sulle foglie, o l’espressione della proteina fluorescente verde (GFP) può essere rilevata all’illuminazione con luce UV o microscopia a fluorescenza. Per rilevare il virus e valutare contemporaneamente l’integrità dell’inserto, l’RNA viene estratto dalle foglie della pianta iniettata e la RT-PCR viene condotta utilizzando primer che fiancheggiano il sito di clonazione multipla (MCS) che trasporta la sequenza inserita. Questo protocollo è stato utilizzato efficacemente in diversi genotipi di mais e può essere facilmente esteso ad altri vettori virali, offrendo così uno strumento accessibile per l’introduzione di vettori virali nel mais.
Cloni infettivi di molti virus vegetali sono stati progettati per il silenziamento genico indotto da virus (VIGS), la sovraespressione genica (VOX) e, più recentemente, l’editing genetico abilitato dal virus (VEdGE)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Man mano che vengono sviluppati nuovi costrutti virali, devono essere considerati anche metodi per infettare con successo i tessuti vegetali con questi virus modificati. I metodi attuali per lanciare infezioni virali nelle piante includono il bombardamento di particelle, l’inoculazione di trascritti di RNA in vitro o cloni di DNA, l’inoculazione della puntura vascolare o l’inoculazione di Agrobacterium tumefaciens (agroinoculazione)5,12,13,14,15,16,17 . Ognuno di questi metodi di inoculazione presenta vantaggi e svantaggi intrinseci, che includono costi, necessità di attrezzature specializzate e fattibilità all’interno di un determinato sistema di virus vegetale. I metodi che utilizzano l’infiltrazione o l’iniezione di ceppi di Agrobacterium contenenti costrutti binari di T-DNA progettati per fornire virus ricombinanti sono preferiti, perché sono semplici e poco costosi. Tuttavia, mancano metodi di agroinoculazione dettagliati per specie monocotiledoni come Zea mays (mais).
Uno dei primi rapporti sull’agroinoculazione per la consegna del virus è stato pubblicato nel 1986, quando il genoma del virus del mosaico del cavolfiore (CaMV) è stato inserito in un costrutto T-DNA e l’Agrobacterium risultante che trasportava questo costrutto è stato inoculato sulle piante di rapa18. Da allora sono stati sviluppati ulteriori metodi per l’agroinoculazione. Ad esempio, nel caso del virus del mosaico a coda di volpe (FoMV), Nicotiana benthamiana può essere utilizzato come ospite intermedio per generare particelle virali nelle foglie che forniscono una fonte di inoculo6. L’inoculazione di mais utilizzando foglie di N. benthamiana infette è efficiente, rapida e semplice, ma l’uso di un ospite intermedio non funziona per tutti i virus che infettano il mais. Il virus del mosaico della canna da zucchero (SCMV), ad esempio, non può infettare N. benthamiana, richiedendo l’uso di fonti alternative di inoculo per i vettori derivati da questo virus. Nel 1988, Agrobacterium contenente il virus della striscia di mais (MSV), un virus del DNA, è stato introdotto nelle piantine di mais per iniezione (agroiniezione), dimostrando che i metodi di inoculazione a base di Agrobacterium sono utili anche per le monocotiledoni19. Nonostante questo successo iniziale con l’agroiniezione, sono stati pubblicati pochi studi che utilizzano questa tecnica nel mais, lasciando aperte domande sull’applicabilità di questo metodo per i virus a RNA e i vettori VIGS, VOX e VEdGE20,21,22. Tuttavia, l’ampio uso dell’agroiniezione nelle specie monocot è promettente, perché questo approccio generale è stato utilizzato in orchidea, riso e grano23,24,25,26,27,28.
