Kriyojenik Olarak Korunmuş Hücrelerden Kriyo-Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskobik Veri Toplama

NOT: Bu protokol, iletim elektron mikroskopisi (TEM) 3 mm düz altın ızgaralarda yetiştirilen veya biriken hücreleri içeren numunelerle ilgili olup, dalma dondurma veya yüksek basınçlı dondurma ile vitrifiye edilmiş delikli karbon destek filmi ile. Bu protokol, örneklerin cryoSIM’de görüntüleme için ilgi çekici yerleri haritalamak için geleneksel bir epifluoresans ve brightfield mikroskobu kullanılarak zaten görüntülendiğini varsayar. Tüm protokole genel bir bakış için Şekil 1’e bakın. 1. Kriyo aşamasının hazırlanması LN2’denstandart bilimsel kuru kağıt mendillerle kaplı bir huniden geçirerek buzsuz sıvı nitrojen (LN2) hazırlayın.NOT: LN2 yanıklara neden olduğundan, kullanırken kriyo koruyucu eldivenler ve gözlükler de dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipmanları giyin. Bu tür sıvılar oksijeni yerinden edebilir ve hızlı boğulmaya neden olabilir ve uygun şekilde havalandırılan bir alanda ele alınmalıdır. Yüzey tozunu basınçlı hava ile kriyo aşamasından çıkarın. Sıvıyı kullanmadan önce basınçlı hava kabından dışarı atın. Numune yükleme kartuşunun uygun odalı numune tutucusu ile yerinde olduğundan emin olun (önceki bir denemeden numune tutucuda ızgara kalmadığını kontrol edin) (Şekil 2). Kapağı kriyo-aşamanın dış dewar’ından çıkarın ve filtrelenmiş LN2’yi yaklaşık 1/4’ü dolana kadar dökün. Daha fazla dökmeden önce ilk kaynama geçene kadar bekleyin; kabı yaklaşık 2/3rd dolu olarak doldurun. LN2 prizden kaynarken nozüleyi işleyiciden ve sahne/optikten uzağa doğrultarak kapağı dikkatlice değiştirin. LN2 çıkıştan çıkmak durduktan sonra, çıkış borusunu kriyo sahnesindeki sahne dewar’ın üzerine yerleştirin. Sahnenin güç kaynağını takın ve USB kablosunu kriyo aşamasına bağlayın. Isıtmalı numune haznesinin kapağının takılı olduğundan emin olun. Dış dewar’ı sahneye takın.NOT: Çıkış borusu kriyo aşamasındaki sahne dewar üzerine yerlenene kadar harici dewar’ı takmayın. LN2 taşarsa (veya taşmasını önlemek için), USB kablosunu ~10 sn için çekin, dengeye sahip olmasına izin verin ve sensörü yeniden etkinleştirmek için USB kablosunu yeniden bağlayın. LN2 sahne alanına teslim edildikten sonra, LN2’nin numune odasına girmesine izin vermek için kriyo aşamasındaki serbest bırakma düğmesine basın.NOT: LN2 hazneyi doldururken sistemi başıboş bırakmayın. Görüntü almaya başlamadan önce sistemin soğumasını ve dengelenmesine izin vermek için ~30-45 dakika bekleyin. Dış dewar’ı düzenli aralıklarla kontrol edin ve dörtte birinden az doluysa (yaklaşık her saat) filtrelenmiş LN2 ile yüklemeyi deneyin. 