極低温保存細胞からの微視的データ収集

注:このプロトコルは、透過型電子顕微鏡(TEM)3 mm平らな金格子に成長または堆積した細胞を含むサンプルに関連し、プランジ凍結または高圧凍結によってガラス化された正孔炭素支持フィルムを有する。このプロトコルは、サンプルが既に従来の蛍光と明視野顕微鏡を使用して、cryoSIMでのイメージングに関心のある場所をマッピングすることを前提としています。プロトコル全体の概要については 、図 1 を参照してください。 1. クライオステージの準備 標準的な科学的な乾いた紙のワイプが並ぶ漏斗を通してLN2を渡すことによって氷のない液体窒素(LN2)を準備する。注意:LN2は火傷を引き起こすので、それを扱うときに、凍結保護手袋やゴーグルを含む適切な個人的な保護具を着用してください。このような液体は酸素を変位させ、急速な窒息を引き起こす可能性があり、適切に換気された領域で処理する必要があります。 加圧空気でクライオステージから表面のほこりを取り除きます。液体を使用する前に加圧空気容器から排出します。 サンプルローディングカートリッジが適切なチャンバー付きサンプルホルダーで所定の位置にあることを確認します(以前の実験のサンプルホルダーにグリッドが残っていないか確認してください) (図2)。 クライオステージの外的なデュワーから蓋を取り出し、約1/4番目のフルになるまで濾過したLN2を注ぎます。最初の沸騰が沈静するまで待ってから、より多くを注ぎます。約2/3rdフルに容器を充填します。LN2が出口から沸騰している間に、ハンドラとステージ/光学からノズルを向けて、蓋を慎重に交換してください。 LN2が出口から出て停止したら、出口パイプをクライオステージのステージデュワーの上に置きます。 ステージの電源をプラグインし、USBケーブルをクライオステージに接続します。加熱されたサンプルチャンバーの蓋が差し込まれていることを確認します。ステージに外部のデュワーを差し込みます。注:出口パイプがクライオステージのステージデュワーの上に配置されるまで、外部のデュワーを差し込まないでください。LN2 がオーバーフローする(またはオーバーフローを防ぐために)、USB ケーブルを 10 秒間引き出し、平衡化し、USB ケーブルを再接続してセンサーを再びアクティブにします。 LN2がステージデュワーに送られた後、クライオステージのリリースボタンを押して、LN2がサンプルチャンバーに入るようにします。注:LN2 がチャンバーを満たしている間は、システムを放置しないでください。 画像取得を開始する前に、システムが冷却され、安定するように〜30〜45分待ちます。外部デュワーを定期的にチェックし、フィルタを適用した LN2 を使用してトップアップを行います (約 1 時間ごと) が満杯の場合)。 2. サンプル収納ボックスをクライオステージに移す 注:サンプルの収納ボックス、ホルダ、およびフィルター処理されたLN2 内の任意の機器(例えば、鉗子)の先端を浸して、サンプルやサンプルチャンバー内の任意の物に触れる前にそれらを冷却します。生物学的サンプルを扱う際には、実験室のコートと手袋を着用してください。 ガラス化サンプルが凍結適合容器に入れていることを確認し、顕微鏡に持ち込みます。クライオステージの対応するボタンを押して、サンプルチャンバーのライトをオンにします。 カセットツールの16進数キーを使用して、サンプル転写カセットの2枚のプレートを開きます。プレートを 2 つのプレートの間にグリッドにドロップするのに十分な幅で開きますが、グリッドが反対側に落ちないように最大開いた位置まで開かないようにします。 長い鉗子を使用してサンプルグリッドボックスをLN2から持ち上げ、ノッチがステージ内の保管位置の位置に合わせて回転させ、ステージに配置します。適切なデバイス(ドライバーなど)を使用して、ストレージボックスの蓋を正しいサンプル位置に開きます。 逆鉗子(または任意の細かい先端の外科鉗子)を使用して、サンプルホルダからTEMグリッドを取り外し、それをLN2の内部に浸し、サンプル転写カセットの位置に落とし、転写プロセス中にLN2に近づけます。