Questo protocollo è stato ottimizzato per FoMV e Agrobacterium ceppo GV3101 ed è stato applicato anche a un vettore SCMV. FoMV è un potexvirus con una vasta gamma di ospiti che comprende 56 specie monocot e dicot29. FoMV ha un senso positivo di 6,2 kilobase (kb), genoma di RNA a singolo filamento che codifica cinque diverse proteine da cinque frame di lettura aperti (ORF)30,31,32,33,34,35. FoMV è stato precedentemente sviluppato in un vettore VIGS e VOX per il mais incorporando un clone infettivo su una spina dorsale plasmidica T-DNA6,36,37. Il genoma virale è stato modificato per applicazioni VIGS aggiungendo un sito di clonazione (MCS1*) immediatamente a valle della proteina del mantello (CP) (Figura 1A)36. Per le applicazioni VOX e VEdGE, il promotore CP è stato duplicato ed è stato aggiunto un secondo sito di clonazione (MCS2) per consentire l’inserimento di sequenze di interesse tra ORF 4 e CP (Figura 1B)6. Il vettore FoMV contenente sia MCS1 che MCS2 senza inserti è il vettore vuoto FoMV (FoMV-EV) (Figura 1).
SCMV è un virus non correlato che è stato sviluppato per VOX nel mais38. È un membro della famiglia Potyviridae, di cui diversi membri sono stati progettati per esprimere proteine estranee in planta39,40,41,42,43,44. La gamma ospite di SCMV comprende mais, sorgo e canna da zucchero45,46, rendendolo prezioso per gli studi funzionali genici in queste principali piante coltivate36,38. SCMV ha un senso positivo, genoma di RNA a singolo filamento di circa 10 kb di lunghezza47,48. Per creare il vettore SCMV VOX, la ben consolidata giunzione P1/HCPro è stata utilizzata come sito di inserimento per sequenze eterologhe38. Questo sito di clonazione è seguito dalla sequenza che codifica un sito di scissione della proteasi NIa-Pro, che porta alla produzione di proteine indipendenti dalla poliproteina SCMV (Figura 1C).
I plasmidi T-DNA portatori di cDNA infettivo di questi virus ricombinanti sono stati trasformati in Agrobacterium ceppo GV3101. GV3101 è un ceppo di tipo nopalina, che è ben noto per essere in grado di trasferire T-DNA a specie monocotiledoni, tra cui il mais26,28,49. Inoltre, precedenti studi di agroiniezione hanno utilizzato i ceppi C58 o il suo derivato GV3101, così come 19,20,22,27.
Tre geni marcatori sono stati utilizzati nello sviluppo di questo protocollo: due per il silenziamento genico e uno per l’espressione genica. Un frammento di 329 coppie di basi (bp) dalla lesione del gene del mais mimic 22 (les22, GRMZM2G044074) è stato utilizzato per costruire il vettore silenziatore FoMV-LES22. Quando les22 viene silenziato nel mais, piccole macchie rotonde di cellule necrotiche appaiono lungo la vascolarizzazione delle foglie che si espandono e si fondono in vaste aree di tessuto fogliare necrotico50. FoMV-PDS, contenente un frammento di 313 bp dal gene del sorgo fitoene desaturasi (pds, LOC110436156, 96% di identità di sequenza al mais pds, GRMZM2G410515), induce il silenziamento di pds nel mais, con conseguente piccole striature di cellule fotosbiancate lungo la vascolarizzazione delle foglie che si allungano nel tempo51. La sequenza codificante intatta per la proteina fluorescente verde (GFP) è stata utilizzata per dimostrare l’espressione proteica sia per FoMV (FoMV-GFP) che per SCMV (SCMV-GFP). L’espressione della GFP nelle foglie è in genere più rilevabile a 14 giorni dopo l’inoculazione (DPI)6. Sebbene ci siano stati studi precedenti che utilizzano l’agroiniezione di vettori virali nel mais, questi esperimenti hanno solo dimostrato che l’agroiniezione può facilitare l’infezione virale da un clone infettivo nelle piantine di mais e non espandersi a virus ricombinanti progettati per applicazioni VIGS o VOX19,20,21,22. Il protocollo qui presentato si basa su precedenti metodi di agroiniezione, in particolare Grismley et al.19. Nel complesso, questo metodo di agroiniezione è compatibile con i vettori VIGS e VOX, non richiede attrezzature specializzate o ospiti alternativi come fonti di inoculo e riduce il tempo e il costo complessivi necessari per impostare ed eseguire inoculazioni rispetto ad altri metodi comuni che richiedono biolistica o trascrizione in vitro. Questo protocollo faciliterà gli studi di genomica funzionale nel mais con applicazioni che coinvolgono VIGS, VOX e VEdGE.
