Recopilación de datos microscópicos de iluminación crioestructurada de células preservadas criogénicamente

NOTA: Este protocolo se refiere a muestras que contienen células cultivadas o depositadas en rejillas planas de oro planas de 3 mm de microscopía electrónica de transmisión (TEM) con una película de soporte de carbono perforada que han sido vitrificadas por congelación por inmersión o congelación a alta presión. Este protocolo asume que las muestras ya han sido fotografiados utilizando un microscopio convencional de epifluorescencia y campo brillante para mapear ubicaciones de interés para la obtención de imágenes en crioSIM. Consulte la Figura 1 para obtener información general sobre todo el protocolo. 1. Preparación de la crioescenda Prepare nitrógeno líquido sin hielo (LN2)pasando LN2 a través de un embudo forrado con cualquier toallita de papel seco científico estándar.NOTA: Como LN2 causa quemaduras, use el equipo de protección personal adecuado, incluidos guantes y gafas crioprotectores, cuando lo manipule. Tales líquidos pueden desplazar el oxígeno y causar asfixia rápida y deben manipularse en un área adecuadamente ventilada. Retire el polvo de la superficie de la etapa crio-stage con aire presurizado. Expulse el líquido del recipiente de aire presurizado antes de usarlo. Asegúrese de que el cartucho de carga de muestras esté en su lugar con el soporte de muestras con cámara apropiado (verifique que no quede ninguna rejilla en el soporte de muestras de un experimento anterior) (Figura 2). Retire la tapa del dewar externo de la etapa crio-etapa y vierta LN2 filtrado hasta aproximadamente 1/4de lleno. Espere hasta que la ebullición inicial disminuya antes de verter más; llene el recipiente a aproximadamente 2/3de lleno. Reemplace la tapa con cuidado, apuntando la boquilla lejos del manipulador y la etapa / óptica mientras LN2 hierve desde la salida. Una vez que LN2 haya dejado de salir de la salida, coloque la tubería de salida sobre el escenario dewar en el crioescénico. Conecte la fuente de alimentación del escenario y conecte el cable USB al crioescéfalo. Asegúrese de que la tapa de la cámara de muestras calentada esté enchufada. Conecte el dewar externo al escenario.NOTA: No enchufe el dewar externo hasta que el tubo de salida se haya colocado sobre el dewar de etapa en el escenario crioescépico. Si LN2 se desborda (o para evitar que se desborde), extraiga el cable USB durante ~ 10 s, permita que se equilibre y vuelva a conectar el cable USB para reactivar el sensor. Después de que LN2 se haya entregado en el dewar de etapa, presione el botón de liberación en la etapa crio-etapa para permitir que LN2 ingrese a la cámara de muestra.NOTA: No deje el sistema desatendido mientras LN2 está llenando la cámara. Espere ~ 30-45 minutos para permitir que el sistema se enfríe y estabilice antes de comenzar la adquisición de imágenes. Revise periódicamente el dewar externo y rellene con LN2 filtrado si está menos de un cuarto lleno (aproximadamente cada hora). 2. Transferencia de la caja de almacenamiento de muestras a la etapa crio-stage NOTA: Sumerja la caja de almacenamiento de muestras, el soporte y las puntas de cualquier instrumento (por ejemplo, fórceps) dentro del LN2 filtrado para enfriarlos antes de tocar cualquier superficie fría como la muestra o cualquier objeto dentro de la cámara de muestra. Use una bata de laboratorio y guantes cuando manipule muestras biológicas. Asegúrese de que las muestras vitrificadas estén en un recipiente criocompatible y llévalas al microscopio. Pulse el botón correspondiente en el crioescépico para encender la luz de la cámara de muestra. Utilice la llave hexagonales de la herramienta de casete para abrir las dos placas del casete de transferencia de muestras. Abra las placas lo suficientemente anchas como para caer en la rejilla entre las dos placas, pero evite abrirse a la posición de apertura máxima para evitar que la rejilla caiga por el otro lado. Use forrórceps largos para levantar la caja de rejilla de muestra del LN2,gire donde la muesca se alinea con la posición de la posición de almacenamiento dentro del escenario y colóquela en el escenario. Utilice el dispositivo adecuado (por ejemplo, un destornillador) para abrir la tapa de la caja de almacenamiento a la posición correcta de la muestra. Usando fórceps invertidos (o cualquier fórceps quirúrgico de punta fina), retire la rejilla