2. Örnek saklama kutusunun kriyo aşamasına aktarılması NOT: Numune saklama kutusunu, tutucuyu ve herhangi bir aletin (örneğin, asalar) uçlarını, numune veya numune odasının içindeki herhangi bir nesne gibi soğuk yüzeylere dokunmadan önce soğutmak için filtrelenmiş LN2’nin içine daldırın. Biyolojik numuneleri kullanırken bir laboratuvar önlüğü ve eldiven giyin. Vitrifiye numunelerin kriyo uyumlu bir kapta olduğundan emin olun ve mikroskopla getirin. Örnek haznedeki ışığı açmak için kriyo aşamasındaki ilgili düğmeye basın. Örnek aktarım kasetinin iki plakasını açmak için kaset aracındaki onaltılık anahtarı kullanın. Plakaları iki plaka arasındaki ızgaraya düşecek kadar geniş açın, ancak ızgaranın diğer taraftan düşmesini önlemek için maksimum açık konuma açılmaktan kaçının. Örnek ızgara kutusunu LN2’denkaldırmak için uzun uzun tokmaklar kullanın, çentiğin sahne alanının içindeki depolama konumunun konumuyla hizalandığı yere çevirin ve sahne alanına yerleştirin. Saklama kutusu kapağını doğru numune konumuna açmak için uygun cihazı (örneğin bir tornavida) kullanın. Ters tokmaklar (veya herhangi bir ince uçlu cerrahi tokmak) kullanarak, TEM ızgarasını numune tutucudan çıkarın, LN2’niniçine daldırın ve transfer işlemi sırasında LN2’ye yakın tutarak örnek aktarım kasetinde pozisyona bırakın. Karbon film tarafının yerleştirildiklarından emin olun, böylece sonuçta örnek köprüdeki hedefle karşı karşıya kalacaktır. Kaset aracındaki onaltılık anahtarı kullanarak örnek kartuşu kapatın. Kalan örneklerle birlikte depolama kutusunu kapatın ve çıkarın. Izgarayı içeren kartuşu kaldırmak ve örnek köprüye monte etmek için kaset aracındaki mıknatıs noktasını kullanın. Aktarım işlemi sırasında LN2’ye daldırılmış/yakın tutun. Yönlendirmenin köprü için uygun olduğundan emin olun (iki mıknatıs köprüdeki mıknatıslarla temas edecektir). Kaseti köprünün konumlandırma pimleri içine düz yerleştirin ve sabit olduğundan emin olmak için hafifçe itin.NOT: Sonraki odaklanmış iyon ışın frezeleme için hazırlanmış kırpılmış ızgaralar için bir örnek kaset de B24 kiriş hattındaki CryoSIM tesisinde mevcuttur. 3. Sahne yerleştirme ve odaklama Kriyo-sahne kapağı açmasını görüntüleme konumuna getirin ve numune odası ışığını kapatın. Sahneyi optiklere doğru kaydırarak objektif mercek altına hizalayın. Kolu kullanarak hedefi yavaşça pozisyona bırakın, kriyo-sahnenin kapağında kalmasını sağlayın, ancak dokunmayın.NOT: Harici Dewar’ın çıkış borusunun veri toplama sırasında kriyo aşamasındaki sahne alanına dokunmamasını sağlayın. Sahneyi ve optikleri opak siyah bir perde ile örtün. CryoSIM PC’de kontrol yazılımı Cockpit’i başlatın (Şekil 3 ve Şekil 4). Her kamera için okuma modu düğmesine tıklayın ve CONV 3 MHz olarak ayarlayın. Her kameranın sıcaklığının -80 °C olduğundan ve kamera fanının kapalı olduğundan kontrol edin. Yansıyan kamerayı açın. Işıklaraltında, ortam (pozlama 20 ms) seçin ve linkamaltında kondenser’e tıklayın. Video modu düğmesine tıklayın. Mozaik görünüm penceresinde, ızgara anahattını görmek için uzaklaştırın (fare kaydırma). Görülemiyorsa Sahneyi bul’a tıklayın. Dairenin ortasında çift sol tıklatarak ızgarayı ortala. Izgara destek filmi (veya diğer ilgili örnek özellikleri) netleme yapılana kadar, kriyo aşamasını yukarı ve aşağı taşımak için yukarı ve aşağı tuşlarını ve z adımını değiştirmek için sayısal peddeki 9 ve 3 tuşlarını kullanarak (ilk odaklama için 20 μm’ye ayarlayın) numuneyi odakla.NOT: Kullanıcının z’de seyahati biterse, kriyo-sahnenin altındaki tekerlek kullanılarak sahne alanı manuel olarak yukarı veya aşağı hareket ettirilebilir. Her seferinde bir çentik çevirin ve örneğin görüş aralığında olup olmadığını kontrol edin. Odaklama kötüleşirse yönü tekrar değiştirin. 