Agrobacterium è uno strumento essenziale che facilita numerose tecniche di biologia molecolare nella ricerca legata alle piante. Questo studio fornisce un protocollo di agroiniezione per inoculare vettori virali FoMV e SCMV direttamente nei tessuti di mais per applicazioni VIGS e VOX. L’obiettivo principale è quello di aumentare la facilità e l’utilità delle tecnologie basate su virus per la ricerca nelle piante monocotiledoni. Sebbene l’agroinoculazione diretta del mais sia stata segnalata per alcuni virus, gli autori non sono a conoscenza di un protocollo dettagliato e non ci sono esempi di applicazioni VIGS e VOX in questi studi19,22.
È stato riportato, ed è stato confermato durante lo sviluppo di questo protocollo, che la posizione di iniezione è un fattore chiave per lanciare con successo un’infezione virale sistemica tramite agroiniezione19. Si presume che l’iniezione coerente della posizione raccomandata sulla pianta sia la variabile più grande, perché la posizione esatta del meristema nelle piantine di mais è praticamente non rilevabile a occhio. Per ridurre al minimo la variazione interpersonale, si consiglia di sezionare alcune piantine di mais fino al meristema per visualizzarne meglio la posizione (Figura 3C). La posizione del meristema in relazione al nodo coleoptilare dovrebbe essere all’incirca la stessa per le piante di età compresa tra 4 e 7 giorni. Inoltre, praticare l’iniezione con un liquido tinto fornisce una dimostrazione facilmente visibile di come l'”inoculo” riempie la spirale fogliare e, poiché il sito di iniezione è contrassegnato con colorante, l’accuratezza del sito di iniezione può essere confermata (Figura 3G, H). I tessuti meristematici sono i più suscettibili all’agroiniezione, ma l’iniezione di sospensioni di Agrobacterium direttamente in questo tessuto provoca effetti morfologici indesiderati (Figura 6)19. Le piante con meristemi danneggiati sopravvivono, ma i difetti risultanti sono indesiderabili e, quindi, l’iniezione diretta di questo tessuto dovrebbe essere evitata.
Ci sono diverse variabili che possono influire sul successo del lancio di un’infezione virale sistemica tramite agroiniezione perché tre sistemi biologici complessi (pianta, virus e ceppo Agrobacterium) devono interagire in coordinamento. Questa complessa interazione può essere aiutata dalle cellule in rapida divisione della regione meristematica, rendendola un luogo ideale per l’agroinoculazione19. Il ceppo Agrobacterium deve essere in grado di infettare le cellule dei tessuti vegetali per fornire il T-DNA che trasporta il genoma virale e la pianta deve essere suscettibile al virus per avviare la replicazione virale e l’infezione sistemica. I genotipi del mais differiscono nella loro suscettibilità ai virus (ad esempio, Mo17 è resistente ai ceppi di FoMV) o Agrobacterium, ma la maggior parte di quelli testati sembra essere suscettibile sia a FoMV che a SCMV (Tabella 1 e Tabella 2)53. Ad esempio, la linea inbred FR1064 e la varietà di mais dolce Golden Bantam possono essere particolarmente sensibili sia a GV3101 Agrobacterium che a vettori basati su FoMV.
Il numero di foglie campionate e la tempistica del campionamento per la RT-PCR sono fondamentali per una valutazione accurata dell’infezione virale. Negli esempi mostrati qui, il numero di foglie è stato determinato partendo dalla prima foglia arrotondata (comunemente nota come “foglia del pollice”) e contando verso l’alto. Le foglie sono state campionate una volta che sono state espanse e la foglia successiva ha iniziato a emergere. Tuttavia, quali foglie sono ottimali per il campionamento potrebbero variare in base alle specie di virus utilizzate, alle condizioni di crescita e al genotipo del mais. Pertanto, si consiglia un esperimento iniziale di corso temporale quando si applica questo protocollo a un nuovo sistema di virus per ottimizzare la strategia di campionamento rispetto alle foglie e ai tempi.
