Криоструктурированное освещение Микроскопический сбор данных из криогенно сохраненных клеток
Summary
Этот протокол демонстрирует, как получить изображения биологических криоконсервированных образцов с помощью криоструктурированной микроскопии освещения. Мы демонстрируем методологию путем визуализации цитоскелета клеток U2OS.
Abstract
Трехмерная (3D) структурированная микроскопия освещения (SIM) позволяет визуализировать флуоресцентно меченые клеточные структуры с более высоким разрешением, чем обычная флуоресцентная микроскопия. Этот метод сверхвысокого разрешения (SR) позволяет визуализировать молекулярные процессы в целых клетках и может использоваться в сочетании с электронной микроскопией и рентгеновской томографией для корреляции структурной и функциональной информации. Sim-микроскоп для криогенно сохраненных образцов (cryoSIM) недавно был введен в эксплуатацию на коррелятивной криовизующей лучевой линии B24 в синхротроне Великобритании.
Он был разработан специально для 3D-визуализации биологических образцов при криогенных температурах способом, совместимым с последующей визуализацией тех же образцов методами рентгеновской микроскопии, такими как криомягмягкая рентгеновская томография. В этой видеостатье представлены подробные методы и протоколы для успешной визуализации с использованием cryoSIM. В дополнение к инструкциям по эксплуатации микроскопа cryoSIM были включены рекомендации относительно выбора образцов, флуорофоров и настроек параметров. Протокол продемонстрирован в образцах клеток U2OS, чьи митохондрии и тубулин были флуоресцентно помечены.
Introduction
Методы визуализации SR стали широко доступными для биологов за последнее десятилетие1. Они позволяют визуализы с высоким разрешением флуоресцентно помеченных образцов за пределами дифракционного предела. Тем не менее, было сложно адаптировать методы SR-микроскопии для работы с образцами при криогенных температурах2. Это было бы выгодно для коррелятивной визуализации в сочетании с электронной или рентгеновской томографией. Недавно SIM-карта была адаптирована для использования с криогенными образцами и успешно показала, что позволяет проводить корреляционные исследования биологических клеток в сочетании с мягкой рентгеновской томографией (SXT)3 на коррелятивной криовизующей лучевой линии B24 на синхротроне с алмазным источником света (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Biological-Cryo-Imaging/B24.html). SIM-карта может удвоить разрешение обычной широкоугольной микроскопии, освещая образец полосатыми узорами света (муаровые бахромы) под тремя углами и в пять фаз. Интерференция между этими световыми паттернами и флуоресценцией образца может быть использована для вычислительного раскрытия дополнительной информации о субдифракционных структурах4,5.
Существует несколько преимуществ SIM-карты перед другими методами SR для криогенных приложений. Во-первых, он может работать без специально разработанных мигающих флуорофоров; можно использовать обычные флуорофоры, дающие доступ к более широкому спектру потенциальных флуоресцентных меток6. Кроме того, требуется только 15 изображений на z-срез (в 3D; 9 изображений для 2D), тогда как другие методы SR принимают около 1000 изображений на срез, увеличивая вероятность нагрева образца и, следовательно, увеличивая риск образования кристаллов льда, что может вызвать артефакты. Наконец, этот метод может визуалить более толстые биологические образцы более 10 мкм, что позволяет визуалить целые клетки в их почти родном состоянии6. CryoSIM был построен с использованием стандартных оптических компонентов и программного обеспечения открытого доступа для визуализации, что позволяет легко документировать и дублировать при желании6. КриоСИМ имеет объектив с числовой диафрагмой 100x/0.9 (см. Таблицу материалов); Дополнительная информация о его оптических компонентах, конструктивных параметрах и производительности была описана Phillips et al.6 Здесь этот протокол демонстрирует, как использовать микроскоп cryoSIM, включая как загружать и выгружать образцы на криогенной стадии, как собирать данные на микроскопе и как реконструировать изображения SIM-карты.