4. Brightfield mozaik alımı Sahne ortalandıktan sonra, video modunukapatın ve görünür bir ışık mozaiği toplayın (merkezden dışa doğru sarmal görünen ışık görüntülerinin karolarını üretmek için Mozaik görünümünde mozaiği çalıştır’a tıklayın). Izgara bükülmüşse, ızgara üzerinde farklı konumlar deneyin (Mozaik görünümündeçift sol tıklama), yeniden odaklanın ve kısmi mozaikleri toplamak için Mozaiği yeniden çalıştır’a tıklayın. Alternatif olarak, mozaiğin üzerine odaklanmış bir görüntü bırakın (Şekil 3). Mozaiği kaydet ‘itıklatarak görünümü kaydedin. Depolama kutusu ve ilgili kılavuz numarası hakkında bilgi içeren kısa bir dosya adı verin (dosya adına otomatik olarak bir zaman damgası eklenir). 5. İlgi alanlarının belirlenmesi Brightfield mozaiğini, hücrelerin veya biyolojik ilgi çekici özelliklerin daha önce bulunduğu yerler için önceki floresan “harita” görüntülerinin yanı sıra inceleyin. Bu alanların uygun floresan üretip üretmeyeceğine bakın. Ortam ışığını ve yoğunlayıcıyı ve etkinse video modunu kapatın. Gerekli heyecan lazerini (405, 488, 561 veya 647) açın ve 50 ms pozlama süresi için başlangıçta 50 mW’da ilgili kamerayı ve filtreyiseçin.NOT: Floresan sinyaline bağlı olarak bu kamera ve filtre ayarlarını artırın/azaltın. Bir görüntüyü tutturmak için 0’a ve otomatik kontrast için * tuşuna basın. Alternatif olarak, görüntünün altındaki kaydırıcıyı kullanarak kontrastı manuel olarak ayarlayın.NOT: Oda için Lazer işaretini açın. Uygun floresan içeren biyolojik olarak ilginç hücreler bulunduktan sonra, Mozaik görünümünde Siteyi işaretle düğmesini kullanarak konumlarını işaretleyin.NOT: Bu işaretli siteler ekli listede görünecektir ve koordinatlara çift tıklayarak erişilebilir. İşaretli bir siteye dönerken, çift tıklatmadan önce alanı yakınlaştırın. Görüntü alımına başlamadan önce tüm potansiyel siteleri işaretlemeye devam edin. Mozaiği işaretli sitelerle yeniden kaydedin; Siteleri dosyaya kaydet ‘itıklatın. StitchM yazılımını kullanarak mozaik görüntüleri birbirine dikmek için (B24 beamline’da dahili olarak geliştirilmiştir), .txt mozaik dosyasını .bat uzantılı StitchM dosyasına sürükleyip bırakın ve mozaik karoların birleşik tiff görüntüsünü aynı klasöre kaydedin. İşaretli sitelerle bir görüntüyü kaydetmek için mozaik.txt dosyasını ve işaretleyicileri.txt dosyasını aynı anda simgeye sürükleyip bırakın.NOT: Veri toplamayı projenin ihtiyaçlarına göre dengeleyin (örneğin, korelatif görüntüleme yapılacaksa, partner görüntüleme yöntemiyle kaç görüntü alınabileceğini kontrol edin ve kriyoSIM görüntüleme için uygun sayıda site seçin). Buna ek olarak, dış savaş LN2 ile yeniden doldurulmasını gerektiriyorsa, kriyo aşaması sistemi konum değiştirir ve işaretli siteler büyük olasılıkla aynı konumlara dönmez; bu nedenle, görüntülenecek site sayısını seçerken bunu göz önünde bulundurun. 