TEM del soporte de la muestra, sumérjala dentro del LN2y colóquela en su posición en el cassette de transferencia de muestras, manteniéndose cerca de la LN2 durante el proceso de transferencia. Asegúrese de que el lado de la película de carbono esté colocado de modo que finalmente se enfrente al objetivo en el puente de muestra. Cierre el cartucho de muestra con la tecla hexagonl de la herramienta de casete. Cierre y retire la caja de almacenamiento junto con las muestras restantes. Utilice el punto magnético de la herramienta de cassette para levantar y montar el cartucho que contiene la rejilla en el puente de muestra. Manténgalo inmerso/cerca del LN2 durante el proceso de transferencia. Asegúrese de que la orientación sea adecuada para el puente (los dos imanes harán contacto con los imanes en el puente). Coloque el cassette plano dentro de los pasadores de posicionamiento del puente y empuje suavemente para asegurarse de que esté fijo.NOTA: Un casete de muestra para rejillas recortadas que se han preparado para el posterior fresado de vigas de iones enfocados también está disponible en las instalaciones de CryoSIM en beamline B24. 3. Acoplamiento y enfoque del escenario Mueva la abertura de la tapa de la etapa crio-etapa a la posición de imagen y apague la luz de la cámara de muestra. Desliza el escenario hacia la óptica para alinearlo bajo la lente del objetivo. Coloque suavemente el objetivo en su posición con la palanca, asegurándose de que descanse dentro de la tapa de la etapa crio-etapa, pero no lo toque.NOTA: Asegúrese de que la tubería de salida externa de Dewar no toque el dewar de etapa en la etapa crio-etapa en ningún momento durante la recopilación de datos. Cubre el escenario y la óptica con una cortina negra opaca. Inicie el software de control Cockpit en el PC crioSIM(Figura 3 y Figura 4). Haga clic en el botón de modo de lectura para cada cámara y configréelo en CONV 3 MHz. Compruebe que la temperatura de cada cámara es de -80 °C y que el ventilador de la cámara está apagado. Encienda la cámara reflejada. En Luces,elija ambiente (exposición 20 ms), y en linkam,haga clic en condensador. Haga clic en el botón Modo de video. En la ventana Vista de mosaico, alejo (desplazamiento del ratón) para ver el contorno de la cuadrícula. Haga clic en Buscar etapa si no se puede ver. Centra la cuadrícula haciendo doble clic izquierdo en el centro del círculo. Enfoque la muestra hasta que la película de soporte de rejilla (o cualquier otra característica de muestra relevante) esté enfocada, usando las teclas arriba y abajo para mover la crioescépda hacia arriba y hacia abajo, y usando las teclas 9 y 3 en el teclado numérico para cambiar el paso z (configúralo a 20 μm para el enfoque inicial).NOTA: Si el usuario se queda sin recorrido en z, la etapa se puede mover manualmente hacia arriba o hacia abajo usando la rueda debajo de la etapa crio- . Gire una muesca a la vez y verifique si la muestra está dentro del rango de visión. Altera la dirección de nuevo si el enfoque empeora. 4. Adquisición de mosaico Brightfield Una vez que el escenario esté centrado, desactive el modo de videoy recoja un mosaico de luz visible (haga clic en Ejecutar mosaico en la vista Mosaico para producir mosaicos de imágenes de luz visible que se espiralicen hacia afuera desde el centro). Si la cuadrícula está doblada, pruebe diferentes posiciones en la cuadrícula (haga doble clic izquierdo en la vista Mosaico),vuelva a enfocar y haga clic en Ejecutar mosaico nuevamente para recopilar mosaicos parciales. Alternativamente, coloque una imagen enfocada en la parte superior del mosaico(Figura 3). Guarde la vista haciendo clic en Guardar mosaico. Así que le dé un nombre de archivo corto que contenga información sobre el cuadro de almacenamiento y el número de cuadrícula respectivo (se anexará automáticamente una marca de tiempo al nombre del archivo). 