Coleta de dados microscópicos de iluminação crioesticamente estruturadas de células criogenicamente preservadas

NOTA: Este protocolo diz respeito a amostras contendo células cultivadas ou depositadas em redes de ouro planas de 3 mm de elétrons de transmissão (TEM) com uma película de suporte de carbono furada que foram vitrificadas por congelamento de mergulho ou congelamento de alta pressão. Este protocolo pressupõe que as amostras já foram imagens usando uma epifluorescência convencional e microscópio brightfield para mapear locais de interesse para imagens em crioSIM. Consulte a Figura 1 para uma visão geral de todo o protocolo. 1. Preparação da crio-etapa Prepare nitrogênio líquido sem gelo (LN2) passando LN2 através de um funil forrado com quaisquer lenços de papel seco científico padrão.NOTA: Como a LN2 causa queimaduras, use equipamentos de proteção individual adequados, incluindo luvas e óculos crioprotetos, ao manuseá-lo. Esses líquidos podem deslocar oxigênio e causar sufocamento rápido e devem ser manuseados em uma área devidamente ventilada. Remova o pó superficial do crio-estágio com ar pressurizado. Expulse o líquido do recipiente de ar pressurizado antes de usá-lo. Certifique-se de que o cartucho de carregamento de amostras esteja no lugar com o suporte de amostra em câmara apropriado (verifique se não há grade deixada no suporte da amostra de um experimento anterior)(Figura 2). Retire a tampa da dewar externa do estágio crio-e despeje lN2 filtrada até aproximadamente 1/4de completo. Aguarde até que a ebulição inicial diminua antes de derramar mais; encha o recipiente para cerca de 2/3completo. Substitua a tampa cuidadosamente, apontando o bocal para longe do manipulador e do estágio/óptica enquanto a LN2 ferve para fora da tomada. Uma vez que a LN2 parou de sair da tomada, coloque o tubo de saída sobre o palco de guerra no crio-palco. Conecte a fonte de alimentação do estágio e conecte o cabo USB ao estágio criográfico. Certifique-se de que a tampa da câmara de amostra aquecida está conectada. Ligue a de guerra externa ao palco.NOTA: Não conecte a dewar externa até que o tubo de saída tenha sido posicionado sobre o estágio de guerra no estágio crio-stage. Se a LN2 transbordar (ou para evitar que ela transborda), puxe o cabo USB para ~10 s, permita que ele se equilibre e reconecte o cabo USB para reativar o sensor. Depois que a LN2 for entregue no estágio de guerra, pressione o botão de liberação no crio-palco para permitir que lN2 entre na câmara de amostra.NOTA: Não deixe o sistema sozinho enquanto a LN2 estiver enchendo a câmara. Aguarde ~30-45 min para permitir que o sistema esfrie e estabilize antes de iniciar a aquisição de imagens. Verifique periodicamente o dewar externo e o top-up com LN2 filtrado se estiver com menos de um quarto de cheio (aproximadamente a cada hora). 2. Transferência da caixa de armazenamento de amostras para o estágio criográfico NOTA: Mergulhe a caixa de armazenamento da amostra, o suporte e as pontas de quaisquer instrumentos (por exemplo, fórceps) dentro filtrados da LN2 para esfriá-los antes de tocar em superfícies frias, como a amostra ou quaisquer objetos dentro da câmara de amostra. Use um casaco de laboratório e luvas ao manusear amostras biológicas. Certifique-se de que as amostras vitrificadas estejam em um recipiente compatível com criogeno e leve-as ao microscópio. Pressione o botão correspondente no crio-palco para acender a luz na câmara de amostra. Use a chave hexa, na ferramenta para abrir as duas placas do de transferência de amostra. Abra as placas largas o suficiente para cair na grade entre as duas placas, mas evite abrir para a posição máxima aberta para evitar que a grade caia pelo outro lado. Use fórceps longos para levantar a caixa de grade de amostra para fora da LN2,gire-a onde o entalhe se alinha com a posição da posição de armazenamento dentro do palco e coloque-a no palco. Use o dispositivo apropriado (por exemplo, uma chave de fenda) para abrir a tampa da caixa de armazenamento à posição correta da amostra. Utilizando fórceps invertidos (ou quaisquer fórceps