6. Veri toplama stratejisi Lazer pozlama süresini floresan görüntüdeki dinamik aralıktaki sayılara göre ayarlayın (kamera görünümleri penceresinin altında). Hangi filtrenin uygulanacağını seçin ve bu ayarları kullanılacak her dalga boyu için optimize edin ve her lazeri ayrı ayrı açın.NOT: 10.000-20.000 sayım en uygun olmasına rağmen, iyi bir kontrast varsa daha düşük sayımlar kabul edilebilir. İdeal olarak, ızgaranın farklı bölgelerindeki hücreler değişken floresan düzeylerine sahip olabileceğinden, her görüntü yığını elde olmadan önce filtre ayarlarını denetleyin. 7. Veri toplama Açmak için her iki kameraya da tıklayın. İşaretli sitelerden birine dönün ve istediğiniz derinliğe tekrar odaklanın. İlgi çekici bir alana odaklandıktan sonra, elde etmek için z yığınının yüksekliğini seçmek için Makro Aşaması’ndaki XY penceresinde odağın dışına çıkın (⭐ tuşu) ve Üstten kaydet ‘itıklatın. Odağın dışına doğru aşağı doğru hareket edin(↓ tuşu), Alta kaydet’e tıklayın ve sonra Merkeze git ‘etıklayın ve görüntünün hala odakta olup olmadığını kontrol edin.NOT: Örnek yüksekliği pencerede gösterilecektir. Kokpit penceresindeki slm’ye (uzamsal ışık modülatörü) sağ tıklayın ve açının 0,41 olarak ayarlı olduğundan emin olun. Kokpit penceresinde, Tek siteli deneme ‘yiseçin.NOT: Slm’yi tıklatma; Kokpit görüntü alımı sırasında otomatik olarak açar. Açılan listeden Yapılandırılmış Aydınlatma ‘yıseçin. Yığın yüksekliğini z yüksekliği + 1 μm’ye eşit olacak şekilde değiştirin.NOT: 1 μm ilavesi, numunenin tamamının z içinde yakalanmasını sağlar ve rekonstrüksiyon eserlerini en aza indirir. Üst sıradaki 405 nm ve 488 nm lazerlerin pozlama sürelerini (ms) ve alt sıradaki 561 nm ve 647 nm lazerlerin pozlama sürelerini (iletilen kamera için) girin.NOT: Pozlama süresi değerleri, daha önce karar verildi ve ana Kokpit penceresinde gösterilen değerlerle eşleşmelidir. Ne tür bir görüntüleme yapıldığına bağlı olarak bir dosya adı (adlandırma kuralı: kutu number_grid area_filters_FL) (FL (floresan) veya BF (brightfield) girin. Önceki dosyaların üzerine yazmadan tarih ve saati içeren yeni bir dosya oluşturmak için Güncelleştir’i tıklatın. Ardından, Başlat’ıtıklatın. Veriler toplanırken Kamera görünümünü kontrol edin. Herhangi bir xy yer değiştirmesi varsa görüntüleri yeniden alın. LN2 dewar görüntü alımı sırasında kriyo aşamasını yeniden doldurursa, Kokpit yazılımındaki İptal düğmesine tıklayarak işlemi iptal edin. Dış savaş aşama dewar doldurmayı tamamladıktan sonra, yeniden doldurma örneği dikey olarak yerinden koyduğundan denemeyi tekrarlayın. Görüntüyü z içinde yeniden ortalamak için yeniden odaklayın ve Tek site denemesiniyineleyin. Gerekli tüm lazer ve filtre kombinasyonları için Tek site denemesini tekrarlayın.NOT: Yeniden doldurmayı bitirmek yaklaşık 30 s-1 dakika sürer. Bir ızgaranın görüntülenmesi sırasında, yeniden doldurma ~4-8x olacaktır. Her konumda, görünür ışığı kullanarak bir z