最終的にサンプルブリッジの目的に向き合うよう、カーボンフィルム側を配置します。 カセットツールの 16 進キーを使用してサンプルカートリッジを閉じます。残りのサンプルと一緒に保管ボックスを閉じて取り外します。 カセットツールのマグネットポイントを使用して、グリッドを含むカートリッジを持ち上げてサンプルブリッジに取り付けます。転送プロセス中は、LN2に浸かるようにしてください。方向がブリッジに適していることを確認します(2つの磁石はブリッジの磁石と接触します)。カセットをブリッジの位置ピンの内側に平らに置き、静かに微調整して固定されていることを確認します。注:その後の焦点を合わせるイオンビームミリング用に用意されたクリッピンググリッド用のサンプルカセットは、ビームラインB24のCryoSIM施設でもご利用いただけます。 3. ステージドッキングとフォーカス クライオステージの蓋開口部をイメージング位置に移動し、サンプルチャンバーのライトをオフにします。段を光学に向かってスライドさせて、対物レンズの下に位置合わせします。レバーを使って、目的をそっと位置に落とし、クライオステージの蓋の中に置きますが、触れないでください。注:外部のデュワーのアウトレットパイプがデータ収集中の任意の時点でクライオステージ上のステージデュワーに触れていないことを確認してください。 不透明な黒いカーテンでステージと光学を覆います。クライオSIM PC上でコントロールソフトウェアコックピットを起動します(図3と図4)。 各カメラの 読み出しモード ボタンをクリックし 、CONV 3 MHzに設定します。各カメラの温度が-80°Cで、カメラファンがオフになっているか確認します。 反射したカメラをオンにします。[ライト] で[アンビエント(露出 20 ms)]を選択し、リンカムの下でコンデンサをクリックします。ビデオモードボタンをクリックします。 [モザイク ビュー ] ウィンドウで、グリッドのアウトラインを表示するには、縮小 (マウススクロール) します。見えない場合は、検索ステージをクリックします。円の中央をダブルクリックしてグリッドを中央に配置します。 グリッドサポートフィルム(または他の関連するサンプル機能)がフォーカスされるまでサンプルをフォーカスし、上下のキーを使用してクライオステージを上下に動かし、数値パッドの9キーと3キーを使用してzステップを変更します(初期焦点を合わせる場合は20μmに設定します)。注:ユーザがzで旅行を使い果たした場合、ステージはクライオステージの下のホイールを使用して手動で上下に移動することができます。一度に1ノッチずつ回し、サンプルが視界の範囲内にあるかどうかを確認します。焦点が悪化した場合は、方向をもう一度変更します。 4. ブライトフィールドモザイクの獲得 ステージを中央に配置したら、ビデオモードをオフにして、可視光モザイクを収集します(モザイクビューの[モザイクの実行] をクリックすると、中心から外側に向かって渦巻く可視光画像のタイルが生成されます)。グリッドが曲がっている場合は、グリッド上の別の位置(モザイクビュー内で左クリック)を試し、再フォーカスし、[モザイクを実行] をもう一度クリックして部分的なモザイクを収集します。あるいは、モザイクの上に焦点を合わせ画像をドロップインします(図3)。 [モザイクを保存] をクリックしてビューを保存します。ストレージボックスの情報とそれぞれのグリッド番号を含む短いファイル名を付けます(タイムスタンプはファイル名に自動的に追加されます)。 5. 関心のある分野の特定 対象となる細胞または生物学的特徴が以前に配置された場所に関する以前の蛍光「マップ」画像と一緒に明視野モザイクを検査します。これらの領域が適切な蛍光を生み出すかどうかを確認してください。 アクティブな場合は 、周囲光 と コンデンサー 、ビデオ モードをオフにします。必要な励起レーザー(405、488、561、または647)をオンにし、50ミリWで最初に50ミリ秒で、対応する カメラ と フィルタを選択します。注:蛍光信号に応じて、カメラとフィルタの設定を増減します。 0を押して画像をスナップし、*を自動コントラストにします。または、画像の下部にあるスライダーを使用して、コントラストを手動で調整します。