Il costrutto specifico utilizzato influisce in modo significativo sull’efficienza di questo protocollo. Ad esempio, i vettori vuoti, FoMV-EV e SCMV-EV, e FoMV-PDS e FoMV-LES22, che contengono entrambi piccoli inserti (rispettivamente 313 bp e 329 bp), in genere producono le percentuali più alte di piante con sintomi virali in questi esperimenti (Tabelle 1 e Tabella 2). Tuttavia, i virus ricombinanti che trasportavano inserti più grandi del GFP ORF (720 bp) in FoMV-GFP e SCMV-GFP, avevano tassi di infezione molto più bassi rispetto alle piante iniettate con il vettore vuoto o i costrutti di silenziamento genico. Questa tendenza può essere dovuta agli impatti negativi sulla forma virale causati da quantità crescenti di materiale genetico esogeno nel genoma virale. Diversi studi hanno dimostrato che la stabilità dell’inserto dei vettori virali delle piante dipende in gran parte dalle dimensioni e dalla sequenza dell’inserto36,54,55,56,57. Inoltre, c’è stata una notevole differenza nella percentuale di piante che si infettano dopo l’inoculazione con il vettore vuoto FoMV o SCMV, suggerendo che è necessario un ulteriore lavoro per ottimizzare questo protocollo per SCMV (Tabella 1). Questi risultati indicano che potrebbe essere necessaria una certa risoluzione dei problemi durante lo sviluppo di un costrutto, perché la sequenza e la lunghezza del frammento possono entrambi influire sull’efficienza.
Nel complesso, questo studio ha dimostrato che l’agroiniezione di piantine di mais è un metodo di inoculazione efficace per due diversi virus vegetali a RNA, configurazioni vettoriali multiple e 11 genotipi di mais. Questo lavoro con FoMV e SCMV, abbinato a lavori precedenti che utilizzano l’iniezione con virus clorotico della chiazza di mais (MCMV) o MSV, indica che l’agroiniezione è adatta per inoculare piantine di mais con cloni infettivi di virus sia a RNA che a DNA19,20,21,22. Inoltre, questo lavoro mostra ulteriormente che l’agroiniezione è un metodo praticabile per i vettori VIGS e VOX e può essere applicato a piante di quattro giorni (Tabella 3). Il protocollo qui presentato dovrebbe essere prontamente adattato dai biologi del mais per facilitare la ricerca negli studi di genomica funzionale che coinvolgono il silenziamento genico transitorio (VIGS) e la sovraespressione (VOX). L’agroiniezione ha anche la capacità di facilitare gli approcci di modifica genetica basati su virus (VEdGE) che altrimenti sarebbero limitati dalla dipendenza dalla trasformazione delle piante, migliorando potenzialmente l’efficienza di editing e l’accessibilità58,59,60. Dato che il ceppo di Agrobacterium appropriato, i genotipi di mais e i vettori virali sono accuratamente combinati, l’inoculazione mediante agroiniezione dovrebbe diventare uno strumento prezioso per le analisi transitorie della funzione genica nel mais.
The authors have nothing to disclose.
La Iowa State University fa parte di un team che supporta il programma Insect Allies della DARPA HR0011-17-2-0053. Questo lavoro è stato supportato anche dall’Iowa State University Plant Sciences Institute, dall’Iowa State University Crop Bioengineering Center, dal progetto USDA NIFA Hatch numero 3808 e dai fondi dello Stato dell’Iowa. K.L.H. è stato anche parzialmente supportato dal programma di formazione universitaria Iowa State University Predictive Plant Phenomics finanziato dalla National Science Foundation (DGE # 1545453) e dalla sovvenzione Agricultural and Food Research Initiative n. 2019-07318 dell’USDA National Institute of Food and Agriculture. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio e della raccolta, analisi e interpretazione dei dati e nella scrittura del manoscritto. Eventuali opinioni, risultati e conclusioni o raccomandazioni espresse in questo materiale sono quelle degli autori e non riflettono necessariamente le opinioni dei finanziatori.
Ringraziamo Nick Lauter (USDA-ARS, Ames, IA) per le sementi di linee inbred di mais, Christian F. Montes-Serey (Iowa State University) per aver realizzato il clone FoMV-GFP e Tyler Austin (Iowa State University) per l’assistenza tecnica.