yığını toplayın. Lazerleri kapatın ve Ortam ışığını ve kondenserinikapatın. Tek siteli denemealtında, Z yığınınıseçin, Ortam ışığını 20 ms pozlama olarak ayarlayın ve z yüksekliğini yukarıdaki gibi tutun. Kılavuzda işaretlenmiş tüm siteler için 7.2 ile 7.4 adımlarını yineleyin. Başka bir örneğe geçmeden önce, Döşemeleri sil ‘itıklatarak mozaiği silin. Bunları silmek için tüm döşemelerin etrafına bir kare çizin. Listedeki tümünü seçip seçili siteleri sil ‘i tıklatarak işaretleyicileri de silin. Izgarayı değiştirmeye devam etmeden önce ortam ışığını ve kondenserini kapatın. Aşamayı hedefin altından çıkarmak ve ızgarayı değiştirmek için bölüm 4’teki adımları ters olarak izleyin. 8. Görüntülemeden sonra Görüntüleme tamamlandıktan sonra sahneyi çıkarın ve tüm örnekleri çıkarın. Numune odası ışığını kapatın. Dış dewar’ı çıkarın ve kalan LN2’yi başka bir kriyo uyumlu kaba çıkarın, böylece dewar güvenli bir şekilde normal sıcaklığa geri dönebilir. Kapak fişini kriyo sahnesine takın. Sahne alanında daha fazla LN2 kalmadıktan sonra kriyo-sahne ekranını pişirme seçeneği kullanıma sunulana kadar bekleyin. Isıtma moduna girmek için fırınlama düğmesine basın ve buz oluşumunu önlemek için kriyo aşamasındaki nemi çıkarın. 9. Yeniden Yapılanma Ham SIM veri dosyalarını yeniden yapılandırma için uygun iş istasyonuna aktarın. 0,004’lük tüm kanallar için sabit bir Wiener filtresi ve200 sapma uzaklığı ile kanala özgü optik aktarım işlevlerini (OTFS) (çok floresan boncuk noktası yayılma işlevlerinden hesaplanır) ve K 0 açılarını (0,29278, -1,8028, 2,3786) kullanarak İşleme Görevi oluşturucu penceresinde toplu olarak işlemeyi çalıştırın. Ek seçenekler panelinde, diğer seçenekleri işaretsiz tutarak negatif yoğunlukların atıldığından emin olun. SIR görüntülerini ” işlendi ” adlı bir klasörekaydedin.NOT: Ticari SIM rekonstrüksiyon yazılımı genellikle yeniden yapılandırılmış SIM verileri üretir ve dosya adını korur, ancak sonunda SIR.dv ekler. Yeniden yapılandırma başarısı hakkında işleme protokolünü, adımları ve istatistiksel bilgileri içeren bir günlük dosyası da oluşturulur. 10. Kromatik vardiya düzeltmesi Kromatik değişimi düzeltmek için Chromagnon7 yazılımını indirin. Toplanan verilerin floresan dalga boylarına karşılık gelen kromatik vardiya referans matrisini kullanın (kiriş çizgisi tarafından sağlanır).NOT: Referans dosyası, hizalama parametrelerini içeren ve çok floresan nanopartiküller kullanılarak kalibrasyon görüntülerinden elde edilen bir ‘kromagnon.csv’ dosyasıdır. Aynı anda birden çok veri kümesini toplu olarak işlemek için kullanılabilir. Örneği görüntülemek için kullanılan lazer dalga boyu ve filtreyle eşleşen uygun başvuru dosyasını seçin ve referans alanına ekleyin. Kaynak alana hizalanacak yeniden yapılandırılmış SIR verilerini ekleyin ve Çalıştır’ı tıklatın. Floresan sinyalinin artık görüntülerde hizalanıp hizalanmadığını kontrol edin. Toplu işleme için, hizalanacak tüm SIR görüntülerini kaynak alana ve başvuru dosyasını başvuru alanına yerleştirin ve Tümlerini çalıştır ‘abasın.