5. Identificación de áreas de interés Inspeccione el mosaico de campo brillante junto con cualquier imagen de “mapa” de fluorescencia anterior para ver dónde se han ubicado previamente las células o las características biológicas de interés. Compruebe si esas áreas producen fluorescencia adecuada. Apague la luz ambiental y el condensador, así como el modo de video si está activo. Encienda el láser de excitación requerido (405, 488, 561 o 647) y elija la cámara y el filtrocorrespondientes, inicialmente a 50 mW, para un tiempo de exposición de 50 ms.NOTA: Aumente/disminuya estos ajustes de cámara y filtro en función de la señal de fluorescencia. Pulse 0 para ajustar una imagen y * para contrastar automáticamente. Alternativamente, ajuste manualmente el contraste utilizando el control deslizante en la parte inferior de la imagen.NOTA: Encienda el letrero de encendido láser para la habitación. Una vez que se hayan encontrado células biológicamente interesantes con fluorescencia adecuada, marque sus posiciones usando el botón Marcar sitio en la vista Mosaico.NOTA: Estos sitios marcados aparecerán en la lista adjunta y se puede acceder haciendo doble clic en las coordenadas. Cuando regrese a un sitio marcado, haga zoom en el área antes de hacer doble clic. Continúe marcando todos los sitios potenciales antes de comenzar la adquisición de imágenes. Vuelva a guardar el mosaico con los sitios marcados; haga clic en Guardar sitios en archivo. Para unir las imágenes de mosaico utilizando el software StitchM (desarrollado internamente en beamline B24), arrastre y suelte el archivo de mosaico .txt en el archivo StitchM con extensión .bat y guarde la imagen tiff combinada de los mosaicos en la misma carpeta. Para guardar una imagen con los sitios marcados, arrastre y suelte el mosaico.txt archivo y el archivo de marcadores.txt en el icono al mismo tiempo.NOTA: Equilibre la recopilación de datos con las necesidades del proyecto (por ejemplo, si se realizarán imágenes correlativas, verifique cuántas imágenes se pueden tomar con la modalidad de imágenes asociadas y elija el número apropiado de sitios para la imagen crioSIM). Además, si el dewar externo requiere rellenarse con LN2, el sistema de crio-etapa cambiará de posición y es probable que los sitios marcados no regresen a los mismos lugares; por lo tanto, tenga esto en cuenta al elegir el número de sitios que se desea obtener una imagen. 6. Estrategia de recopilación de datos Establezca el tiempo de exposición del láser en función de los recuentos en el rango dinámico en la imagen de fluorescencia (en la parte inferior de la ventana de vistas de la cámara). Elija qué filtro aplicar y optimice estos ajustes para cada longitud de onda de luz de excitación que se utilizará, encendiendo cada láser por separado.NOTA: Aunque los recuentos de 10,000-20,000 son óptimos, los recuentos más bajos son aceptables si hay un buen contraste. Idealmente, verifique la configuración del filtro antes de adquirir cada pila de imágenes porque las celdas en diferentes áreas de la cuadrícula podrían tener niveles de fluorescencia variables. 7. Recopilación de datos Haga clic en ambas cámaras para encenderlas. Regrese a uno de los sitios marcados y concéntrese nuevamente en la profundidad deseada. Una vez enfocado en un área de interés, desenfocarse hacia arriba (↑ tecla) en la ventana XY en la Etapa Macro para elegir la altura de la pila z a adquirir, y haga clic en Guardar arriba. Muévase fuera de foco hacia abajo (tecla ↓ ), haga clic en Guardar abajo y luego en Ir al centro, y verifique que la imagen todavía esté enfocada.NOTA: La altura de la muestra se mostrará en la ventana. Haga clic con el botón derecho en slm (modulador de luz espacial) en la ventana Cockpit y asegúrese de que el ángulo esté establecido en 0.41. En la ventana Cabina, seleccione Experimento de un solo sitio.NOTA: No haga clic en el slm en; La cabina lo encenderá automáticamente durante la adquisición de imágenes. En la lista desplegable, seleccione Iluminación estructurada. Modifique la altura de la pila para que sea igual a la altura z + 1 μm.NOTA: La adición de 1 μm asegura la captura de toda la muestra en z y minimiza los artefactos de reconstrucción. Introduzca los tiempos de exposición (ms) para los láseres de 405 nm y 488 nm en la fila superior (para la cámara reflejada) y los tiempos de exposición para los láseres de 561 nm y 647 nm en la fila inferior (para la cámara transmitida).NOTA: Los valores de tiempo de exposición deben coincidir con los valores decididos anteriormente y mostrados en la ventana principal de cockpit. Ingrese un nombre de archivo (convención de nomenclatura: cuadro number_grid area_filters_FL) (FL (fluorescencia) o BF (campo brillante) dependiendo del tipo de imagen que se esté realizando). Haga clic en Actualizar para producir un nuevo archivo que contenga la fecha y la hora sin sobrescribir los archivos anteriores. Luego, haga clic