Protocol
Representative Results
Discussion
3D SIM при криогенных температурах имеет много преимуществ перед другими методами визуализации SR для визуализации остеклованного биологического материала. Это требует значительно меньше изображений на z-срез по сравнению с другими методами SR, что приводит к меньшему облучению и более низкой вероятности образования кристаллов льда для остеклованных образцов. Он также способен визуать целые клетки и может быть коррелирован с рентгеновской томографией, чтобы сопоставить структуру с функцией. Интересно, что большинство коммерчески доступных флуорофоров и флуоресцентных меток отбеливают меньше при криогенных условиях, чем при комнатной температуре. Однако, учитывая высокий квантовый выход наиболее распространенных флуорофоров при комнатной температуре (более 80% в некоторых случаях), абсолютный прирост, обнаруженный в фотонах, обусловлен не изменениями квантового выхода, а снижением сложных процессов отбеливания. Более подробную информацию об урожайности флуорофоров при криогенных температурах можно найти в 8.
Крайне важно, чтобы образцы, поступающие на криоСИМ, были предварительно отображены с использованием обычного криофлуоресцентного микроскопа с возможностью яркого поля для создания «карты» сетки, которая включает в себя выделение всех потенциальных АОИ для дальнейшей визуализации(рисунок 5). Время доступа к cryoSIM распределяется через конкурсный процесс, который включает в себя подачу предложения, которое впоследствии оценивается на осуществимость техники и биомедицинский эффект. Таким образом, время на оборудование всегда «на высоте», а предварительно нанесенные на карту сетки позволяют наиболее эффективно использовать распределение. Также важно, чтобы образец поддерживался остеклованным, особенно во время передачи образца от держателя образца к платформе визуализации, чтобы свести к минимуму образование кристаллов льда и последующее повреждение образца. Образец должен быть хорошего качества, чтобы получить лучшие изображения SIM-карты. Хорошо подготовленный образец будет характеризоваться следующими признаками: а) он не будет загрязнен кристаллами льда, b) используемая сетка будет представлять собой сетку искателя, в) носитель будет плоским, г) сетка сетки и поверхность подложки не будут автофлуоресцентными и е) не будет разрывов в опорной мембране. Эти предпосылки могут быть достигнуты путем тщательного обращения с образцами и обеспечения того, чтобы образцы всегда оставались остеклованными.
Важно заранее проверить, будет ли предлагаемый образец флуорофоров давать достаточный сигнал в микроскопе cryoSIM. Такие инструменты, как SPEKCheck9, могут помочь в выборе оптимальных комбинаций флуорофоров и фильтров. Если есть проблемы со сбором необработанных данных или процессом реконструкции, артефакты могут появиться на изображениях после реконструкции. Примеры различных артефактов были задокументированы Demmerle et al.10 Параметры реконструкции изображения можно просмотреть в файле журнала SoftWoRx, если реконструкция не является оптимальной, открыв файл сводки реконструкции. В данном канале должно быть последовательное расстояние между линиями между углами и относительно постоянная амплитуда. Вариация более 30% и значения значительно выше 1 (если применяется компенсация размера бусины) должны быть более тщательно изучены и, вероятно, будут указывать на неудачные реконструкции. Кроме того, программное обеспечение SIMcheck2 на Фиджи также может использоваться для выполнения различных проверок необработанных и реконструированных данных для диагностики причин ошибок в настройках параметров визуализации или реконструкции. SIM-проверка и ее контрастная карта модуляции также могут помочь в оценке качества реконструированных данных, интерпретируя, какие области изображения могут быть реальными структурами по сравнению с артефактами.
Низкий контраст модуляции (показанный темным цветом на рисунке 5E)в ядерной области означает, что эта область будет более восприимчива к артефактам реконструкции, что подразумевает, что хэш-паттерны, показанные в ядре, могут быть классифицированы(рисунок 5D)как артефакт. Сильные области флуоресцентного сигнала с большей вероятностью точно отражают собственные структуры в обрабатываемых данных. В областях слабого сигнала, где флуорофоры распределены по более широким областям, таким как общая поверхность везикулы, вполне вероятно, что реальный сигнал сосуществует с артефактами обработки, и следует проявлять осторожность при интерпретации этих данных. После проверки полнодиагнальных реконструированных данных, чтобы убедиться, что нет странных артефактов, и что фон, как правило, гауссов и центрирован около нуля, данные обычно обрезаются при нуле, или модальное значение – пик фонового сигнала – должно быть очень близко к нулю. Это гарантирует, что в динамическом диапазоне отображаемого изображения не будут доминировать артефакты отрицательного фона. Когда ожидается более слабый сигнал, следует проявлять особую осторожность при анализе признаков и обеспечении того, чтобы они были реальными структурами, а не артефактами реконструкции.