メモ:部屋の レーザーオン サインのスイッチを入れ。 適切な蛍光を持つ生物学的に興味深い細胞が見つかったら、モザイクビューのサイトをマークボタンを使用して位置をマークします。注: これらのマークされたサイトは、囲まれたリストに表示され、座標をダブルクリックしてアクセスできます。マークされたサイトに戻ったら、ダブルクリックする前にエリアを拡大表示します。 画像取得を開始する前に、すべての候補サイトにマーキングを続けます。マークされたサイトでモザイクを再保存します。[ サイトをファイルに保存 ]をクリックします。 StitchM ソフトウェア(ビームライン B24 で開発された)を使用してモザイク画像を一緒にステッチするには 、.txtモザイク ファイル をStitchM ファイルにドラッグアンドドロップし、.bat拡張子を付けて、モザイクタイルの複合 tiff 画像を同じフォルダに保存します。マークされたサイトと一緒に画像を保存するには、 モザイク.txt ファイルと マーカーを 同時にアイコンにドラッグアンドドロップ.txtファイルをドラッグアンドドロップします。注:プロジェクトのニーズに合わせてデータ収集のバランスを取ります(例えば、相関イメージングが行われる場合は、パートナーイメージングモダリティで撮影できる画像の数を確認し、cryoSIMイメージングに適したサイト数を選択します)。さらに、外部のデュワーが LN2 で補充する必要がある場合、クライオステージ システムの位置が変更され、マークされたサイトが同じ場所に戻らない可能性があります。したがって、イメージ化するサイトの数を選択する際に、この点を考慮してください。 6. データ収集戦略 蛍光画像のダイナミックレンジの数に基づいてレーザー露光時間を設定します(カメラビューウィンドウの下部にあります)。適用するフィルタを選択し、使用する励起光の各波長に対してこれらの設定を最適化し、各レーザーを個別にオンにします。注: 10,000 ~20,000 のカウントが最適ですが、コントラストが良ければ、低いカウントは許容されます。理想的には、グリッドの異なる領域のセルが可変の蛍光レベルを持つことができるので、各画像スタックが取得される前にフィルタ設定をチェックします。 7. データ収集 両方のカメラをクリックしてオンにします。マークされたサイトのいずれかに戻り、もう一度目的の深さに焦点を当てます。対象領域にフォーカスを移動したら、マクロステージのXYウィンドウでフォーカスを上に移動し(↑キー)、取得するzスタックの高さを選択し、上に保存をクリックします。下にフォーカスを外して(↓キー)、下の保存をクリックし、中央に移動し、画像がまだフォーカスされていることを確認します。メモ:サンプルの高さはウィンドウに表示されます。 コックピットウィンドウでslm (空間光変調器) を右クリックし、角度が 0.41 に設定されていることを確認します。[コックピット] ウィンドウで、[単一サイト実験] を選択します。注: slm をクリックしないでください。コックピットは、画像取得中に自動的にオンになります。 ドロップダウン リストから 、[ 構造化照明] を選択します。Z 高さ + 1 μm に等しくなるように、スタックの高さを変更します。注意:1 μmを追加することで、サンプル全体をzでキャプチャし、再構成アーティファクトを最小限に抑えます。 上段の 405 nm および 488 nm レーザーの露光時間 (ms) と下段の 561 nm および 647 nm レーザーの露出時間 (送信カメラの場合) を入力します。注: 露出時間の値は、以前に決定され、 メインのコックピット ウィンドウに表示される値と一致する必要があります。 ファイル名 (命名規則: ボックス number_grid area_filters_FL) (FL (蛍光) または BF (明視野) を入力します(どのタイプのイメージングが行われているかによって異なります)。前のファイルを上書きせずに、日付と時刻を含む新しいファイルを作成するには、[更新]をクリックします。次に、[スタート]をクリックします。 