1 mL syringes | Fisher Scientific | 14955450 | alternatively, BD 309659 |
15 mL Falcon Tubes | Corning Science | 352059 | |
1kb+ Ladder | ThermoFisher Scientific | 10787018 | For assessing sizes of PCR products |
25G x 5/8" PrecisionGlide Needles | Becton, Dickinson and Company (BD) | 305122 | |
28°C Incubator | For Agrobacterium | ||
37°C Incubator | For E. coli | ||
Acetosyringone | MilliporeSigma | D134406 | Optional |
Agar | MilliporeSigma | A4800 | |
Agarose | GeneMate | E-3120 | For making gels to check for virus/insert stability |
Agrobacterium tumefaciens Strain GV3101 | Carries vir plasmid encoding T-DNA transfer machinery, RifR, GmR, from lab stock | ||
Bsu36I | New England Biolabs | R0524 | |
cDNA Kit | ThermoFisher Scientific | K1672 | Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit with Dnase |
Chloroform | Fisher Scientific | C298 | For RNA extraction |
Cuvettes | Fisher Scientific | 14955127 | 1.5 mL |
D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7528 | Alkaline Lysis |
DH5alpha Competent E. coli Cells | New England Biolabs | C2987 | |
DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | K1422 | Rapid DNA Ligation Kit |
EDTA (Ethylenediamine Tetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate) | Fisher Scientific | S311 | Alkaline Lysis |
Ethanol | For RNA extraction | ||
Fertilizer | Peters Fertilizer 15-15-15 Concentrate | ||
Flat Inserts | T.O. Plastics | 715357C | For germinating seeds in trays |
Flats | T.O. Plastics | 710245C | For germinating seeds in trays |
FluorCam | Photon Systems Instruments | To assess maize plants for GFP expression before microscope | |
Fluorescence Microscope | |||
Gel Electrophoresis Box | |||
Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918 | |
Glacial Acetate | Fisher Scientific | A38 | Alkaline Lysis |
Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | For saving frozen stocks of bacteria |
Go-Taq, 2X | Promega | M7123 | |
Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144 | for pHing solutions |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | For RNA extraction |
Kanamycin, Monosulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
Large Pots | Kordlok | SQL0550 | 5x5x4" or bigger. For transplanting seedlings. |
Luria Bertani (LB) Broth, Miller | Himedia | M1245 | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Amresco | 662 | |
Maize Golden Bantam Sweet Corn Seed | American Meadows, West Coast Seeds | ||
Maize Inbred Seed | Our seed comes from our institution, but we are not able to provide this for other researchers. | ||
Maxima H Minus Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | EP0753 | |
MilliQ | Elga | Purelab Ultra | |
Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | New England Biolabs | T1030 | |
PacI | New England Biolabs | R0547 | |
Peters Excel 15-5-15 Fertilizer | ICL Specialty Fertilizers | G99140 | |
Petri Dish, 95 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875714G | |
pH Meter | |||
Potassium Acetate | Fisher Scientific | P171 | Alkaline Lysis |
Primers | Our primers were synthesized through our institutional DNA facility or through IDT | ||
PspOMI | New England Biolabs | R0653 | |
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0491 | |
Rifampicin | EMD Millipore Corp | 557303 | |
Rnase A | ThermoFisher Scientific | 12091021 | Alkaline Lysis |
SbfI | New England Biolabs | R0642 | |
Scale | For weighing chemicals for media or buffers | ||
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Fisher Scientific | BP166 | Alkaline Lysis |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318 | Alkaline Lysis |
Soil Substrate | SunGro Horticulture | SS#1-F1P | Sunshine Mix #1/Fafard-1P, any soil mix that maize grows well in is sufficient |
Spectrophotometer | For measuring OD600 | ||
Sybr Safe, 10,000X | Invitrogen | S33102 | For making gels to check for virus/insert stability |
Thermocycler | For PCR | ||
Tris Base | Fisher Scientific | BP154 | Alkaline Lysis |
Trizol | Ambion | 15596018 | For RNA extraction |
Weigh Paper | For weighing chemicals for media or buffers | ||
XbaI | New England Biolabs | R0145 |