cirúrgicos de ponta fina), remova a grade TEM do suporte da amostra, mergulhe-a dentro da LN2e solte-a em posição no de transferência de amostra, mantendo-a próxima da LN2 durante o processo de transferência. Certifique-se de que o lado do filme de carbono seja colocado para que ele esteja, em última análise, voltado para o objetivo na ponte amostral. Feche o cartucho de amostra usando a tecla hexax na ferramenta. Feche e remova a caixa de armazenamento junto com todas as amostras restantes. Use o ponto de ímã na ferramenta de para levantar e montar o cartucho contendo a grade na ponte de amostra. Mantenha-o imerso/próximo ao LN2 durante o processo de transferência. Certifique-se de que a orientação é apropriada para a ponte (os dois ímãs farão contato com os ímãs na ponte). Coloque o plano dentro dos pinos de posicionamento da ponte e cutuque suavemente para garantir que ele esteja fixo.NOTA: Um de amostra para grades cortadas que foram preparadas para fresagem posterior de feixe de íons focalados também está disponível na instalação CryoSIM na linha de trave B24. 3. Acoplamento e foco do palco Mova a tampa do estágio crioco para a posição de imagem e desligue a luz da câmara de amostra. Deslize o palco em direção à óptica para alinhá-lo sob a lente objetiva. Abaixe suavemente o objetivo na posição usando a alavanca, garantindo que ela repouse dentro da tampa do crio-estágio, mas não a toque.NOTA: Certifique-se de que o tubo de saída externo de Dewar não toque no estágio de guerra no estágio crioque em qualquer momento durante a coleta de dados. Cubra o palco e a óptica com uma cortina preta opaca. Inicie o software de controle Cockpit no CRYOSIM PC (Figura 3 e Figura 4). Clique no botão do modo de leitura para cada câmera e ajuste-a para CONV 3 MHz. Verifique se a temperatura de cada câmera é de -80 °C, e o ventilador da câmera está desligado. Ligue a câmera refletida. Em Lights, escolha ambiente (exposição 20 ms) e em linkam, clique no condensador. Clique no botão modo Vídeo. Na janela de exibição mosaico, amplie (pergaminho do mouse) para ver o contorno da grade. Clique no find stage se ele não puder ser visto. Centralizar a grade clicando duas vezes no meio do círculo. Concentre a amostra até que o filme de suporte à grade (ou qualquer outro recurso de amostra relevante) esteja em foco, usando as teclas para cima e para baixo para mover o crio-palco para cima e para baixo, e usando as teclas 9 e 3 na almofada numérica para alterar o passo z (coloque-o em 20 μm para foco inicial).NOTA: Se o usuário ficar sem viagem em z, o estágio pode ser movido manualmente para cima ou para baixo usando a roda sob o estágio criográfico. Gire-o por um entalhe de cada vez e verifique se a amostra está dentro do intervalo de exibição. Altere a direção novamente se o foco piorar. 4. Aquisição de mosaico brightfield Uma vez que o palco esteja centrado, desligue o modo de vídeoe colete um mosaico de luz visível (clique em Executar mosaico na vista do Mosaico para produzir telhas de imagens de luz visível que espiral para fora do centro). Se a grade estiver dobrada, experimente diferentes posições na grade (clique duplo à esquerda na vista do Mosaico),refoque e clique em Executar mosaico novamente para coletar mosaicos parciais. Alternativamente, drop-in uma imagem focada no topo do mosaico (Figura 3). Salve a exibição clicando em Salvar mosaico. Dê-lhe um nome de arquivo curto contendo informações na caixa de armazenamento e no respectivo número da grade (um boletim de tempos será anexado automaticamente ao nome do arquivo). 