データの収集中にカメラビューを確認します。xy 変位がある場合は、イメージを再撮影します。LN2デュワーがイメージ取得中にクライオステージを補充する場合は、コックピットソフトウェアの中止ボタンをクリックしてプロセスを中止します。 外部のデュワーがステージデュワーの補充を完了したら、詰め替えがサンプルを垂直に置き換えるので、実験を繰り返します。イメージの焦点を合わせ直して z に再センタを設定し、 シングルサイト実験を繰り返します。必要なレーザーとフィルターのすべての組み合わせに対して、 単一サイトの実験 を繰り返します。メモ:補充が完了するまでに約30分から1分かかります。1グリッドのイメージング中に、充填は〜4〜8倍になります。 各位置で、可視光を使用して z スタックを収集します。 レーザーのスイッチを切り、アンビエントライトとコンデンサーをオンにします。[単一サイト実験] で[Z-stack]を選択し、[アンビエント ライト] を 20 ミリ秒の露出に設定し、z 高さを上記のように維持します。 グリッドにマークが付いているすべてのサイトに対して、手順 7.2 ~ 7.4 を繰り返します。 別のサンプルに移動する前に、[タイルを削除] をクリックしてモザイクを 削除します。 それらを削除するすべてのタイルの周りに正方形を描きます。マーカーを削除するには、リストからすべてのマーカーを選択し、[ 選択したサイトを削除]をクリックします。 グリッドの変更に進む前に、周囲光とコンデンサをオフにします。セクション 4 の手順を逆順に実行して、目的の下からステージをドッキング解除し、グリッドを変更します。 8. イメージング後 イメージングが完了したら、ステージをドッキング解除し、すべてのサンプルを取り除きます。サンプルチャンバーライトをオフにします。外部デュワーを抜き、残りのLN2を別の凍結対応容器にデカンでデカン化し、デュワーが正常な温度に安全に戻ることができるようにします。 蓋プラグをクライオステージに置きます。ステージデュワーにLN2が残っていない後、クライオステージディスプレイをベイクアウトするオプションが利用可能になるまで待ちます。ベイクアウトボタンを押して加熱モードに入り、氷の形成を避けるためにクライオステージから水分を取り除きます。 9. 復興 生の SIM データ ファイルを、再構築用の適切なワークステーションに転送します。チャネル固有の光伝達関数(OTFS)(多蛍光ビーズ点広がり関数から計算)とK0角度(0.29278、-1.8028、2.3786)を使用して、処理タスクビルダーウィンドウを使用してバッチ処理を実行し、すべてのチャネルに対して一定のWienerフィルタ0.004とバイアスオフセット200を使用します。 [追加オプション]パネルで、他のオプションをオフにして負の強度が破棄されていることを確認します。SIR イメージを” 処理済み ” という名前のフォルダに保存します。注: 商用 SIM 再構築ソフトウェアは、通常、再構築された SIM データを生成し、ファイル名を保持しますが、最後に SIR.dv を追加します。また、再構築の成功に関する処理プロトコル、ステップ、および統計情報を含むログ ファイルも作成されます。 10. クロマチックシフト補正 クロマチックシフトを補正するには、ソフトウェアクロマニョン7 をダウンロードしてください。 収集されたデータの蛍光波長に対応する色シフト基準行列を使用します(ビームラインによって提供されます)。注:参照ファイルは、アライメントパラメータを含み、マルチ蛍光ナノ粒子を使用したキャリブレーション画像から取得された「クロマニョン.csv」ファイルです。複数のデータセットを一度にバッチ処理するために使用できます。 サンプルの撮像に使用するレーザー波長とフィルタに一致する適切な参照ファイルを選択し、 参照 フィールドに追加します。ソース フィールドに配置する再構築された SIR データを追加し、[ 実行] をクリックします。 蛍光信号が画像に揃っていることを確認します。バッチ処理の場合は、ソース・フィールドに位置合わせするすべての SIR イメージを、参照フィールドに参照ファイルを配置し、「 すべて実行」を押します。