Существуют некоторые ограничения системы визуализации. Поскольку стадия выборки плоская, образцы с переменной толщиной или сетками, которые не являются плоскими, не являются идеальными объектами для визуализации. Кроме того, если коррелятивная визуализация будет выполнена с использованием мягкой рентгеновской томографии, клетки вблизи границ сетки не должны быть изображены, поскольку они не будут видны в рентгеновском микроскопе во время получения серии наклона. Наконец, количество промокания образца перед погружением замерзания оказывает значительное влияние на качество изображения; слишком малое пятно приводит к слишком толстым образцам, дающим неоптимальные SIM-изображения с высоким фоновым шумом, в то время как слишком большое пятно может привести к деформированию клеток и, следовательно, более восприимчивы к тепловому повреждению от падающего лазерного луча. Таким образом, cryoSIM является мощным инструментом флуоресцентной микроскопии для визуализации биологических образцов в 3D на почти нативной стадии и имеет широкий спектр применения во многих областях.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект получил финансирование от проекта Европейской комиссии Horizon 2020 iNEXT-Discovery. И.M. Добби признает финансирование от Wellcome Trust (107457/Z/15/Z). Эта работа проводилась при поддержке Diamond Light Source, прибора B24 (предложение BI25512). Мы благодарим сотрудников Micron и всех наших превосходных пользователей и сотрудников за помощь в создании cryoSIM и его коррелятивного потенциала.
Materials
| Auto grids | FEI | ||
| Autogrids | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | |
| BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye | Sigma-Aldrich | SCT142 | |
| Cockpit Software | Oxford University | https://github.com/MicronOxford/cockpit | |
| cryo compatible polyurethane container | Jena bioscience | CC-FD-800 | |
| Cryo TEM grid storage box | Thermo Fisher Scientific | Model#AutoGrid | |
| cryo-SIM microscope | Custom made | N/A | Custom made, see following reference for the design: Michael A. Phillips, Maria Harkiolaki, David Miguel Susano Pinto, Richard M. Parton, Ana Palanca, Manuel Garcia-Moreno, Ilias Kounatidis, John W. Sedat, David I. Stuart, Alfredo Castello, Martin J. Booth, Ilan Davis, and Ian M. Dobbie, "CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging," Optica 7, 802-812 (2020). Has a Nikon TU Plan Apo 100x/0.9 NA. |
| Cryostage system | Linkam Scientific Instruments | CMS196 | |
| Fine tip surgical forceps | Ted Pella | 38125 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Python Microscope Software | Oxford University | https://www.python-microscope.org/ | |
| Scientific dry paper wipes | Kimberly-Clark 7551 | 2 | |
| SIM Reconstruction Software | softWoRx, GE Healthcare | Version 6.5.2 | |
| StitchM Software | Diamond Light Source | https://github.com/DiamondLightSource/StitchM | |
| TEM grids for samples | Quantifoil Micro Tools | G200F1 |
References
- Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).
- Ball, G., Demmerle, J., Kaufmann, R., Davis, I., Dobbie, I. M., Schermelleh, L. SIMcheck: A toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5 (1), 15915 (2015).
- Kounatidis, I., et al. 3D Correlative cryo-structured illumination fluorescence and soft X-ray microscopy elucidates reovirus intracellular release pathway. Cell. 182 (2), 515-530 (2020).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Rego, E. H., Shao, L., Rego, E. H. Practical structured illumination microscopy. Methods in Molecular Biology. 1251, 1251 (2015).
- Phillips, M. A., et al. CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging. Optica. 7 (7), 802 (2020).
- Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy. Scientific Reports. 8, 7583 (2018).
- Kaufmann, R., Hagen, C., Grünewald, K. Fluorescence cryo-microscopy: current challenges and prospects. Current Opinion in Chemical Biology. 20, 86-91 (2014).
- Phillips, M. A., Pinto, D. M. S., Dobbie, I. M. SPEKcheck-fluorescence microscopy spectral visualisation and optimisation: a web application, javascript library, and data resource. Wellcome Open Research. 3, 92 (2018).
- Demmerle, J., et al. Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy. Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).