5. Identificação de áreas de interesse Inspecione o mosaico brightfield ao lado de qualquer imagen anterior de “mapa” de fluorescência para onde células ou características biológicas de interesse tenham sido previamente localizadas. Verifique se essas áreas produzem fluorescência adequada. Desligue a luz ambiente e o condensador, bem como o modo de vídeo, se estiver ativo. Ligue o laser de excitação necessário (405, 488, 561 ou 647), e escolha a câmera e o filtrocorrespondentes , inicialmente a 50 mW, para tempo de exposição de 50 ms.NOTA: Aumente/diminua essas configurações da câmera e do filtro, dependendo do sinal de fluorescência. Pressione 0 para tirar uma imagem e * para auto-contraste. Alternativamente, ajuste manualmente o contraste usando o controle deslizante na parte inferior da imagem.NOTA: Ligue o sinal laser para a sala. Uma vez que células biologicamente interessantes com fluorescência adequada foram encontradas, marque suas posições usando o botão mark site na vista do Mosaico.NOTA: Esses sites marcados aparecerão na lista fechada e podem ser acessados clicando duas vezes nas coordenadas. Ao retornar a um site marcado, amplie a área antes de clicar duas vezes. Continue marcando todos os sites potenciais antes de iniciar a aquisição de imagens. Ressusar o mosaico com os locais marcados; clique em Salvar sites para arquivar. Para costurar as imagens do mosaico usando o software StitchM (desenvolvido dentro na linha de trave B24), arraste e solte o arquivo de mosaico .txt no arquivo StitchM com .bat de extensão e salve a imagem combinada de tiff das telhas de mosaico na mesma pasta. Para salvar uma imagem com os sites marcados, arraste e solte o arquivo .txt mosaico e os marcadores.txt arquivar no ícone ao mesmo tempo.NOTA: Equilibrar a coleta de dados contra as necessidades do projeto (por exemplo, se a imagem correlativa for feita, verifique quantas imagens podem ser tiradas com a modalidade de imagem de parceiro e escolha o número adequado de locais para imagens crioSIM). Além disso, se o dewar externo exigir reabastecimento com LN2, o sistema crio-estágio mudará de posição e os locais marcados provavelmente não retornarão aos mesmos locais; portanto, considere isso ao escolher o número de sites a serem imagens. 6. Estratégia de coleta de dados Defina o tempo de exposição a laser com base nas contagens no alcance dinâmico da imagem de fluorescência (na parte inferior da janela de visualização da câmera). Escolha qual filtro aplicar e otimize essas configurações para cada comprimento de onda de luz de excitação a ser usada, ligando cada laser separadamente.NOTA: Embora as contagens de 10.000-20.000 sejam ótimas, as contagens mais baixas são aceitáveis se houver um bom contraste. O ideal é verificar as configurações do filtro antes que cada pilha de imagens seja adquirida porque as células em diferentes áreas da grade podem ter níveis variáveis de fluorescência. 7. Coleta de dados Clique em ambas as câmeras para ligá-las. Retorne a um dos locais marcados e foque na profundidade desejada novamente. Uma vez em foco em uma área de interesse, saia do foco para cima(↑ tecla) na janela XY no Estágio Macro para escolher a altura da pilha z para adquirir e clique em Salvar superior. Saia do foco para baixo(tecla ◗ ), clique em Salvar a parte inferior e, em seguida, vá para o centro, e verifique se a imagem ainda está em foco.NOTA: A altura da amostra será mostrada na janela. Clique com o botão direito do mouse no slm (modulador de luz espacial) na janela Cockpit e certifique-se de que o ângulo está definido em 0,41. Na janela Cockpit, selecione experimento de um único local.NOTA: Não clique no slm; O cockpit irá ligá-lo automaticamente durante a aquisição de imagens. Na lista suspensa, selecione Iluminação Estruturada. Altere a altura do Stack de modo que seja igual à altura z + 1 μm.NOTA: A adição de 1 μm garante a captura de toda a amostra em z e minimiza artefatos de reconstrução. Digite os tempos de exposição (ms) para os lasers de 405 nm e 488 nm na linha superior (para a câmera refletida) e os tempos de exposição para os lasers de 561 nm e 647 nm na linha inferior (para a câmera transmitida).NOTA: Os valores para o tempo de exposição devem corresponder aos valores decididos anteriormente e mostrados na janela principal do Cockpit. Insira um nome de arquivo (convenção de nomeação: caixa number_grid area_filters_FL) (FL (fluorescência) ou BF (brightfield) dependendo do tipo de imagem que está sendo feito). Clique em Atualizar para produzir um novo arquivo contendo a data e a hora sem substituir arquivos anteriores. Em seguida, clique em Iniciar. Verifique a