en Inicio. Compruebe la vista de la cámara mientras se recopilan los datos. Vuelva a tomar las imágenes si hay algún desplazamiento xy. Si el LN2 dewar rellena la etapa crio-stage durante la adquisición de la imagen, aborte el proceso haciendo clic en el botón Abort en el software Cockpit. Una vez que el dewar externo haya terminado de rellenar el dewar de etapa, repita el experimento porque la recarga desplaza la muestra verticalmente. Vuelva a enfocar la imagen para volver a centrarla en z y repita el experimento de sitio único. Repita el experimento de un solo sitio para todas las combinaciones de láseres y filtros necesarios.NOTA: Se tarda aproximadamente 30 s-1 min en terminar de rellenar. Durante la toma de imágenes de una rejilla, el relleno ocurrirá ~ 4-8x. En cada posición, recoge una pila z con luz visible. Apague los láseres y encienda la luz ambiental y el condensador. En Experimento de sitio único,seleccione Pila Z,establezca la luz ambiental en 20 ms de exposición y mantenga la altura z como se indica arriba. Repita los pasos 7.2 a 7.4 para todos los sitios marcados en la cuadrícula. Antes de pasar a otra muestra, elimine el mosaico haciendo clic en Eliminar iconos. Dibuja un cuadrado alrededor de todos los mosaicos para eliminarlos. Elimine los marcadores también seleccionándolos todos en la lista y luego haciendo clic en Eliminar sitios seleccionados. Apague la luz ambiental y el condensador antes de proceder a cambiar la rejilla. Siga los pasos de la sección 4 en orden inverso para desacoplar el escenario de debajo del objetivo y cambiar la cuadrícula. 8. Después de la obtención de imágenes Una vez finalizada la imagen, desacople el escenario y retire todas las muestras. Apague la luz de la cámara de muestra. Desenchufe el dewar externo y decante cualquier LN2 restante en otro recipiente criocompatible, lo que permite que el dewar vuelva de forma segura a una temperatura normal. Coloque el tapón de la tapa en el crioescéfalo. Espere hasta que la opción de hornear la pantalla de la etapa crio-etapa esté disponible después de que no quede más LN2 en la etapa dewar. Presione el botón de horneado para ingresar al modo de calentamiento y elimine la humedad de la etapa crio-stage para evitar la formación de hielo. 9. Reconstrucción Transfiera archivos de datos SIM sin procesar a la estación de trabajo adecuada para la reconstrucción. Ejecute el procesamiento en lotes a través de la ventana del generador de tareas de procesamiento utilizando funciones de transferencia óptica específicas del canal (OTFS) (calculadas a partir de funciones de dispersión de puntos de perlas multiconfesantes) y ángulos K0 (0.29278, -1.8028, 2.3786) con un filtro Wiener constante para todos los canales de 0.004 y un desplazamiento de sesgo de 200. En el panel Opciones adicionales, asegúrese de que se descartan las intensidades negativas manteniendo otras opciones sin marcar. Guarde las imágenes SIR en una carpeta denominada “processed”.NOTA: El software comercial de reconstrucción de SIM generalmente produce datos SIM reconstruidos y conserva el nombre del archivo, pero agrega SIR.dv al final. También se crea un archivo de registro que contiene el protocolo de procesamiento, los pasos y la información estadística sobre el éxito de la reconstrucción. 10. Corrección de desplazamiento cromático Descargue el software Chromagnon7 para corregir el desplazamiento cromático. Utilice la matriz de referencia de desplazamiento cromático que corresponde a las longitudes de onda de fluorescencia de los datos recopilados (proporcionados por la línea de haz).NOTA: El archivo de referencia es un archivo ‘chromagnon.csv’, que contiene los parámetros de alineación y se ha obtenido a partir de imágenes de calibración utilizando nanopartículas multi-fluorescentes. Se puede utilizar para procesar por lotes varios conjuntos de datos a la vez. Elija el archivo de referencia apropiado que coincida con la longitud de onda del láser y el filtro utilizado para obtener imágenes de la muestra, y agréguelo al campo de referencia. Agregue los datos SIR reconstruidos para alinearlos en el campo de origen y haga clic en Ejecutar. Compruebe que la señal de fluorescencia ahora está alineada en las imágenes. Para el procesamiento por lotes, coloque todas las imágenes SIR que se alinean en el campo de origen y el archivo de referencia en el campo de referencia, y presione Ejecutar todo.