visualização da câmera enquanto os dados estão sendo coletados. Re-tirar as imagens se houver algum deslocamento de xy. Se o LN2 dewar reabastecer o estágio criográfico durante a aquisição de imagem, aborte o processo clicando no botão Abortar no software Cockpit. Uma vez que a dewar externa tenha terminado de reabastecer o estágio de guerra, repita o experimento porque a recarga desloca a amostra verticalmente. Refoque a imagem para centralizar novamente em z e repetir o experimento single-site. Repita o experimento de um único local para todas as combinações de lasers e filtros necessários.NOTA: Leva aproximadamente 30 s-1 min para terminar o reabastemento. Durante a imagem de uma grade, o reabastecimento acontecerá ~4-8x. Em cada posição, colete uma pilha z usando luz visível. Desligue os lasers e ligue a luz ambiente e o condensador. Em experimento de um único local,selecione Z-stack,defina a luz ambiente para exposição de 20 ms e mantenha a altura z como acima. Repita as etapas 7.2 a 7.4 para todos os locais marcados na grade. Antes de passar para outra amostra, exclua o mosaico clicando em Excluir telhas. Desenhe um quadrado em torno de todas as telhas para excluí-las. Exclua os marcadores também selecionando todos eles na lista e, em seguida, clicando em Excluir sites selecionados. Desligue a luz ambiente e o condensador antes de continuar a mudar a grade. Siga os passos na seção 4 em ordem inversa para desacorrer a etapa sob o objetivo e alterar a grade. 8. Após a imagem Depois que a imagem estiver terminada, desencaixe o estágio e remova todas as amostras. Desligue a luz da câmara de amostra. Desligue o dewar externo e decante qualquer LN2 restante em outro recipiente compatível com criogeno, permitindo que a dewar retorne com segurança a uma temperatura normal. Coloque a tampa no palco criogeno. Aguarde até que a opção de assar o display crio-palco fique disponível depois que não permanecer mais LN2 no estágio de guerra. Pressione o botão de assa para entrar no modo de aquecimento e remova qualquer umidade do estágio crioque para evitar a formação de gelo. 9. Reconstrução Transfira arquivos de dados SIM brutos para a estação de trabalho apropriada para reconstrução. Executar o processamento em lotes através da janela de construção de tarefas de processamento usando funções de transferência óptica específicas do canal (OTFS) (calculadas a partir de funções de spread de ponto de contas multi-fluorescentes) e ângulos K0 (0,29278, -1.8028, 2,3786) com um filtro Wiener constante para todos os canais de 0,004 e um deslocamento de viés de 200. No painel Opções adicionais, certifique-se de que as intensidades negativas sejam descartadas mantendo outras opções desmarcadas. Salve as imagens SIR em uma pasta chamada “processada”.NOTA: O software comercial de reconstrução do SIM geralmente produz dados SIM reconstruídos e retém o nome do arquivo, mas anexa SIR.dv no final. Também é criado um arquivo de registro que contém o protocolo de processamento, etapas e informações estatísticas sobre o sucesso da reconstrução. 10. Correção de turno cromático Baixe o software Chromagnon7 para corrigir para o turno cromático. Use a matriz de referência de mudança cromática que corresponde aos comprimentos de onda de fluorescência dos dados coletados (fornecidos pela linha de trave).NOTA: O arquivo de referência é um arquivo ‘chromagnon.csv’, que contém os parâmetros de alinhamento e foi obtido a partir de imagens de calibração usando nanopartículas multi-fluorescentes. Ele pode ser usado para processar em lote vários conjuntos de dados ao mesmo tempo. Escolha o arquivo de referência apropriado que corresponda ao comprimento de onda do laser e ao filtro usado para a imagem da amostra e adicione-o ao campo de referência. Adicione os dados SIR reconstruídos a serem alinhados no campo de origem e clique em Executar. Verifique se o sinal de fluorescência está agora alinhado nas imagens. Para processamento em lote, coloque todas as imagens SIR a serem alinhadas no campo de origem e no arquivo de referência no